維吾爾醫(yī)學異常黑膽質體液結腸癌患者腸道菌群的分布情況研究*

?

·論著·

維吾爾醫(yī)學異常黑膽質體液結腸癌患者腸道菌群的分布情況研究*

阿孜爾古麗·阿布都克日木1，阿布都哈巴爾·阿布都克日木2,馬蘭英3，

艾力江·買買提明4，孫玉萍1，陳鋒1，王紅英1，德力夏提·依米提1△

(1．新疆醫(yī)科大學病原生物學教研室，新疆烏魯木齊 830011；2.和田師范?？茖W校理學院生物教研室，

新疆和田 848000;3.新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院消化內科，新疆烏魯木齊 830011;

4.新疆維吾爾醫(yī)學?？茖W校醫(yī)療系內科教研室，新疆和田 848000)

摘要:目的通過先進的分子生物學方法分析維吾爾醫(yī)學異常黑膽質結腸癌患者腸道菌群分布情況及多樣性。方法對結腸癌患者進行維吾爾醫(yī)學體液分型并挑取其中異常黑膽質患者，采集患者糞便樣品，提取細菌總DNA并設計一對通用引物擴增16S rDNA的V6～V8可變區(qū)進行變形梯度凝膠電泳(DGGE)，從DGGE指紋圖譜中比較各個結腸癌患者腸道菌群分布情況。結果通過試驗得到了維吾爾族異常黑膽質結腸癌腸患者腸道菌群結構特征的DNA指紋圖譜，從指紋圖譜上選擇一些特異性條帶切下來回收，測序，測序出來的序列在基因庫進行比對做出進化樹了解菌群之間的親緣性。結論異常黑膽質結腸癌患者腸道菌群基因序列的親緣性結果顯示腸道菌群的多樣性明顯少其中腸道優(yōu)勢菌比例低。

關鍵詞:維吾爾醫(yī)學；異常黑膽質；結腸癌；腸道菌群

維吾爾醫(yī)學理論體系中，異常體液分型是治療疾病的主要因素，在治療疾病的過程中起著非常重要的作用[1-2]，健康人體的體液在結構和功能上處于平衡狀態(tài)，體液異常變化會導致體液失調，進而引發(fā)各種疾病，尤其是異常黑膽質的出現(xiàn)是導致疾病的主要原因之一[3-4]，維吾爾醫(yī)學臨床研究發(fā)現(xiàn)80%以上的腫瘤是由異常黑膽質性體液質產生的，可見異常黑膽質性體液與腫瘤是密切相關的。與其他異常體液質相比，它的致病性、危險性、惡性程度最高，在難治性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中也起主導作用。腸道菌群與人類的健康、疾病狀況息息相關，它不僅能降解食物中不可消化的營養(yǎng)成分，提供宿主維生素等營養(yǎng)物質，還能促進腸上皮細胞的分化與成熟，激活腸道免疫系統(tǒng)以及調節(jié)宿主能量存儲與代謝。正常情況下腸道菌群保持著共生和拮抗關系，從消化、營養(yǎng)吸收、能量供應、脂肪代謝、免疫調節(jié)、藥物代謝和毒性等諸多方面影響人和動物的健康狀況[5-7]。目前越來越多的研究者認識到維吾爾醫(yī)學治療體系結合到腸道微生態(tài)研究的重要意義。

1資料與方法

1.1一般資料在新疆維吾爾自治區(qū)腫瘤醫(yī)院選擇18例結腸癌患者，并按照體液分型診斷標準診斷為異常黑膽質型體液質[8]。異常黑膽質型體液為面色萎白而發(fā)干，唇色淡白而枯燥，舌質淡捫之澀,舌形瘦,舌涎少,舌苔薄白而不潤,大便干結而色淡不臭,小便清而短少。納入標準：(1)年齡18～75歲；(2)維吾爾族；(3)對本研究知情同意者；(4)性別不限；(5)臨床診斷為結腸癌術前患者。排除標準:(1)有腦血管疾病、高血壓、糖尿病、肝臟疾病、傳染??；(2)未化療、放療患者；(3)術后患者;(4)近期(6周內)接受抗菌藥物及微生態(tài)制劑治療者。

1.2儀器與試劑QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒購自Qiagen生物科技有限公司,2×Taq PCR MasterMix；2×Taq PCR MasterMix 購自上海生物科技有限公司；PCR純化試劑盒購自上海生物科技有限公司；丙烯酰胺、去離子甲酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素購自Sigma；四甲基乙二胺(TEMED)購自Promega；SYBR GreenⅠ、100%甘油、2%二甲苯氰、2%溴芬蘭、冰醋酸購自北京百泰克生物科技有限公司。PCR引物委托上海生工生物技術有限公司合成，主要儀器：凝膠成相系統(tǒng)(GelDoc2000型)、紫外可見分光光度計、DCodeTM System(美國Bio-Rad有限公司)。

1.3方法

1.3.1總DNA的提取參照 QIAamp DNA Stool Mini Kit試劑盒說明，提取糞便標本細菌總DNA并測定濃度后稀釋為40 ng/μL，-20 ℃保存為后續(xù)試驗做準備。

1.3.26SrDNA V6-V8區(qū)PCR擴增糞便細菌的V6-V8區(qū)通用引物F968f-GC(5′-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′)和R1401(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′)[9-10]委托上海生工生物公司合成。PCR擴增反應體系(25 μL)：引物各1 μL(10 mmol/L)，DNA模板3 μL，2×PCR TaqMix 12.5 μL，加ddH2O至25 μL。反應程序：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；62.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。在第1輪PCR之后為了減少PCR過程中異源DNA產物影響后續(xù)的DGGE指紋圖譜的質量，將PCR產物稀釋10倍后，將其作為模板再進行第2輪只有5個循環(huán)的修復PCR擴增，用2.0%瓊脂糖凝膠電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.3.3DGGE指紋圖譜分析使用美國Bio-Rad有限公司的DCodeTM System進行變形梯度凝膠電泳，采用濃度為8%聚丙烯酰胺、乙二胺四乙酸(EDTA)、變性濃度梯度范圍25%～75%(100%變性溶液對應20 mL 40%丙烯酰胺/甲叉雙丙烯酰胺，42 g尿素，40 mL去離子甲酰胺)取改良后的PCR產物300 ng等體積與凝膠載樣品染液混勻，放入加樣孔后放入電泳槽中50 V電壓電泳30 min后改為150 V電泳240 min然后用0.01%SYBR Green 1染色膠45 min，每次15 min分三次染色膠然后在UVI成像儀照膠。

1.3.4切膠回收純化及測序在DGGE指紋圖譜膠中選擇一些共有的和差異性明顯的條帶用無菌刀片切下來，切下來的DNA條帶放在無菌、干燥的1.5 mLEp管中，再用雙氧水水反復清洗再用無菌牙簽搗碎使膠中的DNA完全釋放出來，加20 μL雙氧水放置4 ℃冰箱16 h左右，以上述提出來的DNA作為模板將原帶GC夾子的反向引物去除GC夾子，引物序列分別為F968f 5′-GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′，R1401(5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′) PCR的反應體系和程序同上述進行PCR擴增。使用凝膠回收試劑盒回收、將回收的PCR產物送北京天根生化科技有限公司進行序列測定。測序出來的序列利用基因庫中BLAST進行比對，并將相似性大于95%以上的序列用MEGA4軟件構建系統(tǒng)進化樹，揭示親緣性關系并找出優(yōu)勢細菌序列。

2結果

2.1腸道菌群16SrDNA V6-V8區(qū)PCR產物鑒定利用2%瓊脂糖凝膠電泳以提取的DNA稀釋作為模板，PCR擴增目的基因，圖1顯示，鑒定1～10號標本的PCR產物，擴增產物片段大小約為480 bp左右，未見到非特異性擴增，DNA樣品完整性好。

2.2腸道菌群DGGE電泳圖與測序結果每一個樣品的PCR擴增產物重復多次進行變性梯度凝膠電泳，經相互比較，結果基本一致，證實本試驗的重復性和準確性良好，異常黑膽質型結腸癌患者腸道菌群結構DGGE指紋圖譜見圖2所示(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網站主頁“論文附件”)，均表現(xiàn)出個體的條帶數(shù)量稀少，而且每個條帶的亮度也有區(qū)別，有共同的條帶，也有相互有差異的條帶，這表明在患者腸道中存在量和種類不一樣的細菌。圖譜中每一個條帶都代表一種細菌，而且條帶的亮度表明細菌量的多少，圖譜中可以看到每一個研究對象腸道中細菌的種類、數(shù)量和優(yōu)勢菌的分布都不一樣，有些個體出現(xiàn)的優(yōu)勢菌在別的個體的腸道中沒有出現(xiàn)或者量比較少，有些細菌在個體中分布去向一致，因此在圖譜中選擇具有代表性的，差異性大的一些條帶進行切膠回收，純化進行測序。測序顯示維吾爾族異常黑膽質結腸癌患者腸道菌群中擬桿菌屬和梭桿菌屬數(shù)量較多。所得的序列在GeneBank數(shù)據庫中比對測序結果，基因文庫比對相似性。

M：DNA標記物；1～10號：PCR擴增目的基因產物。

圖1PCR產物電泳圖

2.3異常黑膽質結腸癌患者腸道總菌群DGGE圖譜的相似性聚類分析目的片段經基因測序后進行BLAST序列比對，同源性大于95%的用MEGA4軟件構建維吾爾醫(yī)異常黑膽質型結腸癌患者腸道菌群進化樹，結果見圖3(見《國際檢驗醫(yī)學雜志》網站主頁“論文附件”)。

3討論

人的腸道中存在著大約1014個腸道菌群，由1 000多種微生物組成，占機體細胞總量的10倍，是人和動物體最龐大而復雜的生物群落，腸道菌群又被稱為“超級生物體”[11]，正常情況下腸道菌群保持著良好的動態(tài)平衡，一旦破壞動態(tài)平衡可能與很多疾病的發(fā)生、發(fā)展有關，比如肥胖、腸道各種炎性疾病、造血功能障礙、肝硬化合并腸功能紊亂、抗菌藥物相關性腹瀉、習慣性便秘、腸易激綜合征等[12]，因此腸道菌群很多方面影響人和動物的健康狀況，現(xiàn)在已經把腸道菌群看作為宿主的一個重要組成部分。

DGGE最初是應用在DNA 片段中的出現(xiàn)點突變的鑒定研究中，此后該技術被廣泛用于各種微生物種群檢測的研究，目前已經發(fā)展成為研究微生物種類、數(shù)量、分類等的一種重要的分子生物學方法。有研究者則分別應用此技術分析4位受試者結腸中雙歧桿菌、乳酸桿菌及其他乳酸菌的分布和中老年人糞便菌群多樣性研究。DGGE技術多年以來一直用于腸道菌群多樣性研究中，是一種比較成熟、先進的分子生物學方法。

本研究采用DGGE技術針對維吾爾醫(yī)學異常黑膽質結腸癌患者腸道菌群16SrDNA V6-V8可變區(qū)進行菌群分布情況、多樣性、個體之間細菌差異性、檢測出來的細菌序列相似性等整體相關性研究。更為全面地探討維吾爾醫(yī)學異常黑膽質結腸癌患者腸道菌群的變化趨勢，同時為維吾爾醫(yī)學體液質理論以及維吾爾醫(yī)學疾病診斷提供了一些線索。在PCR-DGGE圖譜上能夠直觀地表現(xiàn)出個體差異，同時腸道總菌群UPGMA相似性聚類分析顯示出腸道總菌群的同源性存在差異，研究中獲得維吾爾醫(yī)學異常黑膽質結腸癌患者腸道細菌分布情況及腸道細菌指紋圖譜，此圖譜顯示異常黑膽質結腸癌患者腸道菌群多樣化，并且個體之間具有相似性，腸道中存在不同種類的細菌，再從圖譜中把每一種條帶切下來純化克隆檢測基因序列的相似性對比，并用相似性大于95%以上的基因序列做樹狀圖分析及鑒定異常黑膽質結腸癌患者中具有豐富的擬桿菌屬和梭桿菌屬。試驗還發(fā)現(xiàn)很多不可培養(yǎng)的細菌屬，并對其種屬親緣程度進行了分析，這些不可培養(yǎng)的腸道細菌與優(yōu)勢細菌親緣性比較近，也有個別的細菌親緣性比較遠，將加大樣本量進一步研究異常黑膽質結腸癌患者腸道菌群中的其他優(yōu)勢菌并與這些優(yōu)勢菌的分布與體液質的關系，是細菌引起了這些體液的分布還是體液決定了這些優(yōu)勢菌的分布，這些因果關系還有待進一步鑒定。

參考文獻

[1]易沙克江.中國醫(yī)學百科全書：維吾爾醫(yī)分卷(維文)[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1995:17-33.

[2]買買提明·沙比爾.維吾爾醫(yī)學診斷學[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，1993:135-148.

[3]哈木拉提·吾甫爾.維吾爾醫(yī)學氣質體液論及其現(xiàn)代研究[M].烏魯木齊：新疆科技衛(wèi)生出版社，2003:44-52.

[4]阿不都熱依木·玉蘇甫，李林，哈木拉提·吾甫爾，等.維醫(yī)異常體液分型及其與氧化-抗氧化系統(tǒng)關系的研究[J].中國基礎醫(yī)學雜志，2004,10(8)：61-63.

[5]Turnbaugh PJ，Hamady M，Yatsunenko T，et al.A core gut microbiome in obese and lean twins[J].Nature，2009，457(7228):480-484.

[6]Maia MR，Chaudhary LC，Bestwick CS，et al.Toxicity of unsaturated fatty acids to the biohydrogenating ruminal bacterium，Butyrivibrio fibrisolvens[J].BMC Microbiol，2010，18(1):10-52.

[7] Gill SR，Pop M，Deboy RT,et al.Metagenomic analysis of the human distal gut microbiom[J].Science,2006，312(5778):1355-1359.

[8]Upur Halmurat.Theory of MIZAJ and HILIT in Uighur medicine and itsmodern study[M].Urumqi:Xinjiang Science，Technology and Sanitation Press，2003.

[9]Backhed F，Sonnenburg JL，Peterson DA，et al.Host-bacteria mutuaism in the human intestine[J].Science，2005，307(5717):1915-1920.

[10]Fillon M，Novinscak A，Decoste NJ.Characterization of bacterial and fungal communities in composted biosolids over a year period using denaturing gradient gel electrophoresis[J].Can J Microbiol，2009，387(1):375-387.

[11]曾波,鐘榮珍,譚支良,等.腸道微生物多樣性與能量代謝調控及肥胖關系的研究進展[J].中國微生態(tài)學雜志，2008,20(8):415-417.

[12]吳曉康，徐紀茹，張旭燕，等.2 型糖尿病患者腸道擬類菌屬和雙歧桿菌屬多樣性的PCR-DGGE指紋圖譜分析[J].西安交通大學學報:醫(yī)學版,2010,31(4):475-480.

Analysis of intestinal bacterial diversity in abnormal sawda hilit people of colon cancer in traditional uyghur medicine*

Azierguli·Abudoukerimu1,Abudouhabaer·Abudoukerimu2,MaLanying3,Ailijiang·Maimaitiming4,SunYuping1,ChenFeng1,WangHongying1,Delixiati·Yimiti1△

(1.DepartmentofMicrobiology，XinjiangMedicalUniversity，Wulumuqi，Xinjang830011，China;2.BiologyDepartmentofScinceInistitute,HotanTeacher′sCollege,Hetian,Xinjiang848000,China;3.Gastroenterology，AffiliatedTumorHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Wulumuqi，Xinjang830011，China;4.DepartmentofInternalMedicine，XinjiangUygurMedicalCollege，Hetian，Xinjang848000，China)

Abstract:ObjectiveTo analyze the traditional uighur medicine abnormal sawda hilit people of colon cancer intestinal flora diversity by advanced molecular biology methods.MethodsChoice the colon cancer abnormal sawda hilit by uighur medicine and stool samples were collected from these groups and total genomic DNA was extracted.Extraction of total DNA designed a pair of universal primers to amplify the 16S rDNA V6 to V8 variable regions.Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of the amplified sequences was performed then cloned the DGGE bands and sequencing.ResultsObtained by experiment reflect structural features of intestinal flora DNA fingerprinting，from sequence specific band sequencing out in the Genebank database on the blast program to compare，and make the evolutionary tree understanding of the relationship between intestinal microflora.ConclusionColon cancer abnormal sawda hilit intestinal microbial gene sequence showed bacteria have rarefaction state and Dominant bacteria are significantly lower.

Key words:uygur medicine；abnormal sawda hilit；colon cancer；intestinal microflora

(收稿日期：2015-10-24)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.003

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0438-03

基金項目:國家自然科學基金資助項目(30860385);新疆醫(yī)科大學創(chuàng)新基金項目(XJ201301)。

作者簡介:阿孜爾古麗·阿布都克日木，女，講師，主要從事腸道菌群微生態(tài)研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:2316ymit@163.com。