HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地白果藥材中4種萜內(nèi)酯類(lèi)成分

張群群， 李慧芬，2， 張學(xué)蘭，2*， 吳 鵬， 王均秀， 宋夢(mèng)晗， 趙 鑫

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制傳承基地，山東濟(jì)南250355）

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HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地白果藥材中4種萜內(nèi)酯類(lèi)成分

張群群1， 李慧芬1，2， 張學(xué)蘭1，2*， 吳 鵬1， 王均秀1， 宋夢(mèng)晗1， 趙 鑫1

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥炮制傳承基地，山東濟(jì)南250355）

摘要：目的 建立HPLC-ELSD法同時(shí)測(cè)定白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C。方法 白果乙酸乙酯萃取物的分析采用Kromasi1C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1％甲酸水（38∶62）；柱溫30℃，體積流量0.8 mL/min。結(jié)果 白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C分別在1.01～40.40 μg、1.03～41.20 μg、2.37～94.80 μg、1.51～60.40 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r＞0.999 5），平均回收率在97.3％～99.2％之間。5個(gè)不同產(chǎn)地（山東濟(jì)南、臨沂、泰安，廣西桂林和江蘇泰興）白果藥材中四者的含有量分別為75.55～219.73、54.79～135.88、200.37～853.39、119.31～498.06 μg/g。結(jié)論 白果中4種萜內(nèi)酯類(lèi)成分的總含有量以江蘇省泰興市產(chǎn)者為最高。

關(guān)鍵詞：白果；白果內(nèi)酯；銀杏內(nèi)酯A；銀杏內(nèi)酯B；銀杏內(nèi)酯C；產(chǎn)地；HPLC-ELSD

白果為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的干燥成熟種子，其味甘、苦、澀，性平，有毒，具有斂肺定喘、止帶縮尿的功能［1］，含有銀杏酸、萜內(nèi)酯、黃酮等成分［2-3］，其中萜內(nèi)酯類(lèi)化合物有銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯等［4-5］。研究表明，銀杏酚酸類(lèi)成分具有致敏性、細(xì)胞毒性和免疫毒性，為白果的主要毒性成分［6］；白果萜內(nèi)酯是血小板活化因子的拮抗劑，對(duì)心腦血管疾病具有獨(dú)特的藥理作用，廣泛用于治療和預(yù)防心腦血管疾?。?］；白果內(nèi)酯具有提高癡呆小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能和抗卡氏肺孢子蟲(chóng)肺炎作用［8-9］。關(guān)于白果藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，《中國(guó)藥典》2010年版一部?jī)H收載了成品的外觀性狀、粉末的顯微特征及薄層色譜的定性鑒別，缺乏有效成分或指標(biāo)成分的含有量測(cè)定指標(biāo)和參數(shù)，難以控制白果藥材的質(zhì)量。李轉(zhuǎn)梅等［10］建立了白果藥材及炮制品中白果酸和總銀杏酸含有量的測(cè)定方法，羅曼等［11］建立了白果仁萜內(nèi)酯類(lèi)成分的HPLC-ELSD指紋圖譜定性分析方法，但未見(jiàn)對(duì)白果中萜類(lèi)內(nèi)酯成分定量測(cè)定的相關(guān)報(bào)道。目前，銀杏葉及其制劑中該類(lèi)成分的定量測(cè)定方法有HPLC-ELSD、HPLCMS/MS、UPLC-TQ-MS等［12-14］。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-ELSD同時(shí)測(cè)定白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的方法，并測(cè)定了5個(gè)不同產(chǎn)地、批次白果藥材中這些成分的含有量，可為其質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters e2695型HPLC色譜儀、e2424型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；FA1604N型電子天平（十萬(wàn)分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ-250E型醫(yī)用超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B、銀杏內(nèi)酯C對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含有量測(cè)定用，批號(hào)分別為110865-200605、110862-200608、110863-200508、110864-200906）。HPLC用甲醇為色譜純；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

白果藥材的產(chǎn)地分別為山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)、臨沂市、泰安市、廣西省桂林市、江蘇省泰興市，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba L.的成熟種子。除去雜質(zhì)，50℃下烘干，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取白果內(nèi)酯5.05 mg、銀杏內(nèi)酯A 5.15 mg、銀杏內(nèi)酯B 4.74 mg、銀杏內(nèi)酯C 3.02 mg，置于1 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液。分別吸取四種對(duì)照品溶液0.2、0.2、0.5、0.5 mL，置于同一2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL含白果內(nèi)酯0.505 mg、銀杏內(nèi)酯A 0.515 mg、銀杏內(nèi)酯B 1.185 mg、銀杏內(nèi)酯C 0.755 mg的混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱(chēng)取各樣品粉末（過(guò)3號(hào)篩）5 g，分別置于索氏提取器中，加甲醇80 mL，水浴回流提取6 h至無(wú)色，減壓回收甲醇蒸干，殘?jiān)铀?0 mL，70℃水浴溫?zé)崾蛊淙芙?。再往里?％稀鹽酸溶液2滴，乙酸乙酯萃取3次（15、10、10 mL），合并提取液，5％乙酸鈉溶液20 mL洗滌，洗液再用乙酸乙酯10 mL洗滌，合并乙酸乙酯液及洗液，純水洗滌2次，每次20 mL，合并水洗液，10 mL乙酸乙酯洗滌，合并乙酸乙酯液，回收至干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 色譜條件 Kromasi1C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1％甲酸水（38∶62）；柱溫30℃；體積流量0.8 mL/min；蒸發(fā)光檢測(cè)器的漂移管溫度60℃；載氣流量25 L/min。在上述條件下，白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C與其他成分均可達(dá)到基線分離，見(jiàn)圖1。

1.白果內(nèi)酯 2.銀杏內(nèi)酯C 3.銀杏內(nèi)酯A 4.銀杏內(nèi)酯B1.bi1oba1ide 2.ginkgo1ide C 3.ginkgo1ide A 4.ginkgo1ide B圖1　混合對(duì)照品與白果藥材的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of m ixed reference substances and Ginkgo Semen sam ples

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2、10、20、40、80 μL，注入HPLC色譜儀，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰峰面積，以進(jìn)樣量（μg）對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X），峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程。結(jié)果，各成分線性關(guān)系良好，見(jiàn)表1。

表1　4種內(nèi)酯類(lèi)成分的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of four terpene lactones

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)）10 μL，注入HPLC色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的峰面積。結(jié)果，RSD分別為1.5％、1.5％、1.5％和1.8％，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)）適量，室溫下分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的峰面積。結(jié)果，RSD分別為1.6％、1.3％、1.9％、1.8％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取同一產(chǎn)地白果藥材粉末（山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)，過(guò)3號(hào)篩）6份，每份5 g，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，計(jì)算白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的含有量。結(jié)果，四種成分的平均含有量分別為80、57、204、141 μg/g，RSD分別為1.1％、1.9％、1.9％、2.5％，表明該方法重復(fù)性較好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取含有量已知的白果藥材（山東省濟(jì)南市長(zhǎng)清區(qū)，過(guò)3號(hào)篩）6份，每份2.5 g，精密加入白果內(nèi)酯（0.019 51 g/L）、銀杏內(nèi)酯A（0.013 26 g/L）、銀杏內(nèi)酯B （0.050 92 g/L）、銀杏內(nèi)酯C（0.034 51 g/L）對(duì)照品溶液1 mL，甲醇補(bǔ)足至80 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，在“2.3”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.9 樣品測(cè)定 精密吸取混合對(duì)照品和供試品溶液各10 μL，注入HPLC色譜儀進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算樣品中4種內(nèi)酯類(lèi)成分的含有量，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 小結(jié)與討論

白果萜內(nèi)酯類(lèi)成分在紫外末端有吸收，HPLCUV測(cè)定時(shí)靈敏度低，雜質(zhì)干擾大，重復(fù)性差。本實(shí)驗(yàn)首次建立了HPLC-ELSD法同時(shí)定量測(cè)定不同產(chǎn)地白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C的含有量，對(duì)提取溶劑50％、70％、100％甲醇進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)以甲醇為溶劑提取的4種萜內(nèi)酯成分總含有量最高；對(duì)甲醇索式回流6 h和甲醇超聲1 h進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者提取效果較好，而且色譜峰峰形理想，同時(shí)還對(duì)流動(dòng)相等參數(shù)進(jìn)行了考察。綜上所述，該方法簡(jiǎn)便、可靠、有效，可用于白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C成分的測(cè)定，為其質(zhì)量控制提供一定參考。

不同產(chǎn)地、批次白果藥材中白果內(nèi)酯和銀杏內(nèi)酯A、B、C成分的含有量相差較大，四者總含有量最高者是最低者的4倍。因此，建議將這4種成分的含有量限度納入白果藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，以期更全面地控制其質(zhì)量。

由于白果中內(nèi)酯類(lèi)成分的含有量較低，測(cè)定時(shí)取樣量大，而且甲醇提取液中含有較多色素等雜質(zhì)，干擾測(cè)定，對(duì)儀器損害嚴(yán)重，故需作進(jìn)一步純化。本實(shí)驗(yàn)采用乙酸乙酯萃取法，將四種萜內(nèi)酯類(lèi)成分充分轉(zhuǎn)移到乙酸乙酯中，可排除色譜測(cè)定時(shí)雜質(zhì)的干擾，而且它們與其他成分分離度良好。

表2　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Resu lts of recovery tests（n=6）

表3　4種萜內(nèi)酯成分含有量的測(cè)定結(jié)果（μg/g，n=2）Tab.3 Determ ination results of the contents of four terpene lactones（μg/g，n=2）

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Simultaneous determ ination of four terpene lactones in Ginkgo Semen from dif-

ferent grow ing areas by HPLC-ELSD

ZHANG Qun-qun1， LI Hui-fen1，2， ZHANG Xue-1an1，2*， WU Peng1， WANG Jun-xiu1， SONG Meng-han1， ZHAO Xin1
（1.Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 25O355，China；2.Traditional Chinese Medicine Processing Technology Helitage Base，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Jinan 25O355，China）

ABSTRACT：AIM To estab1ish amethod for simu1taneous1y determining the contents of bi1oba1ide and ginkgo1-ide A，B，C in Ginkgo Semen by HPLC-ELSD.METHODS The ana1ysis of Ginkgo Semen ethy1acetate extract was performed on Kromasi1C18co1umn（250 mm×4.6 mm，5 μm），mobi1e phasewasmethano1-0.1％ methanoic acid water（38∶62），co1umn temperature wasmaintained at30℃，and f1ow rate was 0.8 mL/min.RESULTS Bi1oba1ide and ginkgo1ide A，B，C had good 1inear re1ationships in the ranges of 1.01 -40.40 μg，1.03 -41.20 μg，2.37 -94.80 μg and 1.51 -60.40 μg，respective1y（r＞0.999 5）.Their average recoveries were 97.3％ -99.2％.The contents of these four consitituents in Ginkgo Semen from five different growing areas（Jinan，Linyi，Taian in Shandong，Gui1in in Guangxi and Taixing in Jiangsu）were 75.55 -219.73 μg/g，54.79 -135.88 μg/g，200.37 -853.39 μg/g and 119.31 -498.06 μg/g，respective1y.CONCLUSION The tota1 contents of four terpene 1actones in Ginkgo Semen is the highest in Taixing（Jiangsu）.

KEY WORDS：Ginkgo Semen；bi1oba1ide；ginkgo1ide A；ginkgo1ide B；ginkgo1ide C；growing areas；HPLC-ELSD

*通信作者：張學(xué)蘭（1963—），女，教授，從事中藥新藥研發(fā)與中藥炮制原理研究。Te1：（0531）89628081，E-mai1：zhang8832440@sina.com

作者簡(jiǎn)介：張群群（1988—），女，碩士，從事中藥新藥研發(fā)與中藥炮制原理研究。Te1：18753151090，E-mai1：zhangqunqun01@163.com

基金項(xiàng)目：濟(jì)南市高校自主創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（201303027）

收稿日期：2015-07-13

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.030

中圖分類(lèi)號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1528（2016）01-0133-04