食品中黃曲霉毒素B1檢測方法的發(fā)展

□王學(xué)敏 山西省分析科學(xué)研究院

食品中黃曲霉毒素B1檢測方法的發(fā)展

□王學(xué)敏 山西省分析科學(xué)研究院

黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌代謝產(chǎn)生的致癌、致畸、劇毒化合物，廣泛分布于農(nóng)作物的生長、收獲、儲運(yùn)等各個(gè)階段，是一類由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產(chǎn)生的劇毒代謝產(chǎn)物，主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，以及另外兩種代謝產(chǎn)物M1、M2。黃曲霉毒素B1污染的食物 主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重。黃曲霉毒素耐熱，280 ℃才可裂解，故一般烹調(diào)加工溫度下難以破壞。因此，國際上的大多數(shù)國家均對食品中的黃曲霉毒素B1含量制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。

在我國，國家質(zhì)檢總局規(guī)定黃曲霉毒素B1是大部分食品的必檢項(xiàng)目之一。GB 2761-2005規(guī)定了玉米和花生及其制品、植物油、大米、其他糧食和嬰幼兒配方食品中黃曲霉毒素B1的限量值分別為20、10、10、5、5 μg/ kg。為滿足不同的檢測需求，國內(nèi)外科學(xué)家不斷的創(chuàng)新和改善黃曲霉毒素B1的檢測方法。根據(jù)檢測依據(jù)原理大致可分為質(zhì)譜法和免疫學(xué)法。

高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法可以對黃曲霉毒素B1定量分析，其原理是：樣品中黃曲霉毒素B1通過提取，凈化等步驟進(jìn)行富集，經(jīng)過色譜柱分離后，通過測量色譜峰的面積進(jìn)行定量。黃曲霉毒素免疫親和柱HPLC法采用單克隆抗體免疫技術(shù)，可特異地將黃曲霉毒素與其他真菌素分離出來，分離效率和回收率高。此方法已得到廣泛應(yīng)用，并被美國官方分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）確認(rèn)為官方檢測方法。該方法的檢測限可達(dá)0.02～5 ppb。

GB/T 18979-2003規(guī)定了免疫親和層析凈化高效液相色譜檢測食品中黃曲霉毒素B1的方法。樣品經(jīng)過甲醇水混合溶液的提取，定量濾紙和玻璃纖維濾紙的過濾，通過免疫親和柱。免疫親和柱（IAC）是根據(jù)單克隆抗體與載體蛋白偶聯(lián)后將其填柱形成IAC，并與黃曲霉毒素抗原產(chǎn)生一一對應(yīng)的特異性吸附關(guān)系制作成。試樣濾液通過免疫親和柱，濾液中的黃曲霉毒素與免疫親和柱產(chǎn)生特異吸附，用蒸餾水充分洗滌免疫親和柱將其他雜質(zhì)等成分從柱中洗脫，再用甲醇將黃曲霉毒素洗脫下來。通過碘法柱后衍生增強(qiáng)測定時(shí)黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度。通過控制流動(dòng)相的比例、流速、柱溫，將黃曲霉毒素的色譜峰與干擾峰分離，利用色譜峰面積進(jìn)行定量測定。在一般實(shí)驗(yàn)中，也有用三氟乙酸進(jìn)行柱前衍生。高效液相色譜法是實(shí)驗(yàn)室常用檢測黃曲霉毒素B1的方法，具有可靠性強(qiáng)，靈敏度高，定量分析準(zhǔn)確的優(yōu)勢；但同時(shí)因?yàn)槠渌脵z測儀器設(shè)備昂貴，操作專業(yè)性強(qiáng)，因此推廣性不強(qiáng)，不適合進(jìn)行快速檢測。

酶聯(lián)免疫法（ELISA）

酶聯(lián)免疫法檢測黃曲霉毒素B1的理論基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)和酶與底物顯色反應(yīng)，采用單克隆或多克隆抗體技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、分析時(shí)間短、靈敏度高的特點(diǎn)。計(jì)融 等在生產(chǎn)抗總黃曲霉毒素單克隆抗體基礎(chǔ)上，利用間接競爭酶聯(lián)免疫法研制出具有中國自主知識產(chǎn)權(quán)的總黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其最低檢出濃度為0.26 μg/kg，對樣品的最低檢出量為1.5 μg/kg，最低檢出限為0.02 μg/kg。但測試穩(wěn)定性較差，由于酶的不穩(wěn)定性，使得在實(shí)際檢測中易出現(xiàn)假陽性或假陰性的結(jié)果。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

一般來說，組織中黃曲霉毒素含量很低，而液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有比高效色譜法更高的靈敏度和準(zhǔn)確性，如今這種方法還很少使用在測定組織霉菌毒素含量中。該方法檢測限可達(dá)0.02～0.025 ppb?？到B英 等人將高效液相色譜與三重四級桿質(zhì)譜串聯(lián)，建立4種黃曲霉毒素的定性定量分析方法。黃曲霉毒素在所測試濃度范圍內(nèi)與峰面積呈線性關(guān)系，r＞0.998，平均加標(biāo)回收率在80.6%～100.6%，黃曲霉毒素B1最低檢出限為0.2 μg/kg。

金標(biāo)免疫層析法

金標(biāo)免疫層析法是利用納米金作為標(biāo)記物的快速免疫診斷技術(shù)。該方法避免了復(fù)雜的前處理過程，檢測過程中無需進(jìn)行試劑處理，適用于快速的現(xiàn)場檢測。研究結(jié)果表明采用該方法的最低檢出限可達(dá)2.5 ng/mL。

時(shí)間分辨免疫熒光分析法

時(shí)間分辨免疫熒光分析是近來發(fā)展起來的新型分析技術(shù)。該方法利用三價(jià)稀土離子與螯合劑及抗原形成螯合物作為標(biāo)記物，利用時(shí)間分辨熒光光譜儀測試稀土離子的發(fā)光強(qiáng)度來檢測抗原量。黃飚 等采用該技術(shù)建立了高靈敏的黃曲霉毒素B1間接競爭免疫分析法，檢出限為0.01 μg/L,平均回收率可達(dá)88%。

隨著生物化學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，科學(xué)家不斷探索更快捷，準(zhǔn)確，靈敏度高的檢測方法，以滿足不同的檢測需求。以金標(biāo)法為代表的方法已被廣泛的應(yīng)用。目前，黃曲霉毒素的檢測方法將繼續(xù)改進(jìn)以獲得更高靈敏度，滿足快速檢測及同時(shí)檢測多種毒素的需求。