N末端Strep蛋白標(biāo)簽表達(dá)載體的構(gòu)建和應(yīng)用

石　禹，吉宏張，包小峰

(南通大學(xué)1.附屬第三人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室、2．藥學(xué)院，江蘇南通　226006)

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N末端Strep蛋白標(biāo)簽表達(dá)載體的構(gòu)建和應(yīng)用

石禹1，2，吉宏張2，包小峰2

(南通大學(xué)1.附屬第三人民醫(yī)院臨床藥學(xué)室、2．藥學(xué)院，江蘇南通226006)

中國(guó)圖書分類號(hào): R341; R345．57; R374; R394．2; R977. 6

摘要:目的構(gòu)建攜帶N末端Strep( NS)蛋白標(biāo)簽的表達(dá)載體;在表達(dá)載體中構(gòu)建衣原體RNA聚合酶亞基重組蛋白并表達(dá)。方法采用PCR的方法，通過(guò)引物引入NS蛋白標(biāo)簽和新的多克隆位點(diǎn)替代pET21c-DH質(zhì)粒中原有的T7蛋白標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)，選擇新引入的Not I酶切位點(diǎn)進(jìn)行PCR產(chǎn)物的環(huán)化自連，轉(zhuǎn)化DH-5α細(xì)菌后篩選陽(yáng)性菌株，PCR法和基因測(cè)序法鑒定新構(gòu)建的表達(dá)載體;在新構(gòu)建表達(dá)載體的BamH I和Sal I位點(diǎn)之間分別插入衣原體RNA聚合酶核心酶的α、β、β'亞基，獲得表達(dá)NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株ArcticExpress，篩選陽(yáng)性表達(dá)菌株，并用考馬斯亮藍(lán)染色、Western blot等法鑒定融合蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果成功構(gòu)建了攜帶NS蛋白標(biāo)簽的pET21c-NSMCS載體，并成功將其應(yīng)用于衣原體RNA聚合酶核心酶亞基融合蛋白的構(gòu)建及表達(dá)。結(jié)論獲得穩(wěn)定表達(dá)NS-α、NS-β、NS-β'融合蛋白的表達(dá)載體，為研究衣原體基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控奠定了良好的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:Strep蛋白標(biāo)簽;表達(dá)載體;融合蛋白;克隆; RNA聚合酶;衣原體

包小峰( 1979－)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:衣原體轉(zhuǎn)錄調(diào)控與抗衣原體化合物，通訊作者，E-mail: baoxi@ ntu．edu．cn

蛋白標(biāo)簽是指利用DNA體外重組技術(shù)與目標(biāo)蛋白基因融合表達(dá)的一種多肽或蛋白，常用于目標(biāo)蛋白的構(gòu)建、表達(dá)、檢測(cè)、示蹤及純化［1］。在重組蛋白研究過(guò)程中，通常使用親和性標(biāo)簽(如His、GST、Strep)等。主要因這些親和標(biāo)簽?zāi)苁怪亟M蛋白的純化、檢測(cè)、固定等變得更方便易行。同時(shí)，蛋白的表達(dá)和純化都可以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；?］。本文主要介紹蛋白質(zhì)N末端Strep標(biāo)簽表達(dá)載體的構(gòu)建以及其在研究衣原體RNA聚合酶核心酶中的應(yīng)用。

1　材料

1．1質(zhì)粒、菌株質(zhì)粒pET21c-DH( His標(biāo)簽被去除的pET21c，美國(guó)羅格斯-新澤西州立大學(xué)的范輝宙教授惠贈(zèng))，DH-5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自于南京諾唯贊生物科技有限公司，ArcticExpress表達(dá)菌株的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)Stratagene公司。

1．2工具酶與主要試劑限制性內(nèi)切酶、T4連接酶購(gòu)自NEB(北京)有限公司;高保真Phanta DNA聚合酶、ClonExpress II非連接依賴型快速克隆試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司; SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷( IPTG)均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司; 2×Taq PCR MasterMix為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

2　N末端Strep蛋白標(biāo)簽表達(dá)載體的構(gòu)建

2．1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)pET21c-DH質(zhì)粒載體的序列，采用Primer Premier 6. 0軟件進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)，插入Strep標(biāo)簽的同時(shí)將pET21c-DH( Fig 1A)中原有的多克隆位點(diǎn)( multiple cloning sites，MCS)替換為( Fig 1B)所示的多克隆位點(diǎn)，預(yù)計(jì)得到產(chǎn)物pET21c-NS-MCS質(zhì)粒。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如下，上游引物: 5'-TATATGCGGCCGCAATTGAATTCCTCGAGTGAGATC CGGCTGCTAAC-3';下游引物:5'-TATATGCGGCCGCGTCGACCATGGATCCTTTTTCGAACTG-3'。其中GCGGCCGC為環(huán)化連接PCR產(chǎn)物所需的Not I酶切位點(diǎn)。按照以下體系進(jìn)行PCR反應(yīng): 200 nmol ·L－1上游引物、200 nmol·L－1下游引物、30 ng pET21c-DH模板質(zhì)粒、0. 2 U Phanta DNA聚合酶，ddH2O補(bǔ)足至50 μL;在PCR儀上按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增: 95℃預(yù)變性3 min，95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸6 min，共24個(gè)循環(huán)。得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶指示約在5 400 bp( Fig 2A)，為預(yù)期的MCS序列片段帶。然后使用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒膠回收得到帶有MCS序列的載體片段。

2．2酶切和連接反應(yīng)將以上膠回收后的序列片段進(jìn)行單酶切反應(yīng)，體系如下:序列片段30 μL，10× CutSmart緩沖液5 μL，Not I限制性內(nèi)切酶1 μL，加ddH2O至50 μL，37℃水浴酶切3 h。使用SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收，得到酶切序列片段。對(duì)該酶切序列片段使用T4連接酶進(jìn)行自連反應(yīng)，體系如下:酶切序列片段8 μL，10 ×T4連接酶緩沖液1 μL，T4連接酶1 μL，16℃連接過(guò)夜。

Fig 1 pET21c-DH plasmid sequence to be replaced( A) and newly introduced Strep-tag and MCS sequence in pET21c-NS-MCS Plasmid( B)

2．3重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩選和鑒定將連接產(chǎn)物與DH-5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌混合，42℃熱休克60 s后，涂布到含氨芐青霉素(終濃度為100 mg·L－1)的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)14 h，挑選得到的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證上游引物: 5'-GCGAAATTAATACGACTCAC-3'［pET-21c-Reverse ( 313-332)］;下游引物: 5'-GGGGTTATGCTAGTTATTGC-3'［pET-21c-Forward ( 61-80)］，反應(yīng)酶為2× Taq PCR Master Mix共25 μL體系。在PCR儀上按照如下程序進(jìn)行處理: 94℃3 min，95℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，26個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到約220 bp大小的條帶( Fig 2B)，與預(yù)期大小相符。

Fig 2 Vector fragment containing new MCS sequence( A) and identification of pET21c-NS-MCS clone( B) detected by agarose gel electrophoresis

2．4重組質(zhì)粒的測(cè)序分析挑取經(jīng)PCR鑒定的陽(yáng)性菌落，接種到10 mL含100 mg·L－1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h放大后送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)得到的重組質(zhì)粒pET21c-NS-MCS 中NS標(biāo)簽和多克隆位點(diǎn)序列和位置與預(yù)先設(shè)計(jì)的完全一致( Fig 3)。

3　N末端Strep標(biāo)簽表達(dá)載體在研究衣原體RNA聚合酶核心酶中的應(yīng)用

衣原體是一類真核細(xì)胞內(nèi)寄生，具有獨(dú)特發(fā)育周期，并能通過(guò)細(xì)菌濾器的原核細(xì)胞型微生物［4］。在自然界中傳播很廣泛，常寄生于人類、鳥類及哺乳動(dòng)物，并可引起多種疾病。其特殊的生長(zhǎng)條件和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控所需要的遺傳基礎(chǔ)系統(tǒng)的缺少妨礙了對(duì)衣原體的深入研究［5］。

現(xiàn)代分子生物學(xué)證實(shí)轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)的第一步，也是最關(guān)鍵的一步，其中催化轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控過(guò)程中占有重要的地位［6］。通常的RNA聚合酶是一種由多個(gè)蛋白亞基組成的復(fù)合酶，包括α、β、β'、σ等亞基。其中α亞基決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄;β亞基含有三磷酸核苷的結(jié)合位點(diǎn); β'亞基含有與DNA模板相結(jié)合的位點(diǎn);σ亞基與轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的識(shí)別有關(guān)［7］。通過(guò)質(zhì)粒載體的研究我們已經(jīng)證實(shí)GrgA是衣原體獨(dú)有的轉(zhuǎn)錄激活因子，在衣原體生長(zhǎng)發(fā)育周期中扮演著十分重要的角色［3］。但目前關(guān)于GrgA與衣原體RNA聚合酶關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道很少，已發(fā)現(xiàn)GrgA可以和衣原體DNA和RNA聚合酶的σ66亞基結(jié)合［3，8］，但與RNA聚合酶核心酶亞基的關(guān)系都是未知的。本文通過(guò)構(gòu)建N末端Strep標(biāo)簽表達(dá)載體，為我們研究GrgA與衣原體RNA聚合酶核心酶各亞基間的相互關(guān)系提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

3．1構(gòu)建攜帶NS標(biāo)簽的衣原體RNA聚合酶的α、β和β'亞基為了提高效率，我們采用ClonExpress技術(shù)，它是一種簡(jiǎn)單、快速并且高效的DNA定向克隆技術(shù)，可將插入片段PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。首先根據(jù)GenBank中已收錄的沙眼衣原體L2血清型來(lái)源的衣原體RNA聚合酶的α亞基基因( GenBank Accession: NC_010287. 1 903145-904278)、β亞基基因( GenBank Accession: NC_010287. 1 673171-676929)、β'亞基基因( Gen-Bank Accession: NC_010287. 1 668956-673146)，由Primer Premier 6. 0軟件進(jìn)行PCR引物設(shè)計(jì)。α亞基引物序列如下:上游引物: BamH I-RpoA-5'f: 5'-CCTCAGTTCGAAAAAGGATCCATGTCGGATAGTTC ACACA-3';下游引物: Sal I-RpoA-3' f: 5'-TTCAATT GCGGCCGCGTCGACTTATCCCTTGGTATTTTTACTC-3'。β亞基引物序列如下:上游引物: BamH I-RpoB-5' f:5'-CCTCAGTTCGAAAAAGGATCCATGTTCAAG TGCCCGG-3';下游引物: Sal I-RpoB-3'f: 5'-TTCAATTGCGGCCGCGTCGACTTAAGCATCTACTACCATAGG G-3'。β'亞基引物序列如下:上游引物: BamHIRpoC-5' f:5'-CCTCAGTTCGAAAAAGGATCCATGTTCAGAGAAGGTTCTCG-3';下游引物: Sal I-RpoC-3' f:5'-TTCAATTGCGGCCGCGTCGAC GGCAGATCTTTAACCTG-3'。以上引物中GGATCC為BamH I識(shí)別位點(diǎn); GTCGAC為Sal I識(shí)別位點(diǎn);模板為沙眼衣原體L2血清型基因組DNA( genomic DNA，gDNA)。PCR反應(yīng)體系與條件同上。得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)( Fig 4A)，膠回收后作為插入片段。

將上述pET21c-NS-MCS質(zhì)粒進(jìn)行BamH I、Sal I限制性內(nèi)切酶雙酶切，37℃水浴酶切3 h后，將酶切產(chǎn)物于瓊脂糖凝膠電泳分離純化( Fig 4B)，膠回收得到載體片段。

Fig 3 pET21c-NS-MCS Plasmid sequencing results( A) and sequence comparison( B)

Fig 4 Insertion fragment( A) and vector fragment( B) of construction NS-α of NS-β、NS-β' detected by Agarose gel electrophoresis

將以上3個(gè)插入片段分別與載體片段按摩爾比4: 1進(jìn)行混合，加入Clon-Express重組酶ExnaseTMII 37℃水浴反應(yīng)30 min。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH-5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌后，涂布到相應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃恒溫箱培養(yǎng)14 h，挑選得到的菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。各挑選一株經(jīng)鑒定為陽(yáng)性的菌落接種放大后送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果無(wú)突變(驗(yàn)證結(jié)果此處省略)。

3．2衣原體NS-α、NS-β和NS-β'融合蛋白的表達(dá)

將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株ArcticE-xpress，涂布于含相應(yīng)抗性和慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。d 2挑選陽(yáng)性克隆，接種到5 mL含相應(yīng)抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)12 h至對(duì)數(shù)成長(zhǎng)期后按1∶100的比例取2. 5 mL至250 mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃、220 r·min－1振蕩培養(yǎng)約3 h放大至光密度( OD)為0. 8后，加入1 mmol·L－1IPTG，180 r· min－113℃低溫振蕩表達(dá)12 h。高速離心8 000 r· min－1收集細(xì)菌沉淀，加入含25 mmol·L－14-羥乙基哌嗪乙磺酸( Hepes)、300 mmol·L－1氯化鈉的非變性細(xì)菌裂解液10 mL，超聲裂解細(xì)菌后12 000 r· min－1離心收集上清，即得到目標(biāo)蛋白粗樣品，Western blot( Fig 5A)及考馬斯亮藍(lán)染色( Fig 5B)檢測(cè)結(jié)果顯示相應(yīng)亞基的融合蛋白，表明攜帶NS標(biāo)簽的衣原體RNA聚合酶的α、β和β'亞基表達(dá)載體成功構(gòu)建并表達(dá)。

Fig 5 Western blot( A) and Coomassie bright blue staining( B) used to detect expression of NS-α，NS-β，NS-β' Fusion Protein

4　討論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的蛋白標(biāo)簽技術(shù)在檢測(cè)和純化目的蛋白、蛋白定位和轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)相互作用以及構(gòu)象改變等研究中發(fā)揮重要作用［9］。其中Strep蛋白標(biāo)簽由僅8個(gè)氨基酸組成，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性通常沒(méi)有影響，同時(shí)具有高選擇性和易于控制的結(jié)合性，適合從真核或原核表達(dá)體系中純化strep標(biāo)簽蛋白［10］。在此基礎(chǔ)上開發(fā)的Strep-tag/Strep-Tactin系統(tǒng)現(xiàn)已成為廣泛應(yīng)用的蛋白親和層析系統(tǒng)之一。其可與多種不同的基質(zhì)偶聯(lián)，使Strep-tag融合蛋白得以在生理?xiàng)l件下親和純化。與其他tag相比，這些溫和的純化參數(shù)能保存蛋白質(zhì)的生物活性，并經(jīng)進(jìn)一步層析后即可產(chǎn)出超過(guò)99%的純度［11］。

設(shè)計(jì)pET21c-NS-MCS質(zhì)粒載體中新的多克隆位點(diǎn)時(shí)充分考慮覆蓋本研究課題所在實(shí)驗(yàn)室常用并已購(gòu)買的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，為進(jìn)一步構(gòu)建缺失部分序列的衣原體RNA聚合酶亞基融合蛋白提供了一個(gè)相對(duì)“多能”的中介質(zhì)粒載體，同時(shí)我們?cè)赟trep蛋白標(biāo)簽的前面加入一個(gè)新的Nde I酶切位點(diǎn)( Fig 1B)，這樣在構(gòu)建不帶Strep標(biāo)簽甚至替換其它親和性標(biāo)簽衣原體RNA聚合酶各亞基時(shí)也同樣可以利用這一質(zhì)粒載體［12］。另外本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建pET21c-NS-MCS質(zhì)粒載體時(shí)利用的是Not I限制性內(nèi)切酶環(huán)化連接，新的多克隆位點(diǎn)Not I限制性內(nèi)切酶所處位置較有利于引物的設(shè)計(jì)，而原有多克隆位點(diǎn)會(huì)造成引物過(guò)長(zhǎng)，這樣PCR產(chǎn)物的效率、目的融合蛋白的序列突變率可能會(huì)產(chǎn)生問(wèn)題。

融合蛋白技術(shù)主要是為了獲得大量標(biāo)準(zhǔn)融合蛋白而進(jìn)行的有目的性的基因融合和蛋白表達(dá)方法［13］。在實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)該多考慮幾種構(gòu)建融合蛋白常用的融合方式，從中篩選出效率比較高的連接方式。比如以上我們?cè)跇?gòu)建攜帶NS標(biāo)簽的衣原體RNA聚合酶的α、β和β'亞基時(shí)所采用的ClonExpress技術(shù)就明顯比T4連接酶連接的方式效率高很多，具體表現(xiàn)在瓊脂糖膠回收的產(chǎn)物濃度、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌的效率、目的克隆的陽(yáng)性率等方面。本次實(shí)驗(yàn)很好的利用了融合蛋白和克隆技術(shù)，成功構(gòu)建了N末端帶有Strep標(biāo)簽的pET21c-NS-MCS質(zhì)粒，其含有適合進(jìn)一步構(gòu)建融合蛋白的多克隆位點(diǎn)，并將其成功應(yīng)用于衣原體RNA聚合酶核心酶亞基重組表達(dá)載體的構(gòu)建，為我們研究GrgA與衣原體RNA聚合酶各亞基間的相互作用提供了良好的基礎(chǔ)。

(致謝:本研究課題主要在南通大學(xué)藥學(xué)院生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室與南通大學(xué)附屬第三人民醫(yī)院肝病實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師和同學(xué)的幫助與支持，尤其感謝包小峰老師的細(xì)心指導(dǎo)與大力支持，吉宏張同學(xué)的全力協(xié)助與參與! )

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Construction and application of N-terminal Strep-tagged protein expression vector

SHI Yu1，2，JI Hong-zhang2，BAO Xiao-feng2
( 1．Dept of Clinical Pharmacy，the Third People's Hospital of Nantong University，Nantong Jiangsu 226006，China; 2．School of Pharmacology，Nantong University，Nantong Jiangsu 226006，China)

Abstract:AimsTo construct the N-terminal Streptagged ( NS-tagged) fusion protein expression vector，and to apply the vector to express NS-tagged fusion proteins of Chlamydia RNA polymerase subunit．Methods By using PCR method，NS fusion protein tag and a new multiple cloning sites ( MCS) were inserted into pET21c-DH plasmid by primers to replace the original T7 protein tag and MCS．The newly introduced Not I cutting site was chosen for self-ligation of PCR product．Then，the cyclized PCR product was transformed into DH-5α competent cells．The positive clones were selected by PCR and sequencing．To get NS-tagged fusion proteins of chlamydial RNA polymerase subunits，the α，β and β' subunits were inserted between BamH I and Sal I cutting sites of the newly constructed expression vector．Then，the NS-α，NS-β and NS-β' expression vectors were transformed into ArcticExpress expression cells．The fusion protein expression statuses of transformed cells were identified by Commassie blue staining and Western blot．ResultsThe NS-tagged fusion protein expression vector pET21c-NS-MCS was successfully constructed，and NS-α，NS-β and NS-β' fusion proteins were obtained by using this newly constructed expression vector．Conclusions In this project，we constructed an NS-tagged fusion protein expression vector and applied it to express NS-α，NS-β and NS-β' fusion proteins．Our study can lay a solid foundation for the study of transcriptional regulation of Chlamydia genes．

Key words:Strep-tag; expression vector; fusion protein; cloning; RNA polymerase; chlamydia

作者簡(jiǎn)介:石禹( 1984－)，男，碩士，主管藥師，研究方向:抗感染臨床藥學(xué)，E-mail: 935748481@ qq．com;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No 31370209，31400165) ;南通大學(xué)研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目( No 13025166) ;“青藍(lán)工程”資助項(xiàng)目

收稿日期:2015－09－29，修回日期: 2015－11－29

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0098－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．021