白介素-1β增加血腦腫瘤屏障通透性的作用機(jī)制

王　健，孫月明，秦麗娟

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山　063000)

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白介素-1β增加血腦腫瘤屏障通透性的作用機(jī)制

王健，孫月明，秦麗娟

(華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北唐山063000)

中國(guó)圖書分類號(hào): R322．81; R329．24; ; R392. 12; R977. 6

摘要:目的研究白介素-1β( interleukin-1β，IL-1β)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子( vascular endothelial growth factor，VEGF)、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin-1表達(dá)和質(zhì)膜微囊小凹的影響，初步探討IL-1β開放血腫瘤屏障的可能機(jī)制。方法利用Transwell制備體外血腫瘤屏障模型。Western blot法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)IL-1β對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF、腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)caveolin-1蛋白表達(dá)水平的影響。透射電鏡觀察腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)膜微囊小凹的數(shù)量，熒光素鈉滲出實(shí)驗(yàn)評(píng)估IL-1β對(duì)血腫瘤屏障通透性的影響。結(jié)果成功建立了體外血腫瘤屏障模型。當(dāng)IL-1β作用于體外血腫瘤屏障模型后，VEGF蛋白的表達(dá)量增加，于60min時(shí)達(dá)到峰值，至120min時(shí)恢復(fù)到初始狀態(tài)。體外血腫瘤屏障通透性亦于IL-1β作用60min時(shí)最大。另外，我們的研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，IL-1β作用于血腫瘤屏障模型60min時(shí)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中質(zhì)膜微囊結(jié)構(gòu)蛋白caveolin-1的蛋白表達(dá)水平及質(zhì)膜微囊小凹的數(shù)量達(dá)到峰值，其后減少，并于120min時(shí)恢復(fù)到未給藥狀態(tài)。結(jié)論IL-1β增加了血腫瘤屏障的通透性，此作用可能與IL-1β通過VEGF/caveolin-1途徑增加了質(zhì)膜微囊小凹數(shù)量有關(guān)。

關(guān)鍵詞:血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;白介素-1β;血腫瘤屏障; caveolin-1;膠質(zhì)瘤;質(zhì)膜微囊小凹

秦麗娟( 1975－)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向:腦腫瘤防治，通訊作者，E-mail: qinlj20012003@ 163．com。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤簡(jiǎn)稱膠質(zhì)瘤，是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種惡性腦腫瘤。目前臨床上對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療大多主張綜合治療，即臨床手術(shù)后配合放化療等，以此來延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間，遏制其復(fù)發(fā)［1－2］。在臨床膠質(zhì)瘤的治療過程中，由于血腫瘤屏障的存在，化療藥物無法直接進(jìn)入病灶，即使有少量進(jìn)入，也會(huì)因瘤組織內(nèi)化療藥物的有效濃度過低而達(dá)不到理想的治療效果。因此，如何使抗腫瘤藥物通過血腫瘤屏障進(jìn)入腫瘤組織，是目前臨床膠質(zhì)瘤治療亟待解決的問題之一［3］。

1　材料與方法

1．1主要試劑與儀器羊抗大鼠caveolin-1多克隆抗體(英國(guó)Abcam公司)，羊抗大鼠VEGF多克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)，C6細(xì)胞株和培養(yǎng)基(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)，電泳儀( DYY-TB，北京六一儀器廠)，半干式碳板轉(zhuǎn)移電泳槽( DYY-Ⅲ40C，北京六一儀器廠)，凝膠成像分析系統(tǒng)( Bio-Rad，美國(guó))，生物分子成像儀( Bio-Rad，美國(guó))。

1．2C6細(xì)胞培養(yǎng)用含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，37℃孵箱內(nèi)孵育，并通以5%CO2。

1．3原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)采用出生2 ～3 d的Wistar大鼠4只，75%酒精中浸泡1 min后斷頭取腦，分離鼠腦，置于預(yù)冷的D-Hank’s液中，剔除大血管和腦膜，將皮質(zhì)剪成1mm3的小塊，玻璃勻漿器勻漿后加入15%葡聚糖10 mL，10 000×g離心15 min后棄上清，保留底部“血管段”加入4 mL DMEM(含20% FBS)及1 mLⅡ型膠原酶( 5 g· L－1)，37℃水浴震蕩孵育10 min，1000 r·min－1離心5min后棄上清，加入較大量DMEM培養(yǎng)液輕柔吹打均勻，接種于已涂布基質(zhì)的35 mm一次性培養(yǎng)皿中，同時(shí)加入( 150～200) mg·L－1的ECGS，置于控溫在37℃并通以5%的CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)較密集后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1．4體外血腫瘤屏障模型的制備首先將2．0× 108個(gè)·L－1密度的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于Transwell小室的下層，并加入適量的培養(yǎng)基。2 h后翻轉(zhuǎn)小室，加入新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)，將大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞接種至Transwell小室的上室(約1．2×105個(gè)細(xì)胞)，繼續(xù)共培養(yǎng)4～7d后融合。此后，每2 d更換1次培養(yǎng)基。

1．5體外血腫瘤屏障模型跨膜電阻( TEER)值測(cè)定采用Millicell ERS伏特歐姆計(jì)檢測(cè)體外血腫瘤屏障模型的電阻。測(cè)量時(shí)將Millicell ERS伏特歐姆計(jì)模式置于歐姆檔，打開電源，將STX01電極插入Transwell，長(zhǎng)電極在外部，短電極在內(nèi)部，電極與培養(yǎng)皿垂直。細(xì)胞跨膜電阻值計(jì)算公式: TEER = (ΔΩ測(cè)定值－ΔΩ空白值)×ΔA。ΔΩ測(cè)定值為Transwell小室的上、下室之間電阻值，ΔΩ空白值為未培養(yǎng)細(xì)胞但是具有相同體積培養(yǎng)液的空白Transwell小室的上、下室間電阻值，ΔA為Transwell小室的上、下室之間膜的面積。

1．6熒光素鈉滲出實(shí)驗(yàn)測(cè)定血腫瘤屏障的通透性

測(cè)定前用無血清的DMEM培養(yǎng)液換液，加入100 mg·L－1熒光素鈉和0. 5 μg·L－1的IL-1β于Transwell下室，于不同時(shí)間點(diǎn)( 10、30、60、90和120 min)從Transwell下室內(nèi)取100μL培養(yǎng)液，用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)通過血腫瘤屏障模型的熒光素鈉量，用熒光強(qiáng)度間接反映血腫瘤屏障通透性。

1．7Western blot法動(dòng)態(tài)檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF、血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)caveolin-1的蛋白表達(dá)水平

體外血腫瘤屏障模型下室給予IL-1β( 0. 5 μg· L－1)后，收集不同時(shí)間點(diǎn)的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞和腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用Western blot法檢測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的VEGF和腦血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的caveolin-1的蛋白表達(dá)水平。PVDF膜置于WB爆光系統(tǒng)中曝光成像。對(duì)照組用PBS代替一抗。結(jié)果以蛋白表達(dá)強(qiáng)度表示，并通過分析各條帶IDV值來分析各組蛋白表達(dá)的變化。

1．8透射電鏡觀察質(zhì)膜微囊小凹數(shù)量變化收集對(duì)照組和IL-1β作用60min時(shí)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，用預(yù)冷的戊二醛固定，按透射電鏡要求制片，常規(guī)鉛鈾雙染色，電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變。

1．9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 11．5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。跨膜電阻值、VEGF和caveolin-1的表達(dá)水平均以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2　結(jié)果

2．1跨膜電阻值變化評(píng)估體外血腫瘤屏障模型是否成功建立體外血腫瘤屏障模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)是電阻值達(dá)到201Ω·cm2。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，體外屏障模型的TEER值從3 d開始增加，于8 d后趨于平穩(wěn)，至11 d達(dá)到了201Ω·cm2，即成功制備了體外血腫瘤屏障模型( Tab 1)。

2．2血腫瘤屏障的通透性變化IL-1β作用于血腫瘤屏障模型后，熒光素鈉滲出量增加，60 min時(shí)達(dá)最大值( Fig 1)。

Fig 1 Leakage of sodium fluorescein( n =15)

2．3IL-1β對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)的影響

IL-1β作用于體外血腫瘤屏障模型后，C6細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)開始增加，至IL-1β作用60min時(shí)表達(dá)量最多，其后減少( Fig 2)。

Fig 2 Effect of IL-1β on expression of VEGF in glioma cells( n =15)

Tab 1 TEER changes of blood tumor barrier model in vitro(±s，Ω·cm2，n =10)

Tab 1 TEER changes of blood tumor barrier model in vitro(±s，Ω·cm2，n =10)

Time/d 1_______ _____2_______ ______________________________________________________________________________________ ______3_4_5_6_7_8_9_10_11_12 TEER _(Ω·cm2)____________________________________________________________________________________________________________ _114±5　127±6　135±8　143±6　158±3　165±6　174±7　185±5　192±6　198±3　201±4　199±8

Fig 3 Effect of IL-1β on expression of caveolin-1 in brain microvascular endothelial cells( n =15)

2．5透射電鏡觀察質(zhì)膜微囊小凹數(shù)量變化經(jīng)IL-1β處理60min的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，其質(zhì)膜微囊小凹數(shù)量較對(duì)照組明顯增多( Fig 4)。

Fig 4 Changes of number of plasma membrane vesicles(×12 000)

3　討論

IL是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于白細(xì)胞或免疫細(xì)胞之間的一種細(xì)胞因子。它的主要作用是激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，引起炎癥介質(zhì)釋放，活化T細(xì)胞，刺激B細(xì)胞的增殖與分化，并在炎癥反應(yīng)中起到致熱源作用［4］。IL-1是一種分子多肽，有IL-1a及IL-1β兩種亞型，分子質(zhì)量皆為17. 5 ku。IL-1a由159個(gè)氨基酸組成，IL-1β含153個(gè)氨基酸。雖然兩者是由不同的基因分別編碼而成，但I(xiàn)L-1α和IL-1β具有同樣的親和力，都可以與相同的細(xì)胞表面受體相結(jié)合，發(fā)揮相同的生物學(xué)作用。

有研究證實(shí): IL-1β可以引起動(dòng)物可逆性的血腫瘤屏障損傷，在IL-1β過表達(dá)時(shí)，還可引起中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和中性粒細(xì)胞依賴性的血腫瘤屏障通透性增加。在本實(shí)驗(yàn)中，我們檢測(cè)了IL-1β作用于血腫瘤屏障后熒光素鈉滲出情況變化，發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠增加體外血腫瘤屏障模型的通透性，于60 min時(shí)變化最為明顯。我們前期的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也表明IL-1β與血腫瘤屏障的通透性增加有關(guān)，但其具體的分子作用機(jī)制尚不十分清楚［5］。

有研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β的主要作用部位是血管內(nèi)皮細(xì)胞［6－7］。而VEGF在血管內(nèi)細(xì)胞的增殖、遷移和體內(nèi)血管的形成過程中發(fā)揮著非常重要的作用［8－12］。我們的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，IL-1β可以引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)增多，且于IL-1β作用于血腫瘤屏障模型60min時(shí)達(dá)高峰，其后減少，此變化趨勢(shì)與IL-1β增加血腫瘤屏障通透性的時(shí)態(tài)變化相一致，因此我們推測(cè)，VEGF可能介導(dǎo)了IL-1β增加血腫瘤屏障通透性的過程。

血腫瘤屏障通透性的增加主要通過兩條途徑來實(shí)現(xiàn)，即跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑。本實(shí)驗(yàn)主要從跨細(xì)胞途徑即吞飲小泡的形成方面來研究VEGF對(duì)IL-1β增加血腫瘤屏障通透性的影響。Caveola與標(biāo)記蛋白caveolins一起合稱為Caveolae，廣泛存在于不同類型的細(xì)胞中。Caveolae最初在透射電鏡中顯示為“小孔”，而Yamada在1955年首次用細(xì)胞內(nèi)caveolae來描述膀胱內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的50～100nm胞質(zhì)膜的內(nèi)陷［13］。幾年后Palade也在血管內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了這種結(jié)構(gòu)，并稱為胞質(zhì)小囊泡［14］。Caveolae是質(zhì)膜上形成囊狀內(nèi)陷結(jié)構(gòu)的主要因素［15］，是caveolae發(fā)揮跨細(xì)胞內(nèi)吞作用的關(guān)鍵因子［16］。為此，本研究采用免疫蛋白印跡法檢測(cè)了IL-1β作用于腦血管內(nèi)皮細(xì)胞后caveolin-1蛋白表達(dá)的變化，發(fā)現(xiàn)IL-1β能夠上調(diào)質(zhì)膜微囊標(biāo)志蛋白caveolin-1的表達(dá)水平和質(zhì)膜微囊小泡的數(shù)量，且于IL-1β作用后60min時(shí)最多，這與IL-1β引起的VEGF表達(dá)變化和血腫瘤屏障通透性變化的時(shí)相相一致，提示IL-1β可能是通過膠質(zhì)瘤細(xì)胞釋放VEGF，VEGF再作用于鄰近的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞來上調(diào)質(zhì)膜微囊標(biāo)志蛋白caveolin-1的表達(dá)水平，進(jìn)而增加質(zhì)膜微囊小凹的數(shù)量，從而增加了血腫瘤屏障的通透性。

在VEGF影響IL-1β增加血腫瘤屏障通透性的過程中，可能還有其他因子或信號(hào)通路參與其中，這是我們今后需要進(jìn)一步探討的問題。

米九也曾給他出過主意：應(yīng)該把營(yíng)業(yè)部的所有人帶到寺廟里去，對(duì)著釋迦牟尼佛賭咒發(fā)誓沒有偷盜。當(dāng)時(shí)他也不是沒想過，可營(yíng)業(yè)部里好幾個(gè)都是漢族，而且自己雖然娶了個(gè)藏族老婆，可對(duì)賭咒發(fā)誓的事也不大相信。他后來還跟登子提過此事，登子也和他一個(gè)觀點(diǎn)，覺得誰(shuí)也不會(huì)在佛主前承認(rèn)自己偷了東西。

(致謝:本研究是在華北理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心完成，感謝實(shí)驗(yàn)中心為本研究提供實(shí)驗(yàn)平臺(tái)和技術(shù)支持，感謝實(shí)驗(yàn)中心所有老師的指導(dǎo)。)

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Mechanism of IL-1β enhance Blood-Brain Tumor Barrier permeability

WANG Jian，SUN Yue-ming，QIN Li-juan
( School of Basic Medical Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan Hebei 063000，China)

Abstract:AimTo study the effect of IL-1β on protein expression of vascular endothelial growth factor in glioma cells and plasma membrane microcapsule structure protein caveolin-1 and plasma membrane vesicles in brain microvascular endothelial cells，and preliminarity discuss the possible mechanism of IL-1β opening blood tumor barrier．Methods The tumor barrier model was established by transwell in vitro．The effect of IL-1β on the expression of VEGF in glioma cells and caveolin-1 in brain microvascular endothelial cells was dynamically monitored by Western blot．TEM was used to observe the number of plasma membrane vesicles of brain microvascular endothelial cells．Sodium fluorescein leakage test was used to assess the permeability of blood tumor barrier after IL-1β．ResultsThe tumor barrier model was successfully established by transwell in vitro．When IL-1β treated the model of blood tumor barrier，the expression of VEGF increased，and reached the peak at 60min，and recovered to the initial state at 120min．The permeability of the blood tumor barrier model was the highest at 60min．In addition，our results also found that，the protein expression of plasma membrane microcapsule structure protein caveolin-1 and number of plasma membrane vesicles in brain microcapsule endothelial cells reached peak at 60 min，subsequently reduced and returned to non drug state at 120min．ConclusionIL-1β increases blood tumor barrier permeability，which may be related to IL-1β increasing the number of plasma membrane vesicles through VEGF/caveolin-1 pathway．

Key words:VEGF; IL-1β; blood tumor barrier; caveolin-1; glioma; plasma membrane vesicles

作者簡(jiǎn)介:王健( 1989－)，男，碩士，研究方向:腦腫瘤防治;

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( No 81101912) ;河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研項(xiàng)目( No 2014195) ;河北省衛(wèi)生廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目( No 20150491) ;河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目( No 152777189)

收稿日期:2015－09－25，修回日期: 2015－11－25

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1001－1978( 2016) 01－0094－04

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．020