曲美他嗪對冠狀動脈微栓塞大鼠心功能的保護作用

楊華鋒，劉濤，劉陽春，王現(xiàn)濤，李浪（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021）

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曲美他嗪對冠狀動脈微栓塞大鼠心功能的保護作用

楊華鋒，劉濤，劉陽春，王現(xiàn)濤，李浪
（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，南寧530021）

摘要：目的 探討曲美他嗪對冠狀動脈微栓塞（CME）大鼠的心肌保護效果及機制。方法 將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、干預組各12只。干預組術前連續(xù)3 d給予曲美他嗪10 mg／（kg·d）灌胃；模型組與干預組經(jīng)左心室注射42 μm微栓塞球建立CME模型，對照組經(jīng)左心室注射等量生理鹽水。術后6 h采用心臟超聲檢測心功能，免疫印跡法檢測心肌組織Caspase-3及Caspase-8表達。結果 與對照組比較，模型組與干預組左心室射血分數(shù)（LVEF）、心輸出量（CO）及短軸縮短率（FS）均降低，左心室舒張末徑（LVEDd）升高（P均＜0．05）；與模型組比較，干預組LVEF、CO及FS均升高，LVEDd下降（P均＜0．05）。干預組心肌組織中Caspase-3與Caspase-8表達較對照組升高，較模型組降低（P均＜0．05）。結論 曲美他嗪預處理可改善CME后心功能，該作用可能與其抑制Caspase-3與Caspase-8表達減少心肌細胞凋亡有關。

關鍵詞：曲美他嗪；冠狀動脈疾病；心室功能；細胞凋亡；Caspase-3；Caspase-8；大鼠

冠狀動脈微栓塞（CME）指動脈粥樣硬化斑塊自發(fā)性破裂后，斑塊碎片流向并堵塞遠端微循環(huán)水平的微小血管，引起心肌微循環(huán)障礙，也是急性冠脈綜合征（ACS）患者行血運重建治療時常見的并發(fā)癥［1］。CME易導致慢血流或無復流現(xiàn)象發(fā)生。研究表明，圍手術期應用曲美他嗪能減輕PCI相關的心肌損傷，改善PCI術后冠狀動脈血流及左心室功能，發(fā)揮心肌保護效應［2，3］。另外，曲美他嗪還能抑制家兔心肌缺血再灌注損傷造成的心肌細胞凋亡［4］。2014年7月～2015年5月，我們觀察了曲美他嗪預處理對CME大鼠心功能及心肌凋亡的影響，探討曲美他嗪的心肌保護機制。

1　材料與方法

1．1材料 成年雄性SPF級SD大鼠，6～8周齡，體質量200～250 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。直徑42 μm微栓塞球（凍干粉2×107個／g），購自挪威Dynal公司，使用前混懸于含十二烷基硫酸鈉的生理鹽水，調整密度為3×104／mL。鹽酸曲美他嗪片，購自山東瑞陽制藥有限公司，研磨后用生理鹽水配制成1 mg／mL溶液。

1．2動物分組與處理 將大鼠隨機分為對照組、模型組、干預組各12只。干預組術前連續(xù)3 d給予曲美他嗪10 mg／kg灌胃，1次／d。各組使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頸正中切口，插入氣管導管，連接小動物呼吸機輔助呼吸、心電監(jiān)測。沿胸骨左緣開胸暴露心臟及大血管，分離升主動脈，用血管夾鉗夾主動脈根部10 s；模型組和干預組迅速用注射器將0．1 mL微栓塞球混懸液從心尖部注射至左心室內制備CME模型，對照組同法注射等量生理鹽水。待呼吸、心率平穩(wěn)后關胸，恢復自主呼吸后拔管脫機。術畢常規(guī)腹腔注射青霉素預防感染。

1．3心功能檢查 微栓塞后6 h行超聲心動圖檢查，探頭頻率12 MHz。測量左心室射血分數(shù)（LVEF）、心輸出量（CO）、短軸縮短率（FS）、左心室舒張末徑（LVEDd），連續(xù)測量3個心動周期，取平均值。

1．4心肌組織Caspase-3、Caspase-8檢測 采用免疫印跡法。處死大鼠，取出心臟，除去心房、心耳；取左心室長軸中點，平行于房室溝將心室分為心底部與心尖部；將心尖部置液氮中，－80℃凍存。取0．5 g心尖組織，液氮研磨，加入蛋白裂解液與蛋白酶抑制劑，離心取上清液，BCA法測定蛋白濃度。加入上樣緩沖液后煮沸變性，然后取50 μg蛋白樣品。以GAPDH為內參，行15%十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉膜；用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉1 h；一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后以相應二抗孵育1 h；用增強化學發(fā)光法顯示抗原－抗體復合物，暗房膠片顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描。

1．5統(tǒng)計學方法 采用SPSS16．0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間兩兩比較采用成組t檢驗。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2．1各組心功能比較 見表1。

表1　各組心功能比較（n＝12，珔x±s）

2．2各組心肌組織Caspase-3、Caspase-8比較 見表2。

表2　各組心肌組織Caspase-3、Caspase-8比較（n＝12，珔x±s）

3　討論

CME是臨床上常見的病理生理過程，嚴重影響ACS患者的心功能及預后［1，5］。Thielmann等［6］研究證實，CME后急性期即可形成局部心肌微梗死灶，并伴隨心肌細胞凋亡、局部心肌炎癥反應與心功能進行性下降。除局部心肌炎癥反應外，心肌細胞凋亡也是CME發(fā)生后心功能下降的重要機制［7］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，CME發(fā)生后3 h心功能明顯下降，且呈進行性下降趨勢；而心肌細胞在CME后3 h出現(xiàn)凋亡并在微栓塞后6 h達高峰［8］。因此本實驗選取CME后6 h作為觀察時間點，結果顯示，模型組CME后6 h心功能損傷，左心室擴張，表現(xiàn)為反映心肌收縮功能的指標LVEF、CO及FS均明顯下降，LVEDd增大。

曲美他嗪是新型抗心肌缺血藥物，能直接抑制心肌細胞線粒體內3-酮酰輔酶A硫解酶，減少長鏈脂肪酸氧化分解，在不增加氧耗的情況下提高葡萄糖氧化供能，維持ATP生成，改善脂肪酸氧化與糖供能偶聯(lián)，改善冠心病患者的心肌供血［9］。曲美他嗪還可維持細胞膜磷脂合成功能、抑制鈣超載，具有抗炎、抗氧化應激功能，且其心肌保護作用獨立于對冠狀動脈血流動力學的影響［10］。研究顯示，曲美他嗪能改善缺血性心臟疾病的心肌收縮功能障礙，并改善缺血性心衰患者預后［11，12］。曲美他嗪能通過抑制線粒體膜通透性轉運孔減輕心肌缺血再灌注損傷［13］，具有確切的心肌保護作用［14］。本研究顯示，干預組術前3 d連續(xù)予曲美他嗪灌胃，可明顯改善CME后心功能，表現(xiàn)為LVEF、CO、FS等心肌收縮功能指標升高，LVEDd下降。因心肌細胞為終末分化細胞，改善心肌細胞能量代謝并減少心肌細胞凋亡，可能是曲美他嗪改善CME后心收縮功能的重要機制之一。

Caspase-3是Caspase家族成員之一，直接介導細胞凋亡的最終通路，其激活即觸發(fā)后續(xù)的凋亡級聯(lián)反應［15］。Caspase-8是死亡受體途徑介導凋亡的關鍵啟動因子，當Caspase-8募集至死亡受體主要成員的CD95及其配體結合構成的相關死亡結構域時，形成死亡誘導信號復合體，啟動Caspase級聯(lián)反應，是死亡受體凋亡途徑的重要蛋白與標志［16］。本研究顯示，與對照組比較，模型組和干預組心肌組織中Caspase-3與Caspase-8表達均明顯上調，說明CME后急性期在應激刺激條件下心肌細胞內Caspase級聯(lián)反應激活并介導凋亡。干預組Caspase-3表達水平較模型組下降，提示曲美他嗪能減少CME后心肌細胞凋亡，其改善心肌收縮功能作用的機制可能與心肌細胞凋亡減少相關。與模型組比較，干預組Caspase-8相對表達水平明顯降低，說明曲美他嗪能減少心肌細胞凋亡、改善心功能的機制可能與抑制外源性死亡受體凋亡途徑有關。

綜上所述，曲美他嗪預處理治療可通過抑制死亡受體途徑的激活，下調Caspase-3表達，減輕CME后急性期心肌細胞凋亡，從而改善大鼠CME后的心功能。

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Protective effects of trimetazidine on cardiac function after coronary microembolization in rats

YANG Huafeng，LIU Tao，LIU Yangchun，WANG Xiantao，LI Lang
（The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China）

Abstract：Objective To investigate the protective effects of trimetazidine on cardiac function after coronary microembolization（CME）in rats and the mechanism．Methods Thirty-six male SD rats were randomly divided into the control group，model group and trimetazidine intervention group（intervention group），12 rats in each group．The 42 μm microspheres were injected into the left ventricle to establish the CME model in rats of the model group and intervention group，and rats in the intervention group received trimetazidine 10 mg／（kg·d）for 3 days before the operation．For rats in the control group，the same dose of normal saline was substituted for microspheres．The cardiac function was detected by echocardiography，and the expression levels of caspase-3 and caspase-8 in the myocardial tissues were detected by Western blotting at 6 h after operation．Results Compared with the control group，the left ventricular ejection fraction（LVEF），cardiac output（CO）and fraction shortening（FS）were lower，whereas the left ventricular end-diastolic dimension（LVEDd）was higher in the model and intervention groups（all P＜0．05）．Compared with the model group，LVEF，CO and FS were increased but LVEDd was decreased in the intervention group（all P＜0．05）．The levels of caspase-3 and caspase-8 in the intervention group were higher than those of the control group，but lower than those of the model group（all P＜0．05）．Conclusion Trimetazidine pretreatment can significantly improve the cardiac function of rats after CME by attenuating apoptosis of myocardium through inhibiting the expression of caspase-3 and caspase-8．

Key words：trimetazidine；coronary diseases；cardiac function；apoptosis；caspase-3；caspase-8；rats

收稿日期：（2015-08-30）

通信作者簡介：李浪（1968-），男，教授，博士生導師，主要研究方向為冠狀動脈微栓塞的基礎研究與冠心病介入治療。E-mail：drlilang＠163．com

作者簡介：第一楊華鋒（1990-），男，碩士，主要研究方向為冠心病基礎與診治。E-mail：yeohpacific＠126．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81260042）。

中圖分類號：R543．3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0023-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．008