參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MKN—45細(xì)胞周期阻滯及抗侵襲轉(zhuǎn)移的影響

馬春林 吳紅彥 李海龍 等

摘要：目的 探討不同濃度參芪抑瘤方藥物血清對(duì)胃癌MKN-45細(xì)胞周期阻滯及抗侵襲轉(zhuǎn)移作用的相關(guān)機(jī)制。方法 60只SPF級(jí)Wistar大鼠，隨機(jī)分為對(duì)照組和參芪抑瘤方低、中、高劑量組，每組15只。參芪抑瘤方低、中、高劑量組分別給予0.25、0.50、1.00 g原藥材/mL藥液灌胃，空白組給予等量飲用水灌胃，每日2次，連續(xù)7 d，末次灌胃2 h后取血，分離血清。MKN-45細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物血清處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，免疫組化檢測(cè)COX-2、PTEN蛋白表達(dá)。結(jié)果 藥物血清干預(yù)后細(xì)胞G0～G1期比例增加，S期比例減少；藥物血清可降低MKN-45細(xì)胞COX-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)率，升高PTEN蛋白陽(yáng)性表達(dá)率（P<0.05）。結(jié)論 參芪抑瘤方藥物血清阻滯細(xì)胞周期及抗侵襲轉(zhuǎn)移作用可能與影響COX-2、PTEN蛋白表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：參芪抑瘤方；胃癌；MKN-45細(xì)胞；細(xì)胞周期；COX-2蛋白；PTEN蛋白；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.017

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1005-5304（2016）04-0064-04

Effects of Shenqi Yiliu Decoction Medicated Serum on Blocking Cell Cycle and Inhibiting Invasion and Metastasis of Gastric Cancer Cell Lines MKN-45 MA Chun-lin1， WU Hong-yan1，2，3， LI Hai-long1，2， CHEN Jie1， ZHANG Xuan1 （1. Gansu University of Traditional Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Excavation Innovation and Transformation of Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 3. Laboratory for TCM New Products Development Engineering of Gansu Province， Lanzhou 730000， China）

Abstract： Objective To investigate the relevant mechanism of different concentrations of Shenqi Yiliu Decoction medicated serum on blocking cell cycle and inhibiting invasion and metastasis of gastric cancer cell lines MKN-45. Methods Sixty SPF Wistar rats were randomized into Shenqi Yiliu Decoction low-， medium-， and high-dose groups and control group， with 15 rats in each group. Low-， medium- and high-dose groups were fed with different concentrations of TCM liquid from which containing crude medicine （0.25， 0.50， 1.00 g/mL） separately for gavage. Rats in the blank group were given the same amount of drinking water for gavage， twice a day， for 7 days. 2 h after the last gavage， rat blood was taken and serum was separated. After MKN-45 cells were dealt with different concentrations of medicinal serum， FCM was used to detect cell cycle and immunohistochemistry technology was used to detect the expressions of COX-2 and PTEM proteins. Results FCM analysis showed that medicated serum could increase G0-G1 phase and shorten S phase of cells； medicated serum could reduce the positive expression rate of COX-2 of the MKN-45 cells and increase positive expression rate of PTEN proteins （P<0.05）. Conclusion Shenqi Yiliu Decoction medicated serum can block the cell cycle and inhibit invasion and metastasis of MKN-45 cell lines， which may be related to the intervention in the expression levels of COX-2 and PTEN proteins.

Key words： Shenqi Yiliu Decoction； gastric cancer； MKN-45 cell； cell cycle； COX-2； PTEN； rats

優(yōu)勢(shì)，并越來(lái)越受到關(guān)注。當(dāng)歸貝母苦參丸出自《金匱要略》，原用于治療妊娠小便困難?，F(xiàn)代研究顯示，其對(duì)肝癌、胃癌細(xì)胞等有明顯的抑制作用[1-3]。參芪抑瘤方為臨床經(jīng)驗(yàn)方，用于多種腫瘤疾病的治療，由當(dāng)歸貝母苦參丸加黃芪、全蝎、山慈菇等組成，契合了腫瘤正氣不足，痰（濕）濁、癌毒、瘀血內(nèi)阻的發(fā)病機(jī)制[4]。方中藥材所含有效成分黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、貝母堿、苦參堿等對(duì)多種癌細(xì)胞有明顯的抑制作用[5-8]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探索其抗腫瘤的相關(guān)作用機(jī)制，為抗腫瘤中藥研發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

60只SPF級(jí)Wistar大鼠，雌雄各半，6～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，合格證號(hào)SYXK（甘）2001-0001。室溫20～25 ℃、濕度45%～55%分籠飼養(yǎng)，喂標(biāo)準(zhǔn)飼料（甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供），自由飲水。

1.2 藥物和細(xì)胞

參芪抑瘤方由苦參、黃芪、山慈菇、全蝎、當(dāng)歸、浙貝母等組成，所有飲片購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。胃癌MKN-45細(xì)胞，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所提供。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco公司），四季青胎牛血清（杭州四季青公司），胰蛋白酶（Gibco公司），二抗（中杉金橋生物技術(shù)有限公司），RNAisoTMPlus（D9810A），the PrimeScript RT reagent、kit（DRRO37A），SYBR Premix Ex TaqTM（DRR081A，TakarBio），國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭ū本┗瘜W(xué)試劑公司）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（上海申力，HF212），高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司，5804R），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司，CKX41+DP21），流式細(xì)胞儀（美國(guó)COULTER EPICS XL）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、給藥及藥物血清制備

將60只SPF級(jí)Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和參芪抑瘤方低、中、高劑量組，每組15只。參芪抑瘤方低、中、高劑量組予0.25、0.50、1.00 g原藥材/mL藥液灌胃，對(duì)照組予等量飲用水灌胃。給藥體積均為1.5 mL/100 g，每日2次，連續(xù)7 d。末次灌胃2 h后取血，3000 r/min低溫離心15 min，分離血清，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，56 ℃、30 min滅活，-80 ℃保存。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

MKN-45細(xì)胞經(jīng)常規(guī)傳代培養(yǎng)，采用含10%滅火胎牛血清及青鏈霉素（100 U/mL）的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中貼壁生長(zhǎng)，每2～3 d換液1次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞情況，當(dāng)生長(zhǎng)狀態(tài)良好且鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，采用25%胰酶消化、傳代，并取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MKN-45細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞接種于6孔板中，增殖為80%時(shí)，加入20%藥物血清處理48 h，檢測(cè)前用胰酶消化，1500 r/min離心5 min，棄上清液，PBS洗2次，70%乙醇固定，4 ℃固定過(guò)夜。用PBS配制成單細(xì)胞懸液，50 μg/mL碘化丙啶染色液室溫染色30 min后，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

2.4 免疫組化檢測(cè)MKN-45細(xì)胞COX-2、PTEN蛋白表達(dá)

將無(wú)菌10 mm×10 mm的24片蓋玻片置入24孔培養(yǎng)板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MKN-45細(xì)胞消化后，制成單細(xì)胞懸液，以500 μL/孔接種于24孔培養(yǎng)板中。待細(xì)胞貼壁后，對(duì)照組加50 μL完全培養(yǎng)基，余孔依次加空白血清和高、中、低劑量藥物血清各50 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞爬滿(mǎn)蓋玻片后，取爬片浸入4%多聚甲醛中過(guò)夜。用PBS洗3次，5 min/次，加50 μL 0.1%Triton X-100室溫下孵育15 min后，再用PBS洗5 min×3次，加3%H2O2室溫下孵育30 min，繼續(xù)用PBS洗5 min×3次，滴加50 μL 5%BSA封閉液。室溫封閉20 min后，甩去多余液體，滴加50 μL稀釋過(guò)的Rabbit Anti-collagen TypeⅡ（1∶100），置濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜。并以PBS代替一抗，作為陰性對(duì)照，PBS洗3次，2 min/次，加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃孵育20 min，再用PBS洗2 min×3次。然后加SABC，37 ℃繼續(xù)孵育20 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯色，自來(lái)水沖洗1 min。蘇木素復(fù)染5 min，0.5%鹽酸乙醇分化10 s，氨水返藍(lán)10 s。梯度乙醇脫水干燥，每一梯度5 min，二甲苯透明10 s，甘油封片。倒置相差顯微鏡觀察爬片，每組選6張爬片，每張爬片選擇3個(gè)高倍視野照相，用Leica Qwin病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)所拍照片進(jìn)行分析，測(cè)定相對(duì)灰度值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以—x±s表示，根據(jù)方差齊性檢驗(yàn)結(jié)果，多組間比較采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

4 結(jié)果

4.1 參芪抑瘤方藥物血清對(duì)MKN-45細(xì)胞周期的影響

10%濃度藥物血清處理后MKN-45細(xì)胞較對(duì)照組細(xì)胞G0/G1期比例升高，S期低于對(duì)照組，見(jiàn)表1、圖1。表明藥物血清可有效抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，降低細(xì)胞S期，阻滯細(xì)胞于G0～G1期。

4.2 參芪抑瘤方藥物血清對(duì)MKN-45細(xì)胞COX-2、PTEN蛋白表達(dá)的影響

對(duì)照組細(xì)胞COX-2以強(qiáng)陽(yáng)性和陽(yáng)性表達(dá)為主，而藥物血清干預(yù)組細(xì)胞著色逐漸變淺，COX-2呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)；對(duì)照組細(xì)胞著色較淺，PTEN呈弱陽(yáng)性或陰性表達(dá)，藥物血清干預(yù)組細(xì)胞著色逐漸變深，PTEN表達(dá)逐漸增強(qiáng)，呈強(qiáng)陽(yáng)性或陽(yáng)性表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖2和圖3。

5 討論

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多步驟、多基因參與的復(fù)雜病理過(guò)程。正常情況下，胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡之間保持動(dòng)態(tài)平衡。這種平衡的維持有賴(lài)于癌基因、抑癌基因及一些細(xì)胞因子等共同調(diào)控。多種因素會(huì)影響上述調(diào)控體系，共同參與胃癌的發(fā)生。

中醫(yī)認(rèn)為，胃癌是牽涉整體的全身性疾病的局部表現(xiàn)，多由先天稟賦不足、邪毒侵襲、痰凝血瘀等因素，引起機(jī)體陰陽(yáng)失衡，臟腑經(jīng)絡(luò)功能失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致局部癌變。其主要病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為素體虛弱或先天稟賦因素，標(biāo)實(shí)不外乎氣滯、血瘀、痰凝、毒聚。中醫(yī)藥治療在個(gè)體化、多層次、多靶點(diǎn)控制腫瘤生長(zhǎng)、抗轉(zhuǎn)移、減少?gòu)?fù)發(fā)等方面具有獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)，是胃癌的重要輔助治療方法。胃癌早期采用中西醫(yī)結(jié)合治療，可有效逆轉(zhuǎn)病情的惡化。利用中醫(yī)藥的整體調(diào)節(jié)作用，胃癌術(shù)后放化療過(guò)程中，使患者對(duì)放化療藥物的耐受性增強(qiáng)，免疫功能得到提高，抑瘤效果得以強(qiáng)化，痛苦明顯緩解，生存期延長(zhǎng)，生活質(zhì)量提高。

COX-2是前列腺素合成關(guān)鍵限速酶環(huán)氧合酶的一種亞型，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，COX-2高表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡過(guò)程中起重要作用，其表達(dá)可延長(zhǎng)癌細(xì)胞的生存期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。在正常胃黏膜COX-2幾乎不表達(dá)，而在胃癌變時(shí)則過(guò)表達(dá)，對(duì)胃癌細(xì)胞的異常增殖、細(xì)胞凋亡、抑制血管形成及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有重要生物學(xué)作用。COX-2過(guò)表達(dá)可上調(diào)黏附因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移；上調(diào)腫瘤細(xì)胞周?chē)苌梢蜃?，促進(jìn)腫瘤血管生成。研究表明，其在正常胃黏膜、淺表性胃炎、萎縮性胃炎伴腸化、不典型增生及胃癌組織中的表達(dá)呈逐漸遞增趨勢(shì)[9]。

作為抑癌基因的PTEN低表達(dá)會(huì)激活PPI3K-Ark 信號(hào)通路，從而縮短細(xì)胞的分裂周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，與腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10]。PTEN的表達(dá)過(guò)低、受到抑制或缺失都會(huì)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[11-13]。PTEN蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵襲程度密切相關(guān)。胃癌組織中PTEN蛋白的檢測(cè)可了解與判斷腫瘤增生、侵襲及轉(zhuǎn)移的能力和程度。

綜上，參芪抑瘤方藥物血清能明顯阻滯胃癌細(xì)胞于G0/G1期，減少S期細(xì)胞數(shù)量，有效抑制細(xì)胞進(jìn)入增殖周期，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期阻滯。參芪抑瘤方藥物血清可能通過(guò)抑制COX-2的表達(dá)從而抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的活性，降低細(xì)胞間E-鈣黏蛋白活性，減弱腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，也可能通過(guò)升高PTEN的表達(dá)量，使其去磷酸化作用增強(qiáng)，進(jìn)而抑制細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和分化，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等，從而發(fā)揮抗胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用。

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