內(nèi)含肽融合標(biāo)簽介導(dǎo)的人乙醛脫氫酶2基因原核表達(dá)

劉向宇，尹杰超，李景鵬（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱　150030）

?

內(nèi)含肽融合標(biāo)簽介導(dǎo)的人乙醛脫氫酶2基因原核表達(dá)

劉向宇，尹杰超，李景鵬*
（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：為獲得高活性重組人乙醛脫氫酶2（ALDH2）重組蛋白，研究通過PCR獲得ALDH2基因，先后構(gòu)建克隆和表達(dá)載體pGEM-ALDH2和pTYB11-ALDH2。轉(zhuǎn)化的陽性重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE顯示融合蛋白獲得大量表達(dá)。通過正交試驗對表達(dá)條件優(yōu)化設(shè)計，結(jié)果表明，誘導(dǎo)OD值0.3，30℃，IPTG濃度1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)表達(dá)4 h為最優(yōu)表達(dá)條件。由于融合蛋白以包涵體形式存在，經(jīng)變性、復(fù)性，使用IMPACTTM-CN蛋白純化系統(tǒng)，經(jīng)內(nèi)含肽標(biāo)簽蛋白自裂解洗脫、純化，獲得僅含有幾個載體氨基酸的ALDH2蛋白，蛋白濃度為0.045 mg·mL-1。純化的ALDH2蛋白比活力為462 U·mg-1。

關(guān)鍵詞：人乙醛脫氫酶2；內(nèi)含肽；重組表達(dá)；包涵體；IMPACTTM-CN蛋白純化系統(tǒng)

劉向宇,尹杰超,李景鵬.內(nèi)含肽融合標(biāo)簽介導(dǎo)的人乙醛脫氫酶2基因原核表達(dá)[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2016, 47(1): 38-44.

Liu Xiangyu, Yin Jiechao, Li Jingpeng. Expression of recombinant human aldehyde dehydrogenase 2 by using intein induced expression system[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 38-44. (in Chinese with English abstract)

乙醛脫氫酶（Aldehyde dehydrogenase, ALDH）是人體內(nèi)乙醇脫氫酶系重要組成部分，和乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）一起，共同催化乙醇在人體內(nèi)分解代謝[1]。乙醛脫氫酶2（AL?DH2）將乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸，最終分解為二氧化碳和水，是目前已知的代謝乙醛催化效率最高的限速酶[2]。ALDH2基因具有高度遺傳多態(tài)性，中國和其他亞洲國家中，35%~40%個體缺乏ALDH2，更易發(fā)生酒精中毒[3]。高活性外源乙醛脫氫酶的補充可彌補內(nèi)源性乙醛脫氫酶不足，商品化ALDH2主要從動物肝臟和胰腺中分離、提取，價格較高，難以大規(guī)模生產(chǎn)[4]。獲得高活力的ALDH2成為研究熱點。通過將ALDH2基因融合到pET32a中，黃娟等在大腸桿菌中表達(dá)重組ALDH2蛋白，呈包涵體形式表達(dá)[5]；Gross等通過構(gòu)建pT7-7-ALDH2等多種重組表達(dá)載體，五種ALDH基因在大腸桿菌BL21宿主菌中獲得高效表達(dá)，發(fā)現(xiàn)重組ALDH2蛋白對乙醛催化活性最高[6]。Yao等通過大腸桿菌表達(dá)酵母源ALDH重組蛋白，比天然分離蛋白酶活性高4倍[7]。黃錕等研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)重組ALDH2蛋白酶活比畢赤酵母分泌表達(dá)重組蛋白高近3倍[8-9]。李青松等采用昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)sf9高效表達(dá)人ALDH2及其突變基因型重組蛋白，發(fā)現(xiàn)二者對乙醛催化活性差異顯著[10]。但限于如蛋白表達(dá)過程容易降解、蛋白表達(dá)濃度低、重組蛋白較難純化、融合蛋白標(biāo)簽較大或重組蛋白酶活性較低等因素，ALDH2重組蛋白獲得需新技術(shù)支持。

本研究將ALDH2基因融合到N-末端含有內(nèi)含肽和幾丁質(zhì)結(jié)合域的雙功能標(biāo)簽處，用表達(dá)載體pTYB11在原核表達(dá)宿主E.coli ER2566中表達(dá)AL?DH2蛋白，優(yōu)化表達(dá)條件，以期得到活性AL?DH2，為ALDH2應(yīng)用和基礎(chǔ)研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒

大腸桿菌E.coil JM109由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生物制藥實驗室保存。E.coil ER2566和表達(dá)載體pTYB11購自NEB公司。克隆載體pGEM-T購自Promega公司。

1.1.2主要試劑

M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司；Trizol購自MIC公司；LA Taq DNA聚合酶，Eco RⅠ、XhoⅠ、T4DNA連接酶、IPTG、DEPC購自TaKaRa公司；過硫酸銨、DTT、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED購自Amersham Pharmacia Biotech公司。IMPACTTM-CN蛋白純化系統(tǒng)購自NEB公司。Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD）購自Gibco公司。

1.2方法

1.2.1人乙醛脫氫酶基因克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫人ALDH2基因序列（No. JF432260），運用Primer 5.0軟件設(shè)計一對擴(kuò)增引物，上游引物P1（25 bp）：5' GAATTCTCAGCCGC CGCCACCCAGG 3'（下劃線處為Eco RⅠ識別位點）；下游引物P2（27 bp）：5' CTCGAGTTATGAG TTCTTCTGAGGCAC 3'（下劃線處為XhoⅠ識別位點），由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。Trizol試劑抽提流產(chǎn)胎兒肝組織總RNA，以O(shè)ligo dT(18)為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用ALDH2基因特異引物PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃1 min，63℃1 min，72℃2 min，35個循環(huán)后，72℃再延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴(kuò)增片段長度。

1.2.2原核表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

DNA純化試劑盒回收PCR產(chǎn)物，再將其克隆至pGEM-T載體，構(gòu)建克隆載體pGEM-ALDH2，轉(zhuǎn)化入E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定陽性重組后，由上海英駿（Invitrogen）生物技術(shù)有限公司測序。自重組克隆載體pGEM-ALDH2用Eco RⅠ和XhoⅠ切下ALDH2序列片段，電泳回收目的片段并連接至經(jīng)相應(yīng)酶處理的原核表達(dá)載體pTYB11，構(gòu)建重組表達(dá)載體pTYB11-ALDH2，轉(zhuǎn)化入E. coli ER2566感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒作酶切鑒定及DNA測序驗證。

1.2.3融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

挑取陽性重組菌ER2566-pTYB11-ALDH2單菌落接種含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日以1∶100擴(kuò)配，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD600達(dá)0.3，加入IPTG至終濃度為1.0 mmol·L-1，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h，收集菌體，重懸于PBS（pH 7.4），以煮沸裂解法破裂菌體作

SDS-PAGE分析，鑒定表達(dá)產(chǎn)物。

1.2.4融合蛋白最佳表達(dá)條件確立

采用正交方式對重組ALDH2誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化。參考文獻(xiàn)[11]方法，選擇4因素3水平，進(jìn)行正交試驗（見表1）。

根據(jù)表1，設(shè)計9組試驗，誘導(dǎo)表達(dá)后，收集菌體，煮沸法裂解細(xì)菌，菌體蛋白作SDS-PAGE分析。利用Sage Creation影像分析系統(tǒng)對電泳凝膠結(jié)果分析，獲得目的蛋白占全菌蛋白百分含量，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件。

表1因素水平設(shè)計Table 1 Design of the levels and factors

1.2.5 Western Blot分析

將pTYB11空載體誘導(dǎo)蛋白和重組ALDH2融合蛋白按常規(guī)方法進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂乳的封閉液37℃封閉2 h，棄去封閉液，PBST洗滌3次，每次10 min。一抗使用Anti-Chitin抗體（兔源），4℃孵育過夜，用無磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10 min。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，37℃孵育1 h。棄去二抗，無磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次10 min。加入顯色底物，暗室曝光，觀察目的條帶。

1.2.6融合蛋白純化及定量

1.2.6.1包涵體溶解

首先將分析以包涵體形式表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行包涵體提取和溶解。重組陽性菌按照最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件誘導(dǎo)后，離心收集菌體。稱菌體濕重，每克菌體加入3 mL細(xì)胞裂解緩沖液Ⅰ，重懸菌體，加入4 μL 100 mmol·L-1PMSF，加入溶菌酶至終濃度1 mg·mL-1，攪動20 min，加入4 mg脫氧膽酸，繼續(xù)攪動20 min，加入20 μL 1 mg·mL-1DNase I，37℃放置30 min。細(xì)胞裂解液4℃12 000 r·min-1離心15 min。棄上清，將每份沉淀重懸在100 μL含0.1 mmol·L-1PMSF（現(xiàn)用現(xiàn)加）的包涵體溶解緩沖液Ⅰ中，于室溫放置1 h。向懸液中加入9倍體積包涵體溶解緩沖液Ⅱ，KOH將pH維持在10.7，于室溫放置30 min。HCl將pH調(diào)至8.0，室溫下至少放置30 min。于室溫以12 000 r·min-1離心15 min，將沉淀重懸于100 μL去離子水中。

1.2.6.2融合蛋白復(fù)性

按1∶10比例向包涵體溶解液中緩慢加入含2 mmol·L-1還原型谷胱甘肽和0.2 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽復(fù)性緩沖液，室溫孵育2 h；PBS（pH 8.0）4℃透析過夜。

1.2.6.3融合蛋白純化

先將純化柱用10個柱床體積的Column Buffer 4℃平衡過夜，然后將復(fù)性蛋白溶液緩慢加入已平衡的純化柱中。融合蛋白純化過程參照IM?PACTTM-CN蛋白純化系統(tǒng)說明書。

1.2.6.4純化融合蛋白濃縮

聚乙二醇（PEG）8000對純化后融合蛋白濃縮，用于活性鑒定。

1.2.6.5純化融合蛋白定量

按照Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒說明書測定濃縮融合蛋白含量。

1.2.7重組酶活力檢測

由于NADH、NAD+分別在340和260 nm處有最大吸收峰，對以NAD+為輔酶的各種脫氫酶類，均可通過測定光吸收值在340 nm處變化，定量測定反應(yīng)酶活性。酶活體系：1 mol·L-1Tris- HCl buffer（pH 8. 0）20 μL，20 mmol·L-1β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（β-NAD）20 μL，100 mmol·L-1乙醛13.3 μL，3 mol·L-1KCl 6.7 μL，1 mol·L-1β-巰基乙醇2 μL，酶液5 μL。加水133 μL調(diào)整終體積為200 μL。將每分鐘內(nèi)OD340發(fā)生0.001數(shù)量變化定義為一個活力單位（U）。

2結(jié)果與分析

2.1克隆載體和表達(dá)載體構(gòu)建與鑒定

從人胎肝組織經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，獲得約1 500 bp特異性基因片段，與預(yù)期目的基因片段相符（見圖1A）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收連接到pGEM-T載體，重組質(zhì)粒pGEM-T-ALDH2經(jīng)Eco RⅠ、XhoⅠ雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳可見約1 500 bp特異性條帶（見圖1B）。經(jīng)DNA序列分析，表明克隆載體構(gòu)建成功。將陽性質(zhì)粒pGEM-T-ALDH2雙酶切后獲得含有黏性末端的片段，凝膠回收后連接pTYB11載體。重組質(zhì)粒pTYB11-ALDH2經(jīng)酶切鑒定（見圖1C）和測序分析，表明表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M-DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-ALDH2基因PCR產(chǎn)物；2-重組質(zhì)粒pGEM-T-ALDH2電泳條帶；3-pGEM-T-ALDH2的Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；4-pGEM-T-ALDH2 PCR產(chǎn)物；5-pTYB11空載體質(zhì)粒；6-pTYB11的Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；7-重組質(zhì)粒pTYB11-ALDH2；8-pTYB11-ALDH2的Eco RⅠ和XhoⅠ雙酶切產(chǎn)物；9-pTYB11-ALDH2 PCR產(chǎn)物M-DNA MW Standard Marker; 1-PCR product of ALDH2 gene; 2-The vector pGEM-T-ALDH2; 3-Product from pGEM-T-AL?DH2 digested by Eco RⅠand XhoⅠ; 4-PCR product of ALDH2 gene from the plasimads pGEM-T-ALDH2; 5-The vector pTYB11; 6-Product from pTYB11 digested by Eco RⅠand XhoⅠ; 7-The vector pTYB11-ALDH2; 8-Product from pTYB11-ALDH2 digested by Eco RⅠand XhoⅠ; 9-PCR product of ALDH2 gene from the plasimads pTYB11-ALDH2圖1重組克隆載體pGEM-T-ALDH2和表達(dá)載體pTYB11-ALDH2構(gòu)建和鑒定Fig. 1 Construction and identification of the recombinant plasmids pGEM-T-ALDH2 and pTYB11-ALDH2

2.2重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和表達(dá)條件優(yōu)化

將構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ER2566誘導(dǎo)表達(dá)，30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后收集菌體，經(jīng)SDS-PAGE分析，對照菌ER2566-pTYB11表達(dá)出55 ku標(biāo)簽蛋白，構(gòu)建的重組菌ER2566-pTYB11-ALDH2表達(dá)約110 ku重組蛋白，與理論值相符，表明成功在大腸桿菌系統(tǒng)中表達(dá)Chitin-ALDH2融合蛋白（見圖2A）。

通過正交試驗（見表2），SDS-PAGE分析最佳菌體濃度、誘導(dǎo)時間、溫度和IPTG濃度，4個影響因素中，影響目的蛋白在宿主細(xì)胞表達(dá)的主次因素為C>B>D>A，最優(yōu)因素水平組合為A2B2C2D2，即誘導(dǎo)OD值0.3，誘導(dǎo)溫度30℃，IPTG濃度1.0 mmol·L-1，誘導(dǎo)時間4 h。采用此組合進(jìn)行驗證試驗，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白濃度占總蛋白的19.16%。

2.3 Western Blot檢測

利用Anti-Chitin抗體進(jìn)行Western Blot檢測，結(jié)果如圖2B顯示，對照菌表達(dá)分子質(zhì)量為55 ku Chitin標(biāo)簽蛋白，陽性菌在250和98 ku間有一條明顯的特異性顯色反應(yīng)帶，分子質(zhì)量約110 ku，兩種蛋白比較發(fā)現(xiàn)，陽性菌表達(dá)分子質(zhì)量約55 ku目的蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符。

2.4目的蛋白純化

幾丁質(zhì)（Chitin）純化柱純化，目的蛋白從Chi?tin-ALDH2融合蛋白中裂解出來，獲得分子質(zhì)量約為55 ku的重組ALDH2，與目的蛋白相符，如圖2C所示。經(jīng)Bradford法定量濃縮的純化蛋白質(zhì)量濃度為0.045 mg·mL-1。

A-重組蛋白ALDH2表達(dá)。M1-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-對照菌ER2566-pTYB11誘導(dǎo)前；2-陽性重組菌ER2566-pTYB11-ALDH2誘導(dǎo)前；3-空載體誘導(dǎo)后菌體總蛋白；4-重組菌誘導(dǎo)后菌體總蛋白B-融合蛋白Western Blot鑒定。M2-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-Chitin標(biāo)簽蛋白；2-ALDH2融合蛋白C-融合蛋白純化。M1-蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-純化的重組蛋白ALDH2；2-ER2566-pTYB11-ALDH2包涵體A-Expression of recombinant ALDH2. M1-Protein molecular weight marker; 1-Control bacteria non-induced; 2-Non-in?duced positive bacteria; 3-Protein from induced ER2566-pTYB11; 4-Protein from induced ER2566-pTYB11-ALDH2B-Western Blot analysis of fusion protein. M2-Protein molecular weight marker; 1-Protein chitin; 2-Recombinant fusion protein ALDH2C-Purification of fusion protein. M1-Protein molecular weight marker; 1-Purified protein ALDH2 after cleavage; 2-Inclusion body of the ER2566-pTYB11-ALDH2圖2融合蛋白ALDH2表達(dá)、鑒定和純化Fig. 2 Expression, identification and purification of fusion protein ALDH2

表2正交試驗結(jié)果分析Table 2 Result analysis of orthogonal experiment

2.5重組酶活性檢測

酶活測定體系中，反應(yīng)總體積為0.2 mL，加入酶體積為5 μL，每分鐘讀取1次OD340，以O(shè)D340對反應(yīng)時間作圖（見圖3）。計算獲得反應(yīng)初始階段（前5 min）的OD340變化約為-0.013 min-1，取其絕對值，即ΔOD340=0.013 min-1。每毫升酶液活性為20.8 U，純化ALDH2比活力為462 U·mg-1。

圖3重組蛋白ALDH2酶活性吸光曲線Fig. 3 Activity-absorbency of recombinant protein ALDH2

3討論與結(jié)論

人乙醛脫氫酶2是人體代謝乙醇的關(guān)鍵酶，催化乙醛與乙酸間轉(zhuǎn)化反應(yīng)，在細(xì)胞解毒和分子生物學(xué)及相關(guān)疾病檢測方面也多有應(yīng)用[12]。由于天然ALDH2來源限制，通過微生物發(fā)酵表達(dá)高活性、高純度重組ALDH2蛋白引起關(guān)注。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白翻譯后修飾和易于上清表達(dá)特點，陳瑞等通過搖瓶發(fā)酵表達(dá)以畢赤酵母GS115為表達(dá)宿主菌，以質(zhì)粒pPIC9K為載體重組ALDH2蛋白，發(fā)酵上清蛋白表達(dá)量為8.40 mg·L-1，比酶活為11.35 mU·mL-1[13]。黃錕等利用畢赤酵母分泌表達(dá)ALDH2時，由于酵母生長周期較長，得到目的蛋白活性最高僅達(dá)0.115 U·mL-1[8]。趙錦等通過畢赤酵母分泌表達(dá)ALDH2蛋白時，表達(dá)過程中蛋白降解并失活嚴(yán)重，只有低于28℃才有活性，因此胞內(nèi)表達(dá)人ALDH2蛋白，酶活比分泌表達(dá)的重組蛋白高近3倍，為0.315 U·mL-1[9]?；诖竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)、易操作性和價格低廉等因素，孫莉等通過融合SUMO蛋白標(biāo)簽在較低的誘導(dǎo)溫度(16℃)下實現(xiàn)ALDH2可溶性表達(dá)，但未測定酶活性[14]。黃娟等通過構(gòu)建重組表達(dá)載體pET32a- ALDH2，以包涵體形式表達(dá)目的蛋白，經(jīng)包涵體變性、復(fù)性和純化，獲得77 μg·mL-1純化蛋白，酶活性達(dá)到1.449 U·mL-1。但pET32a標(biāo)簽含有大腸桿菌TrxA基因編碼的109個氨基酸的硫氧還蛋白，與ALDH2蛋白一起融合表達(dá)無法去除[5]。

因此，本研究在國內(nèi)首次利用內(nèi)含肽原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)ALDH2蛋白，結(jié)合IMPACTTM-CN蛋白純化系統(tǒng)，使ALDH2蛋白僅冗余簡單的幾個載體氨基酸，純化后重組蛋白與天然蛋白一致，最大限度降低標(biāo)簽蛋白對目的蛋白活性影響。pTYB11載體構(gòu)建通過誘導(dǎo)產(chǎn)生具有自我剪切活性的蛋白質(zhì)元件內(nèi)含肽，其C端有多克隆位點，使目的蛋白融合于內(nèi)含肽之后；內(nèi)含肽含有幾丁質(zhì)結(jié)合域（CBD），利用幾丁質(zhì)作為親和層析介質(zhì)，可方便分離融合蛋白。當(dāng)有巰基存在時，內(nèi)含肽自我剪切活性將融合蛋白與靶蛋白間的連接鍵切斷，經(jīng)洗脫，釋放出目的蛋白[15]。成熟人ALDH2蛋白分子質(zhì)量約55 ku，原核表達(dá)載體pTYB11-ALDH2誘導(dǎo)后表達(dá)的融合蛋白約110 ku，經(jīng)內(nèi)含肽自我剪切后的純化蛋白約55 ku，與預(yù)測一致。因此，通過內(nèi)含肽融合表達(dá)系統(tǒng)及自我剪切機(jī)制，本研究成功獲得與天然ALDH2蛋白相似的重組蛋白。按照經(jīng)典酶活性測定方法，獲得20.8 U·mL-1高活性純化蛋白。

大腸桿菌表達(dá)重組目的蛋白影響因素主要有培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件，后者包括菌種種齡、接種量、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間、誘導(dǎo)時機(jī)和溫度等。通過統(tǒng)計學(xué)方法可從眾多因素中篩選出重要影響因素[16-17]。本文采用多因素交叉設(shè)計試驗優(yōu)化重組大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)條件，篩選出誘導(dǎo)表達(dá)最優(yōu)化組合，使重組蛋白表達(dá)濃度占總蛋白的19.16%，實現(xiàn)ALDH2融合蛋白高效表達(dá)。雖然優(yōu)化多種表達(dá)條件，ALDH2融合蛋白表達(dá)仍以包涵體形式存在，采用變性和復(fù)性技術(shù)手段將導(dǎo)致蛋白得率下降和酶活性損失。因此，通過原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)無冗余氨基酸的ALDH2蛋白是今后研究方向。

[參考文獻(xiàn)]

[ 1 ] Yoshida A, Rzhetsky A, Hsu L C, et al. Human aldehyde dehydro?genase gene family[J]. Eur J Biochem, 1998, 251(3): 549-557.

[ 2 ] Black W, Vasiliou V. The aldehyde dehydrogenase gene super?family resource center[J]. Hum Genomics, 2009, 4(2): 136-142.

[ 3 ]王焱,陳銀蓉,鞏燕,等.急性心肌梗死患者血漿乙醛脫氫酶2活性水平的變化及意義[J].上海醫(yī)學(xué), 2010(5): 413-416.

[ 4 ] Itoga S, Nanmoku T, Uchimoto T, et al. Comparative analyses of four different methods of genotyping ALDH2[J]. Alcohol Clin Exp Res, 2004, 28(8S): 117-122.

[ 5 ]黃娟,王荷花,張小驥,等.人乙醛脫氫酶2的原核表達(dá)及其活性的鑒定[J].生物技術(shù)通報, 2014(12): 201-206.

[ 6 ] Gross A, Ong T R, Grant R, et al. Human aldehyde dehydroge?nase-catalyzed oxidation of ethylene glycol ether aldehydes[J]. Chem Biol Interact, 2009, 178(1-3): 56-63.

[ 7 ] Yao Z, Zhang C, Lu F, et al. Gene cloning, expression, and char?acterization of a novel acetaldehyde dehydrogenase from Issatch?enkia terricola strain XJ-2[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(5): 1999-2009.

[ 8 ]黃錕,趙玉鳳,趙錦,等.人乙醛脫氫酶2基因在畢赤酵母SMD1168中的表達(dá)研究[J].中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010(1): 44-48.

[ 9 ]趙錦,趙玉鳳,黃錕,等.人乙醛脫氫酶2基因在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J].化學(xué)與生物工程, 2010(2): 50-52.

[10]李青松,李一峰,邵敏華,等.不同基因型的人類乙醛脫氫酶2基因的克隆及表達(dá)(英文)[J].復(fù)旦學(xué)報:自然科學(xué)版, 2004(6): 1079-1083.

[11] Donovan R S, Robinson C W, Glick B R. Review: Optimizing in?ducer and culture conditions for expression of foreign proteins un?der the control of the lac promoter[J]. J Ind Microbiol, 1996, 16 (3): 145-154.

[12] Vasiliou V, Nebert D W. Analysis and update of the human alde?hyde dehydrogenase (ALDH) gene family[J]. Hum Genomics, 2005, 2(2): 138-143.

[13]陳瑞,方劍,王靜涵.乙醛脫氫酶2基因在畢赤酵母中的表達(dá)和分離純化[J].生物加工過程, 2013(6): 34-37.

[14]孫莉,李智博,秦飛,等.人乙醛脫氫酶2的原核表達(dá)及其條件優(yōu)化[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2012(2): 123-128.

[15]畢智麗. pTYB11載體的應(yīng)用及其重組子破菌條件的研究[J].科技信息, 2012(5): 20-34.

[16] Zhu Y, Pan J, Qiu J, et al. Optimization of nutritional require?ments for mycelial growth and sporulation of entomogenous fun?gus Aschersonia aleyrodis Webber[J]. Braz J Microbiol, 2008, 39 (4): 770-775.

[17] Orlovs'Ka I V, Hrabchenko N I, Spivak M. Optimization of culti?vation conditions for strains of Escherichia coli-a producer of recombinant alpha-2b-interferon[J]. Mikrobiol Z, 2007, 69(2): 50-55.

Expression of recombinant human aldehyde dehydrogenase 2 by using intein induced expression system

LIU Xiangyu, YIN Jiechao, LI Jingpeng (School of Life Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Abstract:To achieve the recombinant human aldehyde dehydrogenase 2 proteins with high activity, the ALDH2 gene was amplified by PCR. The cloned and expressed plasmids pGEM-T-ALDH2 and pTYB11-ALDH2 were constructed. The recombinant expression plasmids was induced by IPTG. Through orthogonal experiment, the results showed that the optimal strategy was the expression conditions (OD 0.3, 1.0 mmol·L-1IPTG, 30℃, 4 h). Because all the target proteins were almost expressed in the form of inclusion body, the bioactive acetaldehyde dehydrogenase was obtained by means of degeneration and renaturation for the inclusion body. Using the IMPACTTM-CN protein purification system, the similar natural ALDH2 protein was obtained from the self cleavage of fused intein protein, and the protein concentration was 0.045 mg·mL-1by the Bradford method. The activity of purification protein was 462 U·mg-1.

Key words:human aldehyde dehydrogenase 2; intein; recombinant expression; inclusion body; IMPACTTM-CN protein purification system

*通訊作者：李景鵬，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為基因工程與分子生物學(xué)。E-mail: lijingpeng@163.com

作者簡介：劉向宇（1979-），女，實驗師，碩士，研究方向為分子生物學(xué)。E-mail: lily_liu1979@126.com

基金項目：黑龍江省科技廳應(yīng)用技術(shù)研究與開發(fā)計劃項目（2013GC13C105）

收稿日期：2015-09-14

中圖分類號：Q78

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1005-9369（2016）01-0038-07