軟骨形成因子及骨生成因子在骨重塑中的作用*

王直兵 綜述，張　峽，張　瑗，程興旺，郝　勇，張玉梅，周　躍 審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院骨科，重慶　400037)

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·綜述·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.27.043

軟骨形成因子及骨生成因子在骨重塑中的作用*

王直兵 綜述，張峽△，張瑗，程興旺，郝勇，張玉梅，周躍 審校

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院骨科，重慶400037)

Sox-9； RunX-2； 軟骨； 軟骨下骨

軟骨損傷會(huì)引起軟骨下骨改變，然損傷后修復(fù)，對骨科醫(yī)師來講，一直是個(gè)難題。因軟骨無血管，只有軟骨細(xì)胞，損傷后其自身修復(fù)能力非常有限。目前，許多方法的治療效果均不理想。目前，學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為軟骨全層損傷會(huì)引起骨關(guān)節(jié)炎，最終執(zhí)行關(guān)節(jié)置換[1]。近年來，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在性別的分化、胚胎的發(fā)育、骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中，SOX基因家族起著至關(guān)重要的作用。有研究揭示在胚胎的軟骨生發(fā)區(qū)，sry相關(guān)高遷移率蛋白轉(zhuǎn)錄因子(Sry-related high-mobility-group box transcription factor，Sox-9)的表達(dá)很高，并影響Ⅱ型膠原(COLⅡ)的合成，對軟骨生成產(chǎn)生作用[2]。 與此同時(shí)，runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcription factor 2,RunX-2)在成骨及軟骨細(xì)胞的分化、成熟、基質(zhì)蛋白生成方面都有著重要的作用。該綜述針對軟骨誘導(dǎo)生成蛋白Sox-9和骨誘導(dǎo)生成蛋白R(shí)unX-2對軟骨損傷后，軟骨下骨的重塑作用作一總結(jié)。

1　Sox-9分子的生物學(xué)特征

1.1Sox基因家族近年來，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)SOX基因家族，在性別的分化、胚胎的發(fā)育、骨骼及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的過程中，起著至關(guān)重要的作用。近年對Sox-9基因的研究一直是個(gè)熱點(diǎn)。在人類17號(hào)染色體，Sox-9位于其長臂，HMG-box保守基因?yàn)槠渲饕卣鳎摶蚰芘cDNA序列特異性結(jié)合。許多研究證實(shí)，SOX 轉(zhuǎn)錄因子具有維持軟骨細(xì)胞表型的重要作用[3-4]。當(dāng)今，許多學(xué)者認(rèn)為除了肥大軟骨細(xì)胞，在肌肉骨骼系統(tǒng)發(fā)育過程中，Sox-9幾乎表達(dá)于所有軟骨細(xì)胞[4]。

1.2軟骨細(xì)胞與Sox-9的關(guān)系體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sox-9能結(jié)合特定軟骨基質(zhì)蛋白，并將其激活，例如COL2A1等膠原蛋白以及糖胺聚糖等[3-4]。Sox-9部分結(jié)合COL2A1編碼序列，說明Sox-9對COL2A1表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。部分研究者認(rèn)為，Sox-9功能上調(diào)控軟骨的發(fā)生，然而其具體機(jī)制仍不清楚。有文獻(xiàn)揭示，軟骨祖細(xì)胞的增殖、募集、成熟以及肥大后的轉(zhuǎn)化，都與Sox-9的表達(dá)相關(guān)。但當(dāng)Sox-9基因停止表達(dá)后，相應(yīng)的軟骨特異性分子(如膠原蛋白及糖胺聚糖)也停止表達(dá)，但在缺失Sox-9基因的小鼠身上卻表現(xiàn)出發(fā)育不全的彎肢[5]。Sox-9是調(diào)節(jié)軟骨分化發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄蛋白，在軟骨細(xì)胞膜表面存在aggrecan蛋白增強(qiáng)蛋白COLⅡ，Sox-9與其結(jié)合并使之激活、表達(dá)，進(jìn)一步調(diào)節(jié)軟骨分化。有研究發(fā)現(xiàn)，在非軟骨細(xì)胞內(nèi)存在軟骨基因，在該基因上存在增強(qiáng)子序列，Sox- 9能與之結(jié)合并使其激活，導(dǎo)致非軟骨細(xì)胞產(chǎn)生軟骨細(xì)胞樣表型[4]。Kim等[6]及其研究團(tuán)隊(duì)將聚(乳酸-羥基乙酸)納米微球用活化后的PEI/ Sox-9基因轉(zhuǎn)染入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，不管是體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)均顯示Ⅱ型膠原、Aggrecan、COMP基因的表達(dá)上調(diào)，同時(shí)糖胺聚糖的合成也增加，利用阿利辛藍(lán)、番紅-固綠染色也證實(shí)，通過非病毒Sox-9基因轉(zhuǎn)染至軟骨細(xì)胞也能成功控制軟骨的分化。陳金武等[7]將Sox-9基因以脂質(zhì)體形式成功轉(zhuǎn)入胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，轉(zhuǎn)染后的第2、16天時(shí)，他們發(fā)現(xiàn)標(biāo)簽蛋白Flag以及過表達(dá)的Sox-9使BMSCs發(fā)生軟骨細(xì)胞分化，軟骨特異性蛋白COLⅡ的表達(dá)也增加，并證實(shí)標(biāo)簽蛋白Flag由Sox-9表達(dá)。徐忠世等[8]也做了類似研究，他們將成功轉(zhuǎn)染Sox-9基因后的BMSCs，種植于支架PLGA內(nèi)，在體外共培養(yǎng)后，移植入軟骨缺損后的動(dòng)物模型身上，HE染色顯示：在第12周時(shí)，缺損的軟骨區(qū)域出現(xiàn)大量成熟的軟骨細(xì)胞，大量的軟骨基質(zhì)及膠原纖維在胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)，類似于正常軟骨。這些都表明對種子細(xì)胞行Sox-9基因的轉(zhuǎn)染，可以成功實(shí)現(xiàn)損傷軟骨的修復(fù)。

綜上可以得出，Sox-9參與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞方向分化的調(diào)控，對軟骨祖細(xì)胞增殖、募集、成熟及其肥大轉(zhuǎn)化發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，控制軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)，是軟骨形成、修復(fù)重建的主要調(diào)控者。

2　RunX-2分子構(gòu)成與特性

RunX-2屬于runt結(jié)構(gòu)域，為RunX家族轉(zhuǎn)錄因子。因N-端序列不同，RunX-2有3種異構(gòu)形式[9]，按起始氨基酸序列的不同分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，Ⅰ型為MRIPVD，Ⅱ型為MASNSL，Ⅲ型為MLHSPH。每種異構(gòu)體都被兩種轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子Pl和P2調(diào)控，同時(shí)還具有NF-KB、AP-l、c-Myb和HLH等多種其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。研究顯示，即使RunX-2只存在1個(gè)完整的成骨基因結(jié)合位點(diǎn)，CBFcd蛋白的過表達(dá)也能對其發(fā)揮反饋性抑制作用[10]。這個(gè)現(xiàn)象說明在CBFcd的表達(dá)過程中，CBFcd蛋白自身結(jié)合位點(diǎn)及成骨基因的存在是其負(fù)反饋調(diào)控的關(guān)鍵。該機(jī)制是成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)分化過程中的重要環(huán)節(jié)，如果沒有CBFcd蛋白自身緊密及嚴(yán)格的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，成骨細(xì)胞分化過程中精確的生物學(xué)功能調(diào)控根本沒辦法完成。

3　Run-2參與的骨代謝

3.1RunX-2與成骨細(xì)胞的關(guān)系研究顯示，被敲除RunX-2基因的小鼠均失去了膜內(nèi)及軟骨內(nèi)成骨能力，這一研究表明，在成骨細(xì)胞的分化過程中RunX-2基因具有極其重要的作用[11]。即使存在基質(zhì)金屬蛋白酶2(bone morphogenetic protein,BMP2)，缺失RunX-2基因的小鼠顱骨細(xì)胞，無論體內(nèi)還是體外均失去了分化為成骨細(xì)胞的能力，但卻保留了向脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化的潛力。因此可以看出，缺失RunX-2基因的BMSCs雖然喪失了向成骨細(xì)胞分化的能力，但仍具有向脂肪細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化的能力[12]。RunX-2基因在早期時(shí)能促進(jìn)MSCs分化為成骨細(xì)胞，Gersbach等[13]通過轉(zhuǎn)基因的技術(shù)成功使RunX-2在原代成肌細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，成肌細(xì)胞獲得典型的成骨作用，骨基質(zhì)生成相關(guān)基因的表達(dá)明顯增加，堿性磷酸酶(alkaline phospha-tase，ALP)分泌顯著增加，并出現(xiàn)基質(zhì)礦化。研究顯示，首先將BMLB/c小鼠顱骨造成5mm的缺損，MSCs轉(zhuǎn)導(dǎo)Ad-Cbhl/osf2后種植于缺損區(qū)域，在體內(nèi)觀察Cbfαl/Runx-2誘導(dǎo)骨形成，4周后，發(fā)現(xiàn)85%的缺損區(qū)域出現(xiàn)骨性愈合，在對照實(shí)驗(yàn)組卻沒有發(fā)現(xiàn)骨愈合[14]。有文獻(xiàn)顯示，在體外，RunX-2過表達(dá)的成骨細(xì)胞不僅不會(huì)使骨形成增加，相反還會(huì)加速破骨細(xì)胞分化，破骨細(xì)胞分化因子的表達(dá)增加，促進(jìn)骨的吸收[15-17]。

3.2軟骨細(xì)胞與RunX-2基因RunX-2的表達(dá)隨軟骨細(xì)胞的成熟逐漸增加，在肥大軟骨細(xì)胞內(nèi)，RunX-2基因大量表達(dá)，與COLⅡ的表達(dá)呈正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)顯示，RunX-2基因敲除后，小鼠軟骨細(xì)胞的分化被抑制，只有少部分骨骼內(nèi)發(fā)現(xiàn)X型膠原表達(dá)，出現(xiàn)成脂分化[18-20]。在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，因RunX-2基因的過表達(dá)，出現(xiàn)軟骨細(xì)胞早熟，骨化加速；在未成熟軟骨細(xì)胞內(nèi)，RunX-2基因的連續(xù)表達(dá)能誘使非成熟軟骨細(xì)胞的肥大[11，21]。這些表明，軟骨細(xì)胞的成熟及其分化與RunX-2基因密不可分；此外，有研究表明，RunX-2基因還參與血管長入，基因缺失后，血管入侵的能力明顯下降[22]。將轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)后，肥大軟骨細(xì)胞募集不能，該現(xiàn)象表明通過調(diào)節(jié)終末肥大軟骨細(xì)胞中的基質(zhì)蛋白相關(guān)基因，加速軟骨細(xì)胞的終末期分化，能加快軟骨的血管長入過程以及軟骨細(xì)胞分化為終末細(xì)胞[23-24]。

3.3RunX-2對細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)研究顯示，在成骨分化相關(guān)基因骨鈣蛋白基因的啟動(dòng)子中具有2個(gè)成骨細(xì)胞特定元素(osteoldast specific elements，OSE)序列，該序列為RunX-2結(jié)合位點(diǎn)。骨橋接素、ALP(alkaline phospha-tase)、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原等其他成骨分化相關(guān)基因的啟動(dòng)子中也存在OSE。由此，RunX-2與啟動(dòng)子中的OSE序列結(jié)合后，可有效促進(jìn)骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成，包括Ⅰ型膠原、骨保護(hù)素、骨唾蛋白、骨鈣素等[25-26]。

以上諸多研究顯示，RunX-2基因不僅能使原代成肌樣細(xì)胞分化為具有礦化能力的成骨樣細(xì)胞表型，還能促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞系分化；與此相同，Inman等[27]研究也顯示，在早期Runx-2能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，可是，在晚期卻為抑制成骨細(xì)胞分化。而且，在軟骨細(xì)胞向終末細(xì)胞的分化過程及胞外基質(zhì)形成方面，Runx-2都表現(xiàn)出極其重要的作用，充分揭露了Runx-2基因在損傷軟骨和軟骨下骨修復(fù)過程中的重要地位。

4　展　望

在軟骨細(xì)胞內(nèi)，Sox-9的表達(dá)在軟骨祖細(xì)胞的增殖、募集成熟以及向肥大軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方面起著至關(guān)重要的作用，對軟骨的發(fā)生，損傷后修復(fù)、重建起主要調(diào)控；RunX-2基因不僅能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化及骨形成，加速軟骨細(xì)胞的分化成熟及后期血管化，還參與破骨細(xì)胞分化、成熟及其細(xì)胞外基質(zhì)生成，這些都有力地說明了在軟骨與軟骨下骨的修復(fù)重建中，Sox-9和RunX-2有著極其重要的作用。

鑒于此，如果能在基因工程技術(shù)中，充分發(fā)揮該兩種基因的作用，在不久的將來有望實(shí)現(xiàn)軟骨及軟骨下骨損傷后的修復(fù)。

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國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81171720)。作者簡介：王直兵(1985-)，主治醫(yī)師，碩士，主要從事骨關(guān)節(jié)損傷與修復(fù)的研究。△

，E-mail:wangzhiqiang18716@126.com。

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A

1671-8348(2016)27-3865-03

2016-02-18

2016-04-06)