翼蓼塊根的抗氧化活性和抑制癌細(xì)胞增殖的研究

許明錄,左浩,汪高博,高巖,袁曉芳,李柳燕,郭理想,朱雪雪

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

翼蓼塊根的抗氧化活性和抑制癌細(xì)胞增殖的研究

許明錄,左浩,汪高博,高巖,袁曉芳,李柳燕,郭理想,朱雪雪

（河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

對(duì)翼蓼塊根的體積分?jǐn)?shù)90%乙醇提取物及其不同極性溶劑萃取物的抗氧化活性和抑制MCF-7癌細(xì)胞增殖作用進(jìn)行研究.結(jié)果表明：乙酸乙酯層萃取物的總酚和黃酮高達(dá)211.99 mg沒食子酸/g和21.50 mg槲皮素/g,其DPPH自由基清除能力的EC50值為14.08 μg/mL.測(cè)定還原能力結(jié)果表明乙酸乙酯層萃取物層質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí),吸光度為1.09.乙酸乙酯層萃取物質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),MCF-7癌細(xì)胞增殖抑制率達(dá)97.15%.

翼蓼；總酚；總黃酮；DPPH；MCF-7癌細(xì)胞

翼蓼（Pteroxygonum giraldii Dammer et Diels）是我國(guó)特有的一種多年生草本植物[1],其塊根俗稱“蕎麥七”.產(chǎn)于河北、山西、河南、陜西、甘肅、湖北及四川.生山坡石縫,山谷灌叢,海拔600～2 000 m.有研究表明,蓼科植物具有抗腫瘤、抗氧化、降血壓、抑制α-葡萄糖苷酶、調(diào)節(jié)血脂等生理活性,其化學(xué)成分主要是含揮發(fā)油、黃酮類、蒽醌類、萜類及芪類等的化合物[2].

抗氧化劑不僅可以防止由空氣氧化引起的食物腐敗,而且可消除人體有氧代謝中產(chǎn)生的內(nèi)源性活性自由基,阻斷過多自由基對(duì)人體細(xì)胞膜及大分子（如蛋白質(zhì)、DNA）的損傷,防止炎癥及惡性腫瘤的發(fā)生.現(xiàn)已證明,這些有毒物質(zhì)對(duì)人體的損害大多是通過自由基起作用,而抗氧化劑治療是有效的方法.有研究表明,黃酮類化合物具有不容忽視的抗氧化能力[3-5].癌癥是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤,有研究表明,翼蓼塊根提取物對(duì)A549肺癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[6].

本文主要研究翼蓼塊根乙醇提取物及各溶劑萃取物的總酚、總黃酮含量、DPPH自由基消除能力、羥基自由基清除能力、還原能力以及抑制MCF-7癌細(xì)胞增殖的檢測(cè).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試翼蓼塊根于2010年10月采自新鄉(xiāng)輝縣市,經(jīng)河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院許桂芳教授鑒定.

正己烷（Hexane,H）、二氯甲烷（Methylene chloride,Mc）、乙酸乙酯（Ethyl acetate,EA）、正丁醇（Butanol, Bu）、無水乙醇（Ethanol,EtOH）、甲醇等分析純?cè)噭ㄌ旖蚴锌泼軞W化學(xué)試劑有限公司）；Folin-Denis試劑（Sigma公司）；DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼,Sigma公司）；DMSO（二甲基亞砜）；2-脫氧核糖；FeSO4·7H2O；EDTA；AlCl3·6H2O；CH3COOK；30%H2O2；TCA溶液；TBA溶液；FeCl3；K3Fe（CN）6；磷酸鹽緩沖液；MCF-7（人乳腺）癌細(xì)胞；胎牛血清；MTT（噻唑藍(lán)）試劑；MEM培養(yǎng)基；胰蛋白酶-EDTA溶液等.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取過程將干燥粉碎好的翼蓼塊根（3.5 kg）盛裝于10 L廣口瓶?jī)?nèi),用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇在50℃恒溫水浴鍋（常州市國(guó)立試驗(yàn)設(shè)備研究所）中加熱回流提取24 h后,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）將提取液濃縮蒸干,重復(fù)提取3次后得到90%EtOH提取物424.3 g.再用蒸餾水將提取物溶解,依次使用H、Mc、EA、Bu的順序與水按1：1的比例萃取3次（見圖1）后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將萃取液濃縮蒸干,得到各萃取層和水（W）層的量：H,15.6g；Mc,3.1g；EA,29.9 g；Bu,225.4g；W,140.9g.

圖1 提取與萃取流程Fig.1 The processes of extraction

1.2.2 總酚含量的測(cè)定根據(jù)許明錄[7-8]等的方法略作修改,把沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)物用Folin-Denis試劑測(cè)定.實(shí)驗(yàn)組在250 μL 1 000 μg/mL試樣溶液中加入500 μL Folin-Denis試劑和500 μL飽和Na2CO3溶液.空白組以超純水代替Folin-Denis試劑,對(duì)照組以超純水代替試樣溶液和Folin-Denis試劑.充分混合后置于暗處反應(yīng)1 h,然后用紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）在725 nm處測(cè)定吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3次.以每克試樣中含有沒食子酸的毫克數(shù)表示總酚含量：吸光度=0.0069 mg沒食子酸-0.042. 1.2.3總黃酮含量的測(cè)定在500 μL 1 000 μg/mL試樣溶液中分別加入100 μL 1 mmol/L醋酸鉀溶液、2.8 mL超純水、1.5 mL體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇、1 000 μL AlCl3·6H2O（10%）溶液.對(duì)照組以超純水代替試樣溶液和AlCl3·6H2O（10%）溶液,其他條件不變.空白組以超純水代替AlCl3·6H2O（10%）溶液,其他條件不變.混合均勻后室溫下放置40 min,在415 nm下測(cè)定吸光度,每個(gè)樣品重復(fù)3次.總黃酮含量以每克試樣中含有槲皮素的毫克數(shù)表示：吸光度=0.006 6 mg槲皮素-0.035 7.

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測(cè)定樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力依據(jù)王蘭等[9]的方法,略作修改.本試驗(yàn)翼蓼塊根的H、Mc、EA、Bu、W萃取物、90%EtOH提取物樣品分別配置成1、5、10、25、50 μg/mL的一系列質(zhì)量濃度梯度的溶液,在500 μL的各試樣溶液中加入500 μL 0.2 mmol/L的DPPH甲醇溶液,對(duì)照組以超純水代替試樣溶液,其他條件不變.空白組以甲醇溶液代替DPPH甲醇溶液,其他條件不變.混合均勻后于室溫下在暗處?kù)o置30 min,然后在517 nm處測(cè)定吸光度值,樣品的每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次.待測(cè)樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力由下列公式計(jì)算,并計(jì)算出EC50值.消除率/%=[1-（Asample-Ablank）/ Acontrol]×100.

1.2.5 羥基自由基消除能力的測(cè)定將翼蓼塊根的H、Mc、EA、Bu、W萃取物、90%EtOH提取物樣品分別配制成一系列質(zhì)量濃度梯度的溶液.試驗(yàn)組在小試管中依次加入100 μL FeSO4·7H2O、EDTA、2-脫氧核糖、100 μL各質(zhì)量濃度的試樣溶液、500 μL磷酸緩沖溶液（pH=7.4）,100 μL H2O2.對(duì)照組中將100 μL各質(zhì)量濃度的試樣溶液用超純水代替,其他條件不變.于37℃水浴加熱4 h.然后加入TCA溶液、TBA溶液各500 μL.將其放在100℃恒溫水浴鍋中加熱10 min后,冷卻至室溫后在3 000 r/min下用離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）離心5 min.最后在532 nm處測(cè)定吸光度值,每個(gè)樣品的每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次.用下列方程式計(jì)算對(duì)應(yīng)待測(cè)試樣下對(duì)羥基自由基的清除率.消除率/%=（1-Asample/Acontrol）×100.

1.2.6 還原能力測(cè)定將翼蓼塊根的H、Mc、EA、Bu、W萃取物、90%EtOH提取物樣品分別配制成一系列質(zhì)量濃度梯度的溶液.移取各質(zhì)量濃度的試樣200 μL于試管中加入磷酸鹽緩沖液（pH=6.6）500 μL,再加入1%鐵氰化鉀溶液500 μL在50℃下反應(yīng)30 min.然后加入10%三氯乙酸溶液500 μL充分混和均勻,3 000 r/min下離心10 min.移取上清液500 μL于試管中,加入500 μL超純水,再加入0.1%三氯化鐵100 μL,常溫下反應(yīng)5 min.空白、對(duì)照組不加試樣,加入200 μL超純水.然后使用紫外可見分光光度計(jì)于700 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值,每個(gè)樣品的每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)3次.

1.2.7MCF-7癌細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)液：MEM（含2 mmol/L L-谷氨酰胺和Earle's BSS,1.5 g/L NaHCO3,0.1 mmol/L非必需氨基酸,1.0 mmol/L丙酮酸鈉）+10%胎牛血清.

傳代：吸去培養(yǎng)液.用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%胰蛋白酶-0.53 mmol/L EDTA洗一次,以去除血清（血清會(huì)抑制胰酶的活性）.加2～3 mL胰蛋白酶-EDTA,放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約5 min,直到細(xì)胞全部脫落.加6～8 mL培養(yǎng)液,用移液器把細(xì)胞吹散.加適量的細(xì)胞到新的培養(yǎng)器皿中.

凍存：95%培養(yǎng)液+5%DMSO凍存于液氮.

1.2.8 MTT比色法測(cè)定抑制MCF-7癌細(xì)胞增殖能力根據(jù)邵芙蓉等[10]方法,略作修改,在不同質(zhì)量濃度的各層溶液處理培養(yǎng)后的細(xì)胞,加MTT溶液,適量DMSO融解,酶標(biāo)儀550 nm測(cè)吸光度,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線,測(cè)定細(xì)胞存活率.從而反映抑制MCF-7癌細(xì)胞增長(zhǎng)活性水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 總酚和總黃酮含量

表1中翼蓼塊根的體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇提取物和5個(gè)萃取物中總酚的含量以等效物沒食子酸表示,結(jié)果表明：EA層總酚含量最高,Bu層和W層含量次之,90%EtOH層含量最少；EA層總黃酮含量最高,H層和Mc層含量次之,90%EtOH層含量最少.與三七根[11]的相關(guān)研究比較：三七根中總酚和總黃酮含量最高的EA層數(shù)據(jù)分別為183.85 mg沒食子酸/g樣品、152.33 mg槲皮素/g樣品,而翼蓼塊根中總酚和總黃酮含量最高的EA層數(shù)據(jù)分別為211.99 mg沒食子酸/g樣品、21.50 mg槲皮素/g樣品.數(shù)據(jù)說明翼蓼塊根含有較多的總酚和總黃酮類化合物,可能有較好的抗氧化活性和其他生物活性.

表1 不同提取物總黃酮含量及清除DPPH自由基的EC50值Tab.1 The total phenolic contents,total flavonoid contents and the EC50values of DPPH radical scavenging activities of different solvent extracts

2.2 DPPH自由基清除能力測(cè)定結(jié)果

如表1所示,除90%EtOH層和Mc層外,其他4個(gè)萃取物的DPPH自由基清除能力的EC50值均小于50 μg/mL.樣品中EA層的EC50值最小,為14.08 μg/mL,H、Bu、W層抗氧化活性能力相似,Mc層次之,而90%EtOH提取物活性最差.與其他蓼科植物DPPH自由基清除能力相關(guān)研究比較[12]：在50 μg/mL質(zhì)量濃度下,大黃、厚樸、黃藥子提取層的DPPH自由基清除率分別為56.40%、44.73%和52.73%,而翼蓼EA層萃取物在質(zhì)量濃度為14.08 μg/mL時(shí)的DPPH自由基清除率為50%,明顯高于其他同科植物.

2.3 羥基自由基消除能力的測(cè)定結(jié)果

對(duì)各樣品設(shè)置了3個(gè)質(zhì)量濃度梯度,見圖2.

圖2 不同提取物的羥基自由基清除率Fig.2 The hydroxyl radical scavenging rate of different solvent extracts

由圖2可知,各樣品層對(duì)羥基自由基均有清除作用,且對(duì)于同一層樣品來說,隨樣品質(zhì)量濃度增加,清除能力增強(qiáng),清除率也逐漸升高.Bu層質(zhì)量濃度從250μg/mL到500μg/mL時(shí)清除率急劇上升,質(zhì)量濃度為1000μg/mL時(shí),Bu層清除率最高為15.84%,其次分別為W層、H層、90%EtOH層、Mc層.EA層對(duì)羥基自由基的清除作用整體比較小,在質(zhì)量濃度為250 μg/mL時(shí),其清除率僅為0.82%.

2.4 還原能力的測(cè)定結(jié)果

對(duì)各樣品設(shè)置了5個(gè)質(zhì)量濃度梯度,其還原能力測(cè)定結(jié)果見圖3.

圖3 翼蓼塊根不同提取物的還原能力Fig.3 The reducing power of different extracts of Pteroxygonum giraldii roots

由圖3可以看出,翼蓼塊根體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇提取物和各萃取物的吸光度隨其質(zhì)量濃度增加而增大,因此其還原能力也隨其質(zhì)量濃度增加而增強(qiáng).當(dāng)EA層、Bu層樣品質(zhì)量濃度為1 000 μg/mL時(shí),吸光度分別為1.09和1.07,具有較強(qiáng)的抗氧化活性.W層、90%EtOH層還原能力中等.而H層、Mc層還原能力相對(duì)較弱,1 000 μg/mL質(zhì)量濃度下吸光度值分別為0.87和0.74.與三七根[11]的相關(guān)研究比較發(fā)現(xiàn)：不同質(zhì)量濃度的翼蓼塊根體積分?jǐn)?shù)90%的乙醇提取物和各萃取物在700 nm下的吸光度值均比不同質(zhì)量濃度三七根體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇提取物和各萃取物的吸光度值大,其還原能力均比三七根強(qiáng).

2.5 抑制MCF-7癌細(xì)胞增殖的測(cè)定結(jié)果

對(duì)各樣品設(shè)置了3個(gè)質(zhì)量濃度梯度,對(duì)MCF-7癌細(xì)胞的抑制率見圖4.

由圖4可以看出,EA層、W層均表現(xiàn)出較好的抑制能力,當(dāng)EA、W層樣品質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),抑制率分別為97.15%與84.22%.當(dāng)EA層樣品質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),抑制率為51.87%.而Bu層抑制MCF-7癌細(xì)胞增殖能力相對(duì)較弱,2 mg/mL質(zhì)量濃度下抑制率為51.57%.據(jù)相關(guān)研究[6],蕎麥七水提取物與蒽醌提取物在40 mg/mL質(zhì)量濃度下對(duì)A549肺癌細(xì)胞增殖的抑制率分別為88.13%和81.3%.而翼蓼塊根EA層和W層在2 mg/mL質(zhì)量濃度下抑制MCF-7癌細(xì)胞增殖能力均較強(qiáng).

3 小結(jié)

通過數(shù)據(jù)對(duì)比發(fā)現(xiàn)：翼蓼塊根體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇提取物和5個(gè)萃取物的總酚和總黃酮含量與其抗氧化活性總體呈正相關(guān),其中EA層萃取物尤為明顯,其對(duì)DPPH自由基的清除作用最強(qiáng),還原能力和抑制MCF-7癌細(xì)胞增殖作用對(duì)也均比其它層萃取物強(qiáng),值得進(jìn)一步研究并分離純化得到活性更高的單一化合物,應(yīng)用到社會(huì)生產(chǎn)及生活的各個(gè)領(lǐng)域中.

與DPPH自由基清除能力相對(duì)應(yīng)的羥基自由基的清除能力卻顯得比較低,呈現(xiàn)一定程度的負(fù)相關(guān)關(guān)系.二者之間是否存在這樣的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證.此外,本試驗(yàn)只針對(duì)翼蓼塊根乙醇提取物進(jìn)行了初步抗氧化活性及抑制癌細(xì)胞增殖作用研究,但提取物中其他成分是否也有一定程度的抗氧化活性,及不同提取方法得到的提取物抗氧化活性是否存在差異,尚需進(jìn)一步研究.

目前國(guó)內(nèi)外的文獻(xiàn)對(duì)翼蓼的研究主要集中在其化學(xué)成分方面,而對(duì)其抗氧化活性和抑制癌細(xì)胞增殖的研究還比較少.本文對(duì)翼蓼塊根的以上性質(zhì)進(jìn)行了研究,為翼蓼屬植物的藥用價(jià)值提供參考.

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（責(zé)任編輯：盧奇）

Antioxidant activity and Inhibition of cancer cell proliferation of differernt extracts from Pteroxygonum giraldii root

XU Minglu,ZUO Hao,WANG Gaobo,GAO Yan,YUAN Xiaofang,LI Liuyan, GUO Lixiang,ZHU Xuexue
（Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China）

The 90%ethanol extract of Pteroxygonum giraldii root and its fractions of several different polar solvents were used to investigate the antioxidant activities and inhibition ability for MCF-7cancer cell proliferation in this study.The results showed that the total phenolic and flavonoid contents of the ethyl acetate fraction were high up to 211.99 mg gallic acid/g and 21.50 mg quercetin/g respectively.The ethyl acetate fraction exhibited strong DPPH free radical scavenging with the EC50of 14.08 μg/mL.Reduction ability of the ethyl acetate fraction showed that the absorbance was 1.09 at 1 000 μg/mL.The ethyl acetate fraction exhibited the 97.15%MCF-7cancer cell proliferation inhibition rate at 2 mg/mL.

Pteroxygonum giraldii；total phenolic；total flavonoid；DPPH；MCF-7cancer cell

R284

A

1008-7516（2016）02-0053-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.02.013

2016-01-11

河南科技學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃

許明錄（1972―）,男,朝鮮族,吉林延邊人,博士,副教授.主要從事天然藥物開發(fā)及利用研究.