氯化鋰在細菌性化膿性角膜炎中的調控*

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·論著·

氯化鋰在細菌性化膿性角膜炎中的調控*

陳康1，2，傅強1，易冰1，羅燕香1，孫世珺1，張秀明1△

(1.中山大學附屬中山醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，廣東中山 528403；2.南方醫(yī)科大學，廣東廣州 510515)

摘要:目的探討氯化鋰(LiCl)在細菌性化膿性角膜炎中發(fā)揮的作用及其調控機制。方法Western-blot檢測LiCl應用的效果后，結膜下注射LiCl觀察疾病進展；實時熒光定量PCR檢測炎性因子的表達；TUNEL和流式細胞術檢測細胞凋亡。結果LiCl延緩角膜炎的疾病進展；隨后實驗發(fā)現(xiàn)LiCl促進抑炎因子分泌抑制促炎因子的分泌；促進角膜浸潤細胞的凋亡。結論LiCl通過調節(jié)炎性因子促進細胞凋亡，抑制角膜炎癥反應，在銅綠假單胞菌角膜炎中發(fā)揮角膜保護作用。

關鍵詞:細菌性角膜炎；炎癥反應；細胞凋亡

細菌性化膿性角膜炎是致角膜盲的主要原因之一[1]。造成細菌性化膿性角膜炎的病原體眾多，其中銅綠假單胞菌引起的化膿性角膜炎占首位[2]。銅綠假單胞菌(PA)是革蘭陰性條件致病菌，當角膜發(fā)生損傷時易于被感染誘發(fā)角膜炎，其致病機制主要是大量炎癥細胞和細胞因子的聚集引起過度炎癥反應導致的角膜免疫病理損傷[3]。因此，如何抑制過度炎癥引起的免疫病理損傷是治療疾病的關鍵。作為一個化學分子，氯化鋰(LiCl)可參與多個生理調節(jié)過程，如糖原的合成、基因的表達、炎癥調節(jié)及細胞凋亡[4]。研究報道LiCl可在內(nèi)毒素誘發(fā)的炎癥[5]、Toll樣受體介導的慢性小腸炎[6]、弗朗西斯氏菌感染[7]中抑制炎癥反應。此外，LiCl可調節(jié)多種細胞的凋亡，如巨噬細胞、神經(jīng)細胞、淋巴細胞、上皮細胞等[8-11]。然而，LiCl在銅綠假單胞菌感染引起的化膿性角膜炎中的作用還未知。研究報道，LiCl作為藥物可治療精神雙向障礙[12]，并在阿爾茨海默氏病[13]、糖尿病[14]中有潛在的治療效果。然而，LiCl可否應用于化膿性角膜炎中還有待證明。本研究發(fā)現(xiàn)，LiCl通過調節(jié)細胞因子分泌和浸潤細胞的凋亡，抑制角膜局部炎癥反應，延緩角膜炎疾病進展，在化膿性角膜炎中發(fā)揮角膜保護作用。

1材料與方法

1.1角膜炎動物模型的建立及臨床炎癥分級用乙醚麻醉小鼠后，在體視顯微鏡40倍放大倍數(shù)下用25 G的針頭在小鼠的左側眼角膜上連續(xù)劃3下，每次劃痕約1 mm。用移液器滴加入5 L的1×106CFU/mL菌量于劃傷角膜，右側眼未經(jīng)任何處理作為正常對照。感染PA的小鼠角膜于1、3和5 d觀察角膜病變情況。根據(jù)已建立的角膜疾病臨床分級評分如下：0級，角膜清澈或輕度渾濁，渾濁范圍部分或完全遮蓋瞳孔；+1級，角膜輕度渾濁，渾濁范圍部分或完全遮蓋眼前段；+2級，角膜渾濁度增高，渾濁范圍部分或完全遮蓋眼前段；+3級，角膜高度渾濁，渾濁范圍完全遮蓋眼前段；+4級，角膜穿孔。感染后5 d，裂隙燈顯微鏡觀察并拍攝細菌感染后小鼠角膜的炎癥狀態(tài)，用臨床評分法確定角膜疾病的嚴重程度。

1.2方法

1.2.1Western-blot結膜下注射LiCl及對照NaCl，收集角膜的蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE后轉膜至硝酸纖維膜上，分別孵育5%脫脂奶粉、磷酸化糖原合酶激酶(P-GSK3)(1∶1 000)的一抗過夜、抗兔二抗1 h。經(jīng)曝光檢測目的蛋白的量。

1.2.2Real-time PCR用TRIzol法提取細胞RNA。1 μg RNA轉錄成cDNA，用SYBR Green進行實時熒光定量PCR擴增。白介素10(IL-10)、白介素6(IL-6)、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和β-actin的引物序列見表 1。

1.2.3TUNEL取LiCl/NaCl處理后的感染及未感染眼球，4%福爾馬林固定，石蠟包埋切片。切片經(jīng)脫蠟脫水后用末端脫氧核苷酰酶試劑盒染斷裂DNA末端以標記凋亡細胞，用核染色劑4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染細胞核，封片后熒光顯微鏡下觀察。

表1　　引物列表

1.2.4流式細胞術取LiCl/NaCl處理后的感染角膜(每組5只)膠原酶消化，篩網(wǎng)濾過收集單細胞懸液。細胞懸液避光孵育含5 L碘化丙啶(PI)的結合緩沖液，流式細胞儀上分析細胞凋亡(PI陽性細胞數(shù)量)。

2結果

2.1結膜下注射LiCl的效果為了研究LiCl在PA角膜炎中的作用，結膜下注射LiCl或NaCl(對照)，Western-blot顯示，PA感染小鼠角膜后，P-GSK3 的表達低于正常角膜(圖1，line2比line1)，結膜下注射LiCl，P-GSK3 的表達水平明顯上調(圖1，line3比line2)。見圖1(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.2LiCl延緩角膜炎疾病進展臨床評分結果顯示，在PA感染后1、3、5 d，LiCl注射組疾病的嚴重程度減輕，1、3、5 d的臨床評分分別為+1、+2、+2/+3，而對照組的臨床評分分別為+2、+3、+4(圖 2A)。裂隙燈照片顯示，LiCl處理組(圖2C)角膜中/重度渾濁遮蓋瞳孔區(qū)；對照組(圖 2B)膜潰瘍穿孔。HE染色結果顯示，相對于LiCl處理組(2E)對照組(圖 2D)角膜重度水腫，角膜增厚，并有大量的炎性細胞的浸潤。臨床表現(xiàn)結果提示LiCl能夠延緩PA角膜炎的疾病進程，在PA角膜炎中發(fā)揮角膜保護作用。見圖2(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.3LiCl調節(jié)炎性因子的分泌炎性細胞浸潤和炎性因子的分泌是引起角膜過度炎癥的關鍵因素。為了全面了解角膜的炎癥反應情況，檢測LiCl和NaCl處理組炎性因子的表達，結果顯示，在PA感染后1、5 d，LiCl促進抑炎因子IL-10的表達(圖3A)，并且抑制促炎因子TNF-α的表達(圖3D)，而對促炎性因子IL-6(圖 3B)和IL-1β(圖3C)無影響。在未感染時，兩組的炎性因子的分泌無差別(圖3，A-D)。見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

2.4LiCl促進角膜浸潤細胞的凋亡炎性細胞的凋亡是控制宿主過度炎癥的一個重要措施。TUNEL檢測發(fā)現(xiàn)，PA感染后5 d，與對照組相比(圖 4B)，LiCl處理組(圖 4D)的角膜基質中有更多TUNEL染色為陽性的細胞(綠色熒光)，且與核染色劑(紫色熒光)共定位，為凋亡細胞(圖 4B和D中的白色箭頭所指細胞)。PA未感染時，LiCl(圖 4C)和NaCl(圖 4A)處理組中均未見TUNEL染色為陽性的細胞，見圖4(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。為了進一步量化LiCl處理后角膜浸潤細胞凋亡的情況，流式檢測結果顯示，PA感染1、5 d后，LiCl促進細胞的凋亡，其PI陽性的凋亡細胞的比例分別為11.3%和20.3%，而對照組凋亡細胞的比例為5.97%和10.6%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。

3討論

LiCl在阿爾茨海默氏病[13]、糖尿病[14]及精神雙向障礙[12]中有潛在的治療作用，然而，LiCl在銅綠假單胞菌角膜炎中的作用還未知。本研究發(fā)現(xiàn)，LiCl通過調節(jié)炎性因子分泌和細胞凋亡，抑制炎癥反應，發(fā)揮角膜保護作用。

據(jù)報道，LiCl在多種疾病中可抑制炎癥反應。Nahman等[5]報道，LiCl通過抑制TNF-α、IL-1β、活性氮自由基在精神雙向障礙中發(fā)揮抑炎作用；Beurel等[15]報道LiCl在內(nèi)毒素休克的動物模型中抑制內(nèi)毒素誘導的IL-6的產(chǎn)生；Wang等[11]報道LiCl通過降低促炎性因子TNF-α和RANTES的表達在內(nèi)毒素血癥誘發(fā)的急性腎衰竭中發(fā)揮保護作用。本研究發(fā)現(xiàn)LiCl通過促進IL-10的表達，抑制TNF-α的表達在化膿性角膜炎中發(fā)揮抑炎作用。同時，組織化學染色結果顯示，LiCl處理組角膜浸潤細胞明顯減少。炎性因子分泌的調節(jié)和炎性細胞浸潤的減少是抑制角膜過度炎癥，延緩疾病進展。

炎性細胞的凋亡也是機體降低炎癥反應的一個策略。研究發(fā)現(xiàn)，在巨噬細胞[8]、神經(jīng)細胞[9]等中，LiCl促進細胞凋亡；而抑制急性T淋巴細胞白血病細胞[10]、腎小管上皮細胞[11]的凋亡。這提示，LiCl調節(jié)凋亡的作用依賴不同的細胞類型和刺激因素。TUNEL和流式細胞術結果均顯示，在銅綠假單胞菌感染時，LiCl促進角膜浸潤炎性細胞的凋亡。

綜上所述，本研究揭示了LiCl在細菌性化膿性角膜炎中的調節(jié)作用，為LiCl的臨床輔助應用提供堅實的理論基礎。

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The regulatory role of LiCl in microbial suppurative keratitis*

ChenKang1,2,FuQiang1,YiBing1,LuoYanxiang1,SunShijun1,ZhangXiuming1△

(1.DivisionofClinicalLaboratory,ZhongshanHospitalofSunYat-senUniversity,Zhongshan,Guangdong528403,China；2.SouthernMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510515,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the role of LiCl in microbial suppurative keratitis.MethodsWestern-blot assay was used to detect the efficacy of LiCl.Inflammatory cytokine levels were examined using Real-time PCR.Cell apoptosis was detected by using TUNEL and flow cytometry assays.ResultsLiCl promoted corneal resistance to PA infection.Real-time PCR data showed that LiCl enhanced IL-10 expression,but suppressed TNF-expression.TUNEL and flow cytometry data showed that LiCl promoted the apoptosis of infiltrating cells.ConclusionLiCl promoted host resistance against microbial suppurative keratitis,via regulating inflammatory cytokine expression and cell apoptosis.

Key words:bacterial keratitis；inflammation；cell apoptosis

(收稿日期：2015-11-10)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.019

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0478-03

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目(81401645)；廣東省醫(yī)學科研基金(B2014447)；中山市科技計劃項目(2014A17C098)。

作者簡介：陳康，女，主管技師，主要從事分子診斷與檢驗研究。△通訊作者，E-mail：zxm0760@163.com。