熒光標記技術(shù)在增殖放流中的應(yīng)用現(xiàn)狀

耿 倩,張淑榮,段 妍,劉 巖,孫典榮

( 1.天津農(nóng)學院,天津 300384; 2.中國水產(chǎn)科學研究院 南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510300; 3.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院, 遼寧 大連 116023 )

熒光標記技術(shù)在增殖放流中的應(yīng)用現(xiàn)狀

耿 倩1,2,張淑榮1,段 妍3,劉 巖2,孫典榮2

( 1.天津農(nóng)學院,天津 300384; 2.中國水產(chǎn)科學研究院 南海水產(chǎn)研究所,廣東 廣州 510300; 3.遼寧省海洋水產(chǎn)科學研究院, 遼寧 大連 116023 )

熒光標記技術(shù)；增殖放流；熒光色素可見標志；熒光染料標記法

S937.3

標志技術(shù)是用來區(qū)分不同個體或種群的常用方法。自Petersen等[1]利用標志方法估算封閉水體中魚類的利用率及種群大小后，標志技術(shù)在漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中得到廣泛的發(fā)展和應(yīng)用，標記技術(shù)也不斷更新。熒光標記技術(shù)是漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中常用標志技術(shù)手段之一，其通過特定技術(shù)方法在標志對象上形成熒光標記進而通過肉眼或借助儀器發(fā)現(xiàn)該標記，主要有將熒光物質(zhì)注入水生生物皮下形成熒光標記和應(yīng)用熒光染料在水生生物鈣質(zhì)和骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成熒光標記兩種技術(shù)方法。熒光標記技術(shù)通常應(yīng)用于臨床醫(yī)學中體外培養(yǎng)骨組織，也用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的優(yōu)質(zhì)苗種選育。其在增殖放流應(yīng)用中，與以往標志標記方法相比，熒光標記具有效果顯著、成本較低、對標記對象傷害較小等優(yōu)點。近十幾年來，科研人員開展了熒光標記技術(shù)的相關(guān)研究，取得了一些成果。筆者介紹了熒光標記技術(shù)的相關(guān)方法，闡述了有關(guān)熒光標記技術(shù)的主要成果，綜述了各類標記方法的應(yīng)用，比較了不同標記方法的優(yōu)缺點及標記效果，探討了熒光標記中存在的不足，展望了今后的研究方向，為進一步開展增殖放流試驗研究和其他漁業(yè)水產(chǎn)研究提供理論參考。

1 熒光標記技術(shù)

在漁業(yè)資源增殖放流試驗中熒光標記技術(shù)主要有熒光色素可見標志法和熒光染料標記法兩種。其中熒光色素可見標志法通常利用標志槍將某種橡膠狀物質(zhì)和熒光染料組成的混合物植入標記目標皮下組織以形成有顏色的標志，是內(nèi)部標志的一種；熒光染料標記法是將熒光染料通過投喂、浸染或注射等手段使其附著沉積于標志目標身體的鈣化組織如鱗片、耳石和其他硬骨組織上，以產(chǎn)生在熒光顯微鏡下可識別的熒光標記或著色點標記，屬化學標記技術(shù)，也屬內(nèi)部標記。

2 熒光標記技術(shù)的應(yīng)用

2.1 熒光色素可見標志法的應(yīng)用

熒光色素可見標志由熒光顏料和生物硅膠組成，以液態(tài)的方式注入到標記對象后可變?yōu)楣虘B(tài)，其標志效果與標志時所選擇的標志位置和標記顏色密切相關(guān)，一般將其注入到標記對象比較透明的部位，如魚體頭頂部、眼眶后部或背鰭和胸鰭之間，靠近胸鰭等部位，熒光的顏色通常有紅色、橙色、黃色和綠色等[2]。與傳統(tǒng)掛牌法相比較，熒光色素可見標志法更為有效。由于熒光色素可見標志法主要是通過漁民回收標志目標，因此標志位置需要較為醒目，以提高標記的可視性[3]。

熒光色素可見標志方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于不同種類個體，依據(jù)種類、大小、標記位置的不同，其標志時間和保持率也不盡相同。例如在Pierson等[4]的試驗中，飼養(yǎng)標志莫桑比克羅非魚(Oreochromismossambica)110 d之后,熒光物質(zhì)保持率為78%，而試驗中草魚(Ctenopharyngodonidella)經(jīng)過238 d飼養(yǎng)之后,標志保持率為80%。Crook等[5]在試驗中將熒光色素可見標志注入南乳魚(Galaxiastruttaceus)魚體的前鰓蓋骨上，4 d和131 d后，標志保持率分別為100%和92%。Close等[6]采用熒光色素可見標志法標志虹鱒(Oncorhynchusmykiss)1齡幼魚，主要標志位置在眼后脂肪組織及下頜腹面，在暗處可以采用紫外燈檢測到熒光。Doupé等[7]應(yīng)用熒光色素標記布氏棘鯛(Acanthopagrusbutcheri)的成活率高達100%，且將其注入尾鰭鰭條間的保持率最高。用熒光色素標記虹鱒和大西洋笛鯛(Lutjanuscampechanus)，結(jié)果顯示該方法脫標率和死亡率均較低[8-9]。

很多研究表明熒光色素可見標志法適用于小型水生生物，并且標志對象與未標志對象在生長和死亡上沒有明顯不同[10]。在不同熒光色下研究這些標志對象，橘黃色標志在水中可見范圍為8～10 m，遠大于紅色、綠色和黃色[11]。通過對紅鰭東方鲀(Fugurubripes)、中國明對蝦(Fenneropenaeuschinensis)、黑鯛(Sparusmacrocephlus)、大黃魚(Pseudosciaenacrocea)等不同個體研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的試驗對象標記效果有所不同[12-14]。

2.2 熒光染料標記法的應(yīng)用

熒光染料標記法是將熒光染料通過投喂、浸染或注射等手段使其附著沉積于標志目標身體的鈣化組織(如鱗片、耳石和其他硬骨組織)上,以產(chǎn)生在熒光顯微鏡下可識別的熒光標記或著色點標記。使用熒光染料標記法能在短時間內(nèi)對處于魚類生活史不同階段的受精卵、仔稚魚等實現(xiàn)大規(guī)模標記。漁業(yè)中較常見的熒光染料種類主要有氧四環(huán)素、鹽酸四環(huán)素、鈣黃綠素、茜素紅以及茜素絡(luò)合指示劑等，這些染料已經(jīng)被證明能通過浸泡、投喂或注射等方法在標記目標身體的骨質(zhì)結(jié)構(gòu)上形成穩(wěn)定的螯合物，從而在骨組織上生成生長標記，這種骨組織上的標記能夠在熒光顯微鏡下被清楚地檢測和觀察，使用熒光染料進行標記的標志方法在漁業(yè)的相關(guān)研究中已得到越來越多的支持和應(yīng)用[15]。

熒光染料標記法在魚類、海綿類、腕足類、棘皮類等多種水生動物中作為生長標記的研究方法被廣泛使用。研究結(jié)果表明，該標記方法在水生動物生長率調(diào)查、年輪和年齡鑒定以及種群區(qū)域鑒定等方面具有顯著的效果[16-23]。例如，熒光染料標記魚類耳石，通過熒光染料的浸泡，可在耳石上產(chǎn)生明顯的化學標記[24]。

熒光物質(zhì)會在魚類耳石、鱗片和其他硬骨組織上形成永久性標記[25]，現(xiàn)今已有多種不同的熒光物質(zhì)被廣泛研究并使用[25-27]。不同標記染料應(yīng)用在不同種類上，其染料用量、染色效果、染色時間和對目標生物的影響等，均會存在較大差異。從標記效果、標記效率、對目標生物的影響等方面來看，與掛牌標志法相比，熒光染料標記法更為有效。

在試驗研究中，鹽酸四環(huán)素作為化學染料，同時也是一種抗生素，若使用含量過高則對標記目標安全產(chǎn)生威脅。歐陽斌等[26]采用鹽酸四環(huán)素浸泡標記稀有鯽(Gobiocyprisrarus)和彭澤鯽(Carassiusauratusvar. Pengze)，標記效果良好，標記率可達100%。付自東等[27]用熒光物質(zhì)對胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)仔、稚魚浸泡標記試驗結(jié)果表明，鹽酸四環(huán)素溶液對仔、稚魚耳石的標記效果很差，且150 mg/L及以上質(zhì)量濃度的浸泡液對稚魚有較高致死作用，鹽酸四環(huán)素不適于標記該魚的耳石。許莉佳等[28]利用鹽酸四環(huán)素標記斑馬魚(Dmiorerio)稚魚，標記效果較好。何春林等[29]在浸泡標記重口裂腹魚(Schizothoraxdavidi)仔魚的試驗中得出鹽酸四環(huán)素不適合標記該魚的結(jié)論。李敏達等[30]在對翹嘴紅鲌(Erythroculterilishaeformis)稚魚進行浸泡標記試驗中，鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度低時標記耳石效果不明顯，并且在質(zhì)量濃度為200 mg/L及以上時試驗魚出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，稚魚死亡率隨質(zhì)量濃度增大而增加，據(jù)此，鹽酸四環(huán)素不適合用來標記該種魚稚魚。

鈣黃綠素是熒光指示劑，主要用于絡(luò)合滴定鈣。但鈣黃綠素產(chǎn)生的背景熒光較強，對某些硬骨組織具有自發(fā)熒光現(xiàn)象的魚種可能其標記檢測效果較差。許莉佳等[28]利用鈣黃綠素標記斑馬魚稚魚，由于試驗中斑馬魚耳石自發(fā)熒光與鈣黃綠素標記熒光相近，得出鈣黃綠素不適合標記斑馬魚稚魚的結(jié)論。李敏達等[30]使用鈣黃綠素對翹嘴紅鲌稚魚進行浸泡標記試驗，結(jié)果表明用300～350 mg/L的鈣黃綠素浸泡該魚，耳石可觀察到較明顯的標記。Moran[31]指出，鈣黃綠素浸泡標記方法可以精確測量貝類生長情況，且不會影響貝類的存活或生長，是一種便于熒光檢測并且標記持久的標志方法。Purcell等[32]應(yīng)用鈣黃綠素與四環(huán)素對仿刺參(Apostichopusjaponicus)幼苗進行浸泡標記，在12個月后，檢測到標記保持率為100%，并且采樣對刺參幾乎無損傷。趙鵬等[33]用鈣黃綠素標記仿刺參體壁、觸手、管足、疣足真皮表層的骨片。綜合以上研究結(jié)果，鈣黃綠素應(yīng)用于熒光標記中對標記生物影響較小，標記生物對鈣黃綠素的適應(yīng)性更強。

茜素紅溶液是一種化工產(chǎn)品，常用作絡(luò)合滴定指示劑和酸堿指示劑，亦可在水產(chǎn)研究中用作熒光染料。梁小雙[2]采用茜素紅浸泡標記紅鰭笛鯛(L.erythopterus)，養(yǎng)殖60 d后，熒光標記依然明顯可見，標記組與空白組的存活率、體長、體質(zhì)量無顯著差異。李敏達等[30]應(yīng)用茜素紅溶液對翹嘴紅鲌稚魚進行浸泡標記，結(jié)果表明，150 mg/L的茜素紅溶液對稚魚耳石有良好的標記效果，茜素紅是標記翹嘴紅鲌早期魚苗的適宜熒光物質(zhì)。趙亞鵬等[34]利用茜素紅溶液對6日齡、20日齡及90日齡的滇池金線鲃(Sinocyclocheilusgrahami)仔稚魚進行標志，標記物能在其耳石上形成深紅色標記環(huán)帶，標記率可達100%。王臣等[35]用茜素紅標記大麻哈魚(Oncorhynchusketa)發(fā)眼后胚胎，經(jīng)檢測，茜素紅可在矢耳石和微耳石上都能形成良好標記，在可見光和黃綠激光下均檢測到標記帶，但隨著暫養(yǎng)時間的延長，可見光下標記逐漸減弱，至80 d基本消失，而在黃綠激光下標記區(qū)能長久保持，熒光強度無減弱跡象。Lagardere等[36]發(fā)現(xiàn)用高質(zhì)量濃度的茜素紅溶液可以在大菱鲆(Scophthalmusmaximus)仔魚耳石上形成清晰的熒光標記。

諸多研究也表明，用茜素絡(luò)合物形成的標記質(zhì)量要優(yōu)于四環(huán)素[25,27，37]。采用茜素絡(luò)合物溶液對魚卵或仔魚進行浸泡，可在耳石上形成可識別的熒光標記，其浸泡用量常為50～400 mg/L[36,38-39]。

付自東等[27]用熒光物質(zhì)對胭脂魚仔、稚魚浸泡標記的試驗結(jié)果表明，茜素絡(luò)合物是對胭脂魚早期魚苗進行化學標記比較合適的熒光物質(zhì)，100～200 mg/L的茜素絡(luò)合物溶液浸泡24 h對胭脂魚仔、稚魚耳石有很好的標記效果。歐陽斌等[26]采用茜素絡(luò)合物浸泡標記稀有鯽和彭澤鯽魚，標記效果良好，標記率可達100%。何春林等[29]在浸泡標記重口裂腹魚仔魚的試驗中，得出茜素絡(luò)合物對該魚是較合適的化學標記熒光物質(zhì)的結(jié)論。靳建波等[40]釆用茜素絡(luò)合物浸泡標記秦嶺細鱗鮭(Brachymystaxlenoktsinlingensis)發(fā)眼卵和幼魚，浸泡發(fā)眼卵的最佳質(zhì)量濃度為30 mg/L，浸泡18 h，標記率可達100%，出膜后幼魚存活率可達91%，耳石標記明顯；幼魚浸泡的最佳質(zhì)量濃度為120 mg/L，浸泡12 h，標記率可達83.3%，15 d后，存活率可達92.3%，耳石標記較明顯。郝振林等[41]用茜素配合指示劑浸泡標記金烏賊(Sepiaesculenta)幼體，標記金烏賊的成活率可達標記效果明顯，標記可用肉眼直接觀察。梁小雙[2]采用茜素配合指示劑浸泡標記紅鰭笛鯛，養(yǎng)殖60 d后，熒光標記依然明顯可見，標記組魚與空白組魚的存活率、體長、體質(zhì)量無顯著差異。趙天等[42]在用茜素絡(luò)合物浸泡處理唐魚(Tanichthysalbonubes)仔魚、稚魚和成魚時，水溫28～30 ℃，浸泡時間24 h，唐魚仔、稚魚最適的茜素絡(luò)合物溶液浸泡用量為80 mg/L，唐魚成魚最適浸泡用量為150 mg/L，并且，茜素絡(luò)合物對唐魚仔稚魚魚體生長沒有明顯影響。趙亞鵬等[34]利用茜素絡(luò)合物水溶液對6日齡、20日齡及90日齡滇池金線鲃仔稚魚進行標記，標記物能在其耳石上形成深紅色標記環(huán)帶，可以保證100%的標記率。

以上提到的4種染料，除鹽酸四環(huán)素質(zhì)量濃度過大會降低標記目標的存活率、鈣黃綠素產(chǎn)生的背景熒光較強外，其他3種在熒光標記應(yīng)用中表現(xiàn)良好，對標記目標無明顯損害，可以保證標記質(zhì)量，是有效的標記方法。

3 熒光標記技術(shù)的優(yōu)缺點

在增殖放流的應(yīng)用研究中，熒光標記技術(shù)有成本低廉、對標記目標傷害刺激小標記時間長的優(yōu)點，但也有標記不明顯、有時需用專業(yè)設(shè)備檢測、不利于回捕的缺點。

3.1 熒光色素可見標志的優(yōu)缺點

優(yōu)點：熒光色素可見標志法適于許多魚類和甲殼類，可用于小型水生動物(或生物幼體)的標記；操作容易簡單，標志明顯；標志樣式可個體鑒定；高保留率；對存活、生長、行為影響限度?。粯酥举M用低；檢測直觀，發(fā)熒光時可見度大大增強，在夜晚用藍色發(fā)光二極管觀察標志明顯。

缺點：熒光色素可見標志法不具備編碼功能，一般無法使用單獨加標；檢測難度較大，需要特殊的設(shè)備和工具；加標于頭部的種類假如頭部失去，則標志丟失；當該標志處在色素組織下方時檢測困難。

3.2 熒光染料浸泡標記法的優(yōu)缺點

優(yōu)點：熒光染料標記法標記方法簡單，可用于大規(guī)模標記，其適用范圍廣，標記保存率高且易于被發(fā)現(xiàn)，對標記目標損傷較小。使用熒光物質(zhì)標記法進行標記能夠減少對標記目標的操作，降低脅迫和死亡率，并且該方法能夠?qū)崿F(xiàn)一次性的大規(guī)模放流標記活動。

缺點：過高的染料浸泡用量、過長的浸泡時間等都可能對被標記生物產(chǎn)生急性或慢性毒害作用，影響被標記生物的生長、發(fā)育、行為，甚至會造成死亡。并且，標記相對于體外掛牌法等常用方法可能不明顯，在應(yīng)用于標志回捕時不易于被漁民發(fā)現(xiàn)、回收。

4 總結(jié)與展望

熒光標記技術(shù)具有適用種類廣、標記顯著、操作簡單、對標記對象影響小的技術(shù)特點，尤其在生活史早期階段具有其他標志技術(shù)所不具備的優(yōu)勢，這些特點使其能夠在水生生物標志技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域占有一席之地，國內(nèi)外學者紛紛開展了許多與之相關(guān)的研究工作，取得了豐碩的研究成果，該技術(shù)在水生生物標志技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域具有廣闊的研究應(yīng)用前景。

熒光染色標記技術(shù)為我國引進的標記方法之一，該技術(shù)在漁業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖研究中仍然具有很大的應(yīng)用潛力。在未來的研究中，筆者認為，此項技術(shù)或可從以下幾個方面進行突破：(1)改進檢測設(shè)備，進行研究升級使之更加小巧靈活便于攜帶，提高對標記的識別率；(2)對標記所用材料、方法進行研究，提高標記的被識別率；(3)熒光染料浸泡標記法中所形成的熒光標記是永久性標記，形成的螯合物雖然對標記目標損傷較小，但如今食品安全問題備受關(guān)注，被標記后的個體是否存在食品安全問題，尚未得知，亟需科研工作者進行回答；(4)開發(fā)新型安全、穩(wěn)定、可食用染料，為漁業(yè)和增殖放流試驗中熒光標記法提供更多的染料選擇，也應(yīng)在將來開展有關(guān)研究的考慮范圍之內(nèi)。

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ApplicationStatusofFluorescence-labeledTechniqueinStockEnhancement

GENG Qian1,2, ZHANG Shurong1,DUAN Yan3,LIU Yan2, SUN Dianrong2

( 1.Tianjin Agriculture University,Tianjin 300384,China; 2. South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China; 3. Liaoning Ocean Fishery Science Research Institute, Dalian 116023, China )

fluorescent marking;stock enhancement;visible implant elastomer tag;fluorescein labeling method

10.16378/j.cnki.1003-1111.2016.03.021

C

0308-05

1003-1111(2016)03-

2015-11-09；

2016-01-21.

珠江及河口漁業(yè)資源評價與增殖養(yǎng)護技術(shù)研究項目(201303048);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金資助項目(2015TS07)； 大亞灣增殖放流效果評估和跟蹤監(jiān)測項目(2130135020).

耿倩(1991—), 女, 碩士研究生; 研究方向:漁業(yè)資源調(diào)查與增殖放流效果評估.E-mail:gengsd@163.com. 通訊作者: 孫典榮(1973—),男,研究員;研究方向:海洋漁業(yè)資源評估與海洋生態(tài).E-mail:drsun73@163.com.