野生亞東鮭群體遺傳多樣性及其種質(zhì)來源研究

戶　國，王　芳，周建設(shè)，潘瑛子，李寶海，谷　偉，孫　鵬，白慶利，王炳謙*（.淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱　50070；.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，拉薩　850000）

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野生亞東鮭群體遺傳多樣性及其種質(zhì)來源研究

戶國1，王芳1，周建設(shè)2，潘瑛子2，李寶海2，谷偉1，孫鵬1，白慶利1，王炳謙1*
（1.淡水魚類育種國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱150070；2.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，拉薩850000）

摘要：以褐鱒（Salmo trutta）日本品系和亞東鮭群體為研究對(duì)象，通過測定上述兩個(gè)群體8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體D-loop基因多態(tài)性，綜合分析日本品系和亞東鮭群體遺傳多樣性及其種質(zhì)來源。結(jié)果表明，褐鱒日本品系等位基因數(shù)為2~10個(gè)，亞東鮭群體為4~9個(gè)，平均有效等位基因數(shù)分別為3.1304和3.8988；觀測雜合度范圍分別為0.3404~0.7128和0.1020~0.8776，其中褐鱒日本品系平均觀測雜合度為0.5612，亞東鮭群體為0.5510，期望雜合度分別為0.4671~0.7794和0.5216~0.7932；褐鱒日本品系多態(tài)信息含量（PIC）為0.3680~0.7440，平均為0.5964，而亞東群體PIC為0.4660~0.8370，平均為0.5926。研究分析褐鱒、亞東鮭線粒體D-loop基因序列和歐洲褐鱒已知五個(gè)地理居群D-loop基因序列，日本品系褐鱒和亞東鮭與歐洲大西洋居群褐鱒聚在一支，親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞：亞東鮭；微衛(wèi)星；線粒體；遺傳多樣性

戶國,王芳,周建設(shè),等.野生亞東鮭群體遺傳多樣性及其種質(zhì)來源研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 47(1): 58-65.

Hu Guo, Wang Fang, Zhou Jianshe, et al. Study on genetic diversity and germplasm sources of wild Yadong salmon population[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2016, 47(1): 58-65. (in Chinese with English abstract)

褐鱒（Salmo trutta）是鮭科魚類中重要養(yǎng)殖種之一，國內(nèi)僅在西藏亞東地區(qū)有分布，稱為亞東鮭（Salmo trutta fario），系與褐鱒同物異名種。19世紀(jì)后期引入我國西藏亞東地方，經(jīng)長期適應(yīng)，亞東鮭已能在自然環(huán)境中繁殖生長并維持穩(wěn)定種群數(shù)量。肉質(zhì)鮮美，無肌間刺，是西藏重要經(jīng)濟(jì)魚類，也是西藏自治區(qū)二級(jí)保護(hù)動(dòng)物[1-3]。

近年來，亞東鮭全人工繁殖獲得成功后，即開始向亞東河中增殖放流。但是，該河段長度僅數(shù)十公里，如果不對(duì)增殖放流苗種群體遺傳多樣性水平有效監(jiān)測管理，野生群體將有可能受到放流養(yǎng)殖群體遺傳干擾，導(dǎo)致遺傳多樣性水平降低。孟瑋等研究結(jié)果表明，目前亞東鮭人工養(yǎng)殖群體和野生群體遺傳多樣性差異不大，均處于中低水平，提示上述潛在風(fēng)險(xiǎn)可能已成事實(shí)[4-6]。豪富華等基于微衛(wèi)星、線粒體D-loop和Cyt b基因多態(tài)性的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，亞東鮭與引種自丹麥的褐鱒養(yǎng)殖群體遺傳差異不顯著[7]。已知褐鱒自然分布于包括整個(gè)歐洲大陸以及北非地中海沿岸國家，根據(jù)生態(tài)類型主要分為河鱒和海鱒。褐鱒有極為復(fù)雜的種群遺傳結(jié)構(gòu)，大體上可分為五大居群，亞得里亞海居群、地中海居群、多瑙河居群、大西洋居群，還有一個(gè)分化程度達(dá)到近緣種水平的斑鱒（Marble trout, Salmo marmoratus）群體[8]。由于先前研究較關(guān)注亞東鮭種群內(nèi)遺傳多樣性，未對(duì)我國已形成養(yǎng)殖規(guī)模的其他褐鱒養(yǎng)殖品系遺傳特征系統(tǒng)評(píng)估，也沒有對(duì)亞東鮭具體來源于褐鱒何種居群進(jìn)行探究和確認(rèn)。作為引進(jìn)定居形成的土著種，如果能明確種質(zhì)來源及其與國內(nèi)主要養(yǎng)殖褐鱒品系遺傳分化關(guān)系，對(duì)亞東鮭種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)利用具有重要意義。

本研究首先篩選8對(duì)多態(tài)性較高的SSR標(biāo)記，分析已在國內(nèi)形成養(yǎng)殖規(guī)模的褐鱒日本品系和野生亞東鮭群體遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)；另外，利用線粒體D-loop區(qū)多態(tài)性構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，試圖追溯亞東鮭種質(zhì)來源，探討利用褐鱒日本品系開展亞東鮭替代養(yǎng)殖、降低野生亞東鮭采捕強(qiáng)度可行性的遺傳基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開展野生亞東鮭種質(zhì)資源保護(hù)、優(yōu)勢性狀挖掘利用和遺傳育種等提供遺傳學(xué)理論。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選取中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗(yàn)站養(yǎng)殖褐鱒日本品系群體94尾個(gè)體和西藏農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖課題組提供野生亞東鮭49尾個(gè)體，采集鰭條，提取基因組DNA，濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，紫外分光光度法測量濃度，然后稀釋成合適濃度貯存，以備PCR擴(kuò)增使用。

1.2微衛(wèi)星引物、D-loop來源及其擴(kuò)增條件

查閱相關(guān)文獻(xiàn)獲得合適的微衛(wèi)星引物[8-12]，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成，引物序列及引物退火溫度見表1。PCR產(chǎn)物先采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用10%非變性聚丙烯酰胺凝膠恒電壓下電泳分離，電泳緩沖液為1×TBE。電泳結(jié)束后，0.1%硝酸銀染色，掃描記錄電泳條帶。根據(jù)電泳圖譜及PCR產(chǎn)物長度利用相關(guān)軟件分析并判定基因型。

用于擴(kuò)增線粒體D-loop基因片段引物分別為LN20（5' ACC ACT AGC ACC CAA AGC TA 3'）和HN20（5' GTG TTA TGC TTT AGT TAA GC 3'）[13]，由上海英濰捷基貿(mào)易有限公司合成。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，然后用凝膠成像儀作成像分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物滿足測序需要，送往上海英濰捷基貿(mào)易有限公司作雙向測序。

表1 8對(duì)微衛(wèi)星引物序列及退火溫度Table 1 Sequences and anneal temperatures of eight pairs of microsatellite DNA primers

1.3數(shù)據(jù)分析處理

1.3.1褐鱒日本品系和亞東鮭微衛(wèi)星分析

利用POPGENE 3.2軟件分別計(jì)算觀測等位基因數(shù)（A）、有效等位基因數(shù)（Ae）、等位基因頻率、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Nei氏遺傳距離和遺傳相似系數(shù)等參數(shù)。利用Software Cervus 3.0軟件計(jì)算群體多態(tài)性信息含量（PIC）。

1.3.2褐鱒日本品系和亞東鮭線粒體D-loop分析

利用SeqMan軟件對(duì)測序成功序列拼接，從GenBank中查找并下載歐洲5個(gè)褐鱒居群D-loop基因部分單倍型序列（見表2），與本研究中褐鱒日本品系和亞東鮭線粒體D-loop序列一起分析。利用Clustal W軟件對(duì)已知序列和GenBank中下載D-loop序列對(duì)位排列，對(duì)齊后刪除兩端冗余序列，一致序列保留，使用MEGA5軟件作系統(tǒng)發(fā)育分析，利用鄰近法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，以大西洋鮭作為外群，并利用bootstrap test檢驗(yàn)所得聚類結(jié)果可靠性。

表2用于系統(tǒng)進(jìn)化分析的歐洲褐鱒線粒體DNA控制區(qū)單倍型檢索號(hào)Table 2 GenBank accession numbers for the D-loop haplotypes used in phylogenetic analysis for brown trout

2結(jié)果與分析

2.1基于微衛(wèi)星多態(tài)性信息的褐鱒日本品系和亞東鮭遺傳多樣性

試驗(yàn)選取8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)褐鱒日本品系和亞東鮭群體擴(kuò)增，所有標(biāo)記均擴(kuò)增出特異性清晰條帶。圖1為微衛(wèi)星位點(diǎn)Str85INRA多態(tài)性分別在褐鱒日本品系和亞東群體中部分電泳結(jié)果。兩個(gè)群體8個(gè)位點(diǎn)中，共檢測出62個(gè)等位基因，褐鱒日本品系和亞東鮭等位基因數(shù)均為47個(gè),但等位基因大小及分布在2個(gè)群體間存在很大差異。兩者共有等位基因數(shù)32個(gè),占等位基因總數(shù)51.61%。褐鱒日本品系等位基因數(shù)為2~10個(gè)，亞東鮭群體為4~ 9個(gè)，平均有效等位基因數(shù)分別為3.1304和3.8988；觀測雜合度范圍分別為0.3404~0.7128和0.1020~0.8776，其中褐鱒日本品系平均觀測雜合度為0.5612，亞東鮭群體為0.5510，期望雜合度分別為0.4671~0.7794和0.5216~0.7932；褐鱒日本品系中多態(tài)信息含量（PIC）為0.3680~0.7440，平均為0.5964，而亞東群體PIC為0.466~0.837，平均為0.5926。哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg）平衡檢驗(yàn)結(jié)果表明，褐鱒日本品系群體有4個(gè)位點(diǎn)偏離平衡（P<0.05），亞東鮭群體有7個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡（P<0.05），具體結(jié)果見表3。

圖1 Str85INRA位點(diǎn)部分?jǐn)U增結(jié)果Fig. 1 Partial amplified results of Str85INRA

表3 8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在褐鱒和亞東群體中遺傳多樣性分析Table 3 Genetic diversity of eight microsatellite loci in two populations

基于等位基因頻率,計(jì)算2個(gè)群體間遺傳相似系數(shù)和遺傳距離。該研究中2個(gè)群體間遺傳相似系數(shù)為0.6436，遺傳距離為0.4407。F-statistics分析結(jié)果2個(gè)群體Fst為0.0098~0.2131，平均為0.0778。利用MEGA5.0軟件分別構(gòu)建褐鱒日本品系和亞東鮭個(gè)體UPGMA（Unweighted pair-group method with arithmetic means）聚類圖（見圖2），結(jié)果顯示褐鱒日本品系比亞東鮭群體有更多層次遺傳結(jié)構(gòu)。

2.2基于D-loop基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹

本研究中D-loop測序褐鱒日本品系樣品23個(gè)，亞東鮭32個(gè)，雙向測序，拼接，日本品系拼接成功17個(gè)，亞東鮭19個(gè)。日本品系褐鱒有6個(gè)單倍型，亞東鮭有4個(gè)單倍型，共計(jì)有10種單倍型，已提交至GenBank，不同單倍型登錄號(hào)及在群體中分布見表4。

分析褐鱒和亞東鮭線粒體控制區(qū)基因序列（見表4）和歐洲褐鱒D-loop基因序列（見表2），利用MEGA 5軟件鄰近法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹（見圖3），結(jié)果顯示本試驗(yàn)中日本品系褐鱒和亞東鮭與歐洲大西洋居群的褐鱒聚在一支，親緣關(guān)系最近，提示這兩個(gè)品系均可能引種自大西洋居群，與基于微衛(wèi)星分析結(jié)果一致。

表4本研究中褐鱒日本品系與亞東鮭線粒體D-loop區(qū)測序結(jié)果Table 4 Accession numbers of mtDNA D-loop region haplotypes sequenced in the two strains in this study

J表示褐鱒日本品系，Y表示亞東鮭，數(shù)字為個(gè)體編號(hào)，用于系統(tǒng)進(jìn)化分析的歐洲褐鱒線粒體DNA控制區(qū)單倍型的檢索號(hào)見表2J represents Japanese brown trout strain, Y represents Yadong salmon, the GenBank accession numbers for the D-loop haplotypes used in phylogenetic analysis were shown in Table 2圖3基于D-loop基因序列構(gòu)建分子系統(tǒng)樹Fig. 3 Molecular phylogenetic tree based on D-loop gene sequences

3討論

3.1亞東鮭地理分布及研究現(xiàn)狀

亞東鮭是我國西藏地區(qū)珍稀魚類，已有亞東鮭胚胎發(fā)育、養(yǎng)殖生物學(xué)、群體生態(tài)學(xué)等方面的基礎(chǔ)性研究[14-18]。但由于西藏自治區(qū)亞東縣地處中印邊境，交通不便。亞東鮭是西藏自治區(qū)二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，取樣需獲得西藏自治區(qū)政府相關(guān)部門批準(zhǔn)；亞東河谷落差大，地勢極為險(xiǎn)峻，水流湍急，加之近年來發(fā)生地震和多次泥石流災(zāi)害，導(dǎo)致亞東鮭樣本不易取得，開展亞東鮭研究課題組取得樣品量均不大，且采樣年度不統(tǒng)一。截至目前，國內(nèi)只有3~4家單位具備取得亞東鮭樣本的機(jī)會(huì)和條件，并開展亞東鮭種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。僅利用目前這幾家單位的研究結(jié)果相互印證，試圖勾勒出近10年來亞東鮭野生資源的遺傳多樣性變化趨勢。本研究中使用的另外一個(gè)遺傳材料褐鱒日本品系是本課題組自日本引進(jìn)并推廣至全國18省區(qū)試驗(yàn)養(yǎng)殖，已形成商業(yè)養(yǎng)殖規(guī)模。該品系育種核心群體由本課題組獨(dú)家保有，屬創(chuàng)新性種質(zhì)材料。

3.2野生亞東鮭群體遺傳多樣性變化趨勢

利用微衛(wèi)星標(biāo)記反映群體遺傳多樣性重要指標(biāo)，主要有效等位基因數(shù)（Ne）、雜合度（Ho）和多態(tài)信息含量（PIC）等。遺傳雜合度能反映群體在各個(gè)位點(diǎn)遺傳變異程度，是度量群體遺傳變異的理想?yún)?shù)。De Woody等通過統(tǒng)計(jì)78種淡水和海水魚類524個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)指數(shù)變化范圍數(shù)據(jù)顯示淡水魚類平均雜合度和等位基因數(shù)分別為0.45±0.25和9.1± 6.1[19]。本研究中，褐鱒日本品系和亞東鮭平均期望雜合度分別為0.6517和0.7171，有效等位基因數(shù)分別為3.1304和3.8988，與李福貴等發(fā)現(xiàn)的野生亞東鮭平均期望雜合度為0.6417一致[6]，均顯著低于豪富華等研究結(jié)果[7]，本研究中個(gè)體親緣關(guān)系聚類分析結(jié)果顯示亞東鮭群體遺傳結(jié)構(gòu)簡單。揭示亞東鮭野生群體在近10年時(shí)間中，遺傳多樣性水平顯著下降，正經(jīng)歷遺傳衰退過程。

本研究中，哈迪-溫伯格平衡檢測結(jié)果顯示8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中褐鱒日本品系群體和亞東鮭群體分別有50%和87.5%位點(diǎn)偏離哈迪-溫伯格平衡。2個(gè)群體Fst平均為0.0778，表明2個(gè)群體間有一定分化，即7.78%為群體間遺傳變異，而群體內(nèi)遺傳變異為92.22%，說明褐鱒日本品系和亞東鮭群體間變異水平較低，大部分變異來自于各種群體內(nèi)。據(jù)此，建議亞東鮭資源開發(fā)利用中可部分使用種群數(shù)量充足的日本品系維持養(yǎng)殖規(guī)模。

3.3亞東鮭種質(zhì)來源分析

褐鱒在歐洲存在許多野生種群，種群遺傳學(xué)研究已確定5個(gè)主要居群[4]。Bernatchez認(rèn)為所有現(xiàn)存多瑙河居群的原始祖先來自黑海及相關(guān)支流[20]，并假設(shè)亞得里亞海居群最有可能起源于巴爾干半島或安那托利亞。最近關(guān)于地中海鱒魚歷史生物地理學(xué)研究也提供更多證據(jù)支持上述觀點(diǎn)。D-loop基因是線粒體基因組中進(jìn)化最快區(qū)域，具有較高突變率形成多態(tài)性[21]，適用于考查長時(shí)間跨度的同一物種間的親緣關(guān)系水平。本研究中測得褐鱒日本品系和亞東鮭線粒體D-loop序列均與大西洋居群聚到一起，遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近。同時(shí)，褐鱒日本品系和亞東鮭之間D-loop基因共享單倍型很少，但均和大西洋居群聚在一支；基于微衛(wèi)星數(shù)據(jù)群體遺傳分化分析也顯示二者之間群體遺傳分化水平較低。

4結(jié)論

綜上所述，本研究利用微衛(wèi)星和線粒體D-loop區(qū)多態(tài)性信息開展野生亞東鮭和褐鱒日本品系養(yǎng)殖群體遺傳多樣性和種質(zhì)來源分析。結(jié)果顯示，亞東鮭野生群體遺傳結(jié)構(gòu)較為簡單，分子遺傳學(xué)證據(jù)顯示亞東鮭可能來源于褐鱒大西洋居群。

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Study on genetic diversity and germplasm sources of wild Yadong salmon population

HU Guo1, WANG Fang1, ZHOU Jianshe2, PAN Yingzi2, LI Baohai2, GU Wei1, SUN Peng1, BAI Qingli1, WANG Bingqian1(1. National and Local Joint Engineering Laboratory of Freshwater Fish Breeding, Heilongjiang River Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China; 2. Tibet Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences, Lhasa 850000, China)

Abstract:In this study, with brown trout Japanese strain and Yadong salmon (Salmo trutta fario) as objects, the genetic structure and diversity of these two strains were studied with eight polymorphic microsatellite loci and mitochondrial DNA D-Loop sequences to analysis the system evolution and genetic relationship in the study. The results showed that the number of alleles at each locus in two populations ranged from two to ten and four to nine, respectively. The average number of effective alleles was 3.1304 and 3.8988. The observed heterozygosity varied from 0.3404 to 0.7128 and 0.1020 to 0.8776, respectively. The expected heterozygosity was 0.4671-0.7794 and 0.5216-0.7932.The polymorphic information content (PIC) of Japanese strain ranged from 0.3680 to 0.7440, with an average of 0.5964. And the PIC of Yadongbook=1,ebook=64salmon varied from 0.4660 to 0.8370, with an average of 0.5926. In this study, both Japanese strain and Yadong salmon had the closest phylogenetic lineages with Atlantic populations among the five known geographic European brown trout populations based mitochondrial D-loop sequences. The results suggested Yadong salmon wild resources might be suffering a sharp decline processing, and the genetic diversity of wild Yadong salmon should be maintained and strengthened in resource conservation and management.

Key words:Yadong salmon; microsatellite; mitochondria DNA; genetic diversity

*通訊作者：王炳謙，研究員，研究方向?yàn)槔渌~養(yǎng)殖與遺傳育種。E-mail: wbqfish@163.com

作者簡介：戶國（1984-），男，助理研究員，博士，研究方向?yàn)榉肿舆z傳與動(dòng)物育種。E-mail: huguo@126.com

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)（201403012）；農(nóng)業(yè)部948引進(jìn)項(xiàng)目（2014-Z57）

收稿日期：2015-07-22

中圖分類號(hào)：S961

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1005-9369（2016）01-0058-08