結直腸癌組織中miR-150表達及其對癌細胞增殖的影響

楊雅靜，李利廷，于衛(wèi)芳，田延鋒，張麗靜，趙增仁，劉月更（唐山市第二醫(yī)院，河北唐山063000；河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院）

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結直腸癌組織中miR-150表達及其對癌細胞增殖的影響

楊雅靜1，李利廷2，于衛(wèi)芳2，田延鋒2，張麗靜2，趙增仁2，劉月更2
（1唐山市第二醫(yī)院，河北唐山063000；2河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院）

摘要：目的 觀察結直腸癌組織中miR-150的表達變化，探討miR-150對結直腸癌細胞增殖的影響。方法選擇35例結直腸癌患者，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測癌組織和癌旁正常組織中miR-150的表達。將結直腸癌HCT116細胞分為兩組，分別采用miR-150模擬物（轉染組）和陰性對照（對照組）進行轉染，采用CCK-8法檢測兩組的細胞增殖活性。結果 miR-150在結直腸癌組織中的相對表達量為0．071（0．031，0．129），癌旁正常組織中為0．336（0．168，0．817），癌組織明顯低于癌旁正常組織（P＜0．05）。與對照組比較，轉染組轉染48、72、96、120 h時細胞增殖活性顯著降低（P均＜0．05）。結論 結直腸癌組織中miR-150表達下調；miR-150具有抑制結直腸癌細胞增殖的作用，上調miR-150表達可抑制結直腸癌細胞增殖。

關鍵詞：結直腸癌；miR-150；微小RNA；細胞增殖

微小RNA（miRNA）是一類長約22個核苷酸的小分子非編碼RNA，通過調節(jié)mRNA的翻譯或降解來影響多種基因的表達，參與調控細胞分化、增殖及凋亡［1］。miR-150是最近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，其異常表達在自身免疫性疾病、感染和腫瘤等多種病理生理狀態(tài)下發(fā)揮重要作用［2］。2012年12月～2013 年12月，我們通過檢測結直腸癌組織中miR-150的表達，并觀察其對結直腸癌細胞增殖的影響，探討其在結直腸癌發(fā)病中的作用。

1　資料與方法

1．1臨床資料 選擇2012年9月～2013年9月河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院收治的35例結直腸癌手術患者，男17例、女18例，年齡31～83歲、中位年齡68歲。均經(jīng)病理檢查證實，術前未接受化放療。取手術切除的結直腸癌組織和癌旁正常組織，－80℃保存。

1．2miRNA-150表達檢測 采用qRT-PCR方法。使用TRIzol試劑提取結直腸癌及癌旁正常組織中的總RNA，－80℃保存。引物序列如下：miR-150-F 為5′-GCTCTCCCAACCCTTGT-3′；miR-150-R為5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6-F為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；U6-R為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。按照All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection Kit試劑說明書操作，反應條件：95℃預變性10 min，然后95℃10 s、60℃30 s、72℃10 s，40個循環(huán)。相對表達量使用2－ΔCT法計算，其中ΔCT＝目的基因平均CT值－內參基因CT值。

1．3細胞培養(yǎng)及增殖能力檢測 取結腸癌HCT116細胞，采用含10%FBS的McCoys 5A培養(yǎng)基培養(yǎng)，并加入1%PEST，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2；根據(jù)生長情況每2～3 d換液1次；當細胞覆蓋瓶底大部分表面時，進行細胞傳代或收集。將細胞按5×104／孔接種于24孔培養(yǎng)板中，24 h后按照Lipofectamine 2000脂質體轉染說明書轉染miR-150模擬物（轉染組）和陰性對照（對照組）。轉染24 h后，將轉染后的細胞制成單細胞懸液，以1×103／孔接種于96孔板，分別培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在酶標儀上測定450 nm處的吸光度值。以各時間點吸光度值繪制細胞生長曲線。每個時間點均設5個復孔，實驗獨立重復3次。

1．4統(tǒng)計學方法 采用SPSS13．0統(tǒng)計軟件。非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示；組間配對樣本分析采用Wilcoxon符號秩檢驗；正態(tài)分布資料采用±s表示，組間比較采用t檢驗，重復測量資料比較采用方差分析。P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2．1miR-150在結直腸癌及癌旁正常組織中的表達miR-150在結直腸癌組織中的相對表達量為0．071 （0．031，0．129），癌旁正常組織中的相對表達量為0．336（0．168，0．817）。miR-150在癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織（Z＝－4．062，P＜0．05）。

2．2miR-150對HCT116細胞增殖的影響 見表1。

表1　轉染組和對照組不同時間點的細胞增殖情況（珔x±s）

3　討論

研究表明，miRNA功能異常是腫瘤的重要發(fā)病機制之一。miRNA通過轉錄后水平調節(jié)多種目標基因的表達，發(fā)揮類似癌基因或抑癌基因的作用［3～5］。miR-150基因位于19號染色體，具有高度保守性，主要在T細胞、B細胞中高表達［6，7］。miR-150具有多個可能的靶基因，涉及癌基因、信號轉導通路基因、轉錄因子等，具有潛在的調節(jié)細胞生長和分化的作用［8］。Gattolliat等［9］采用組織芯片以及RT-qPCR方法比較結直腸癌和正常黏膜之間的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)miR-150在結直腸癌中的表達顯著低于正常黏膜。Srivastava等［10］發(fā)現(xiàn)，miR-150在惡性胰腺癌組織中的表達明顯下調。本研究顯示，miR-150在結直腸癌組織中的表達量明顯低于癌旁正常組織，提示miR-150在結直腸癌的發(fā)病過程中起抑癌基因的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-150具有抑制癌細胞增殖的作用。孫洋等［11］采用CCK-8方法檢測miR-150-5p對胰腺癌細胞生長的影響，發(fā)現(xiàn)miR-150-5p能夠顯著抑制4個胰腺癌細胞系。Yang等［12］研究指出，miR-150高表達可抑制胰腺癌細胞生長、克隆、遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，細胞培養(yǎng)48、72、96、120 h后，miR-150轉染組細胞增殖均明顯低于對照組，提示miR-150具有抑制結直腸癌細胞增殖的作用。

綜上所述，miR-150在結直腸癌的發(fā)病過程中具有抑癌作用，可能成為結直腸癌治療的靶點。

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·作者·編者·讀者·

Expressions of miR-150 in colorectal cancer and its influence on cell proliferation

YANG Yajing1，LI Liting，YU Weifang，TIAN Yanfeng，ZHANG Lijing，ZHAO Zengren，LIU Yuegeng
（1 Second Hospital of Tangshan City，Tangshan 063000，China）

Abstract：Objective To observe the expression changes of miR-150 in colorectal cancer tissues and to investigate the influence of miR-150 on cell proliferation of colorectal cancer．Methods The expression of miR-150 in 35 cases of colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues was detected with real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction（qRT-PCR）．HCT116 cell line was transfected with miR-150 mimic and negative control respectively，and the cell proliferation activities of the two groups were detected with CCK-8 method．Results The expression of miR-150 in the colorectal cancer tissues and adjacent normal tissues was 0．071（0．031，0．031）and 0．336（0．168，0．168），respectively．The expression of miR-150 in the colorectal cancer tissues was significantly lower than that of the adjacent normal tissues（P＜0．05）．Compared with the control group，the activity of HCT116 cell proliferation in the transfection group was significantly decreased at 48 h，72 h，96 h and 120 h（all P＜0．05）．Conclusions The expression of miR-150 in the colorectal cancer tissues is down-regulated．The miR-150 has inhibitory effect on colorectal cancer and the up-regulated expression of miR-150 can inhibit the proliferation of colorectal cancer cells．

Key words：colorectal carcinoma；miR-150；microRNA；cell proliferation

收稿日期：（2015-09-29）

通信作者簡介：劉月更（1970-），男，教授，主要研究方向為外科學。E-mail：ydyynjzx＠126．com

作者簡介：第一楊雅靜（1978-），女，主管檢驗師，主要研究方向為檢驗學。E-mail：tseyyyj＠163．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（81072034）；河北省自然科學基金資助項目（C2011206103）。

中圖分類號：R735．3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0005-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．002