白藜蘆醇通過降低NF-κB p65乙?；徑獯笫笊窠?jīng)病理性疼痛

王依慰，劉清珍，陳春龍，支亦博，章　潔，李偉彥

( 1．徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，2．徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州　221004;3．南京軍區(qū)南京總醫(yī)院麻醉科，江蘇南京　210002)

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白藜蘆醇通過降低NF-κB p65乙?；徑獯笫笊窠?jīng)病理性疼痛

王依慰1，2，劉清珍3，陳春龍3，支亦博3，章潔1，2，李偉彥3

( 1．徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點實驗室，2．徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉與鎮(zhèn)痛應(yīng)用技術(shù)重點實驗室，江蘇徐州221004;3．南京軍區(qū)南京總醫(yī)院麻醉科，江蘇南京210002)

中國圖書分類號: R-332; R284．1; R322．81; R441．1; R745. 022; R977. 6

摘要:目的觀察白藜蘆醇對腰5脊神經(jīng)結(jié)扎( L5spinal nerve ligation，SNL)大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其相關(guān)機制。方法90只♂SD大鼠隨機分為6組( n =15)。正常組;假手術(shù)組;疼痛組;高、中和低劑量白藜蘆醇組。正常組不做處理，假手術(shù)組僅暴露腰5脊神經(jīng)，其余各組行SNL。高、中、低劑量組分別將300、30、3 μg白藜蘆醇溶于10 μL的100%二甲基亞砜溶劑中，于SNL術(shù)后d 4經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管給藥，每天1次，連續(xù)給藥4 d。術(shù)后1、3、5、7、9、11、14 d測定各組大鼠熱縮足潛伏期( paw withdrawal latency，PWL)。行為學(xué)測試結(jié)束后處死大鼠，取腰段脊髓。Western blot檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子1 ( silent information regulator 1，SIRT1)和乙?；痯65蛋白的表達(dá)水平，采用免疫熒光法測定脊髓背角活化的核因子κB ( NF-κB)表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，疼痛組大鼠術(shù)后PWL明顯降低( P＜0. 05)，SIRT1蛋白含量明顯減少( P＜0. 05)，乙酰化p65蛋白含量和活化的NF-κB表達(dá)明顯增多( P＜0. 05)。與疼痛組比較，高、中劑量組大鼠給藥后PWL 和SIRT1蛋白含量明顯升高( P＜0. 05)，乙?；痯65蛋白含量和活化的NF-κB表達(dá)明顯減少( P＜0. 05)。結(jié)論鞘內(nèi)注射白藜蘆醇可緩解神經(jīng)病理性疼痛，其機制可能與激活SIRT1，促進(jìn)p65去乙?；?，從而抑制NF-κB活化有關(guān)。

關(guān)鍵詞:神經(jīng)病理性疼痛;白藜蘆醇;沉默信息調(diào)節(jié)因子1; NF-κB; p65;乙酰化

李偉彥( 1965－)，男，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向:麻醉與鎮(zhèn)痛的基礎(chǔ)與臨床，Tel: 025-80860147，E-______mail: weiyanlee@ sina．com

神經(jīng)病理性疼痛( neuropathic pain，NeP)發(fā)展早期NF-κB被激活，NF-κB信號通路在脊髓中被活化，參與傷害性信息的傳遞和疼痛的產(chǎn)生［1］。p65 是NF-κB的一個亞單位，其翻譯后乙?；揎椖軌蚓?xì)地調(diào)控NF-κB的轉(zhuǎn)錄活動。沉默信息調(diào)節(jié)因子1( silent information regulator 1，SIRT1)是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；?。研究表明，SIRT1能直接去乙酰化NF-κB的p65亞單位，降低其乙?；?，抑制NF-κB的激活［2］。白藜蘆醇屬于多酚化合物，具有抗氧化、抗自由基、抗炎等生物學(xué)活性，已有文獻(xiàn)報道白藜蘆醇是SIRT1的激動劑［3］。因此，我們推測白藜蘆醇可能通過激活SIRT1，促進(jìn)p65去乙?；?，從而抑制NF-κB活化來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究觀察L5脊神經(jīng)結(jié)扎( spinal nerve ligation，SNL)大鼠脊髓內(nèi)SIRT1和p65蛋白乙?；降淖兓⑻接慡IRT1激活劑白藜蘆醇對神經(jīng)病理性疼痛的作用和可能機制。

1　材料與方法

1．1實驗動物和分組清潔級成年♂SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供。實驗所實行操作均符合國際疼痛研究會的準(zhǔn)則，并且經(jīng)動物倫理委員會許可。將鞘內(nèi)置管成功的大鼠按照隨機數(shù)表法分為6組( n = 15)，正常組( Naive組)、假手術(shù)組( Sham組)、疼痛對照組( SNL組)、高劑量白藜蘆醇治療組( High組)、中劑量白藜蘆醇治療組( Middle組)、低劑量白藜蘆醇治療組( Low組)。

1．2鞘內(nèi)置管大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉50 μg·g－1。參考Milligan等［4］的方法，常規(guī)消毒后在大鼠腰5-6間隙縱行切開，依次分離筋膜和肌肉，顯露L5白色椎板，摘除部分棘突后用5號針尖破脊間膜。用鑷子將一段長為15 cm的PE-10導(dǎo)管(寧波市科技園區(qū)安來軟件科技有限公司，中國)經(jīng)L5-L6向上置入2 cm，出現(xiàn)鼠尾側(cè)向甩動視為穿刺成功。導(dǎo)管外端經(jīng)皮下隧道至頸項部引出皮膚后固定，熱熔封口。術(shù)后單籠飼養(yǎng)大鼠以防止導(dǎo)管脫落。置管成功3 d后，剔除運動功能異常的大鼠，經(jīng)導(dǎo)管注入2%利多卡因15 μL，如注射后30 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)雙后肢麻痹現(xiàn)象說明鞘內(nèi)置管成功。

1．3SNL模型采用Kim等［5］法制備SNL模型，即自大鼠背部L5棘突水平縱行切開皮膚，依次分離組織暴露右側(cè)L5橫突，剪去L5部分橫突，顯露L5脊神經(jīng)后用5-0絲線結(jié)扎。用生理鹽水清洗傷口后，分層縫合傷口，消毒，繼續(xù)飼養(yǎng)。Naive組不做處理，Sham組僅暴露L5脊神經(jīng)不結(jié)扎。

1．4給藥方案High、Middle、Low組分別將300、30、3 μg白藜蘆醇溶于10 μL的100%二甲基亞砜( DMSO)溶劑中，于SNL術(shù)后d 4經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管給藥，每天1次，連續(xù)給藥4 d。SNL組則在相同時間點經(jīng)鞘內(nèi)導(dǎo)管注射10 μL 100% DMSO。

1．5行為學(xué)測定SNL術(shù)后1、3、5、7、9、11、14 d，固定于上午8: 00～10: 00，采用熱痛測痛儀器( Model390，IITC Science. Inc，美國)，參照Hargreaves等［6］方法，對所有大鼠右足測定熱縮足潛伏期( paw withdrawal latency，PWL)。測試前使大鼠在25℃安靜環(huán)境中適應(yīng)約30 min。測痛儀以5 mm光斑照射大鼠右側(cè)第一足趾下著力點，照射時間不超過20s，以免出現(xiàn)灼傷。測試期間及時清除大鼠排泄在玻璃板上的大小便，以免影響熱痛閾反應(yīng)時間。每只大鼠均測量6次，每次間隔5min，去掉最大值和最小值，取4次測量值的平均值作為PWL。

1．6標(biāo)本采集SNL術(shù)后d 7，各組大鼠完成疼痛行為學(xué)測試后隨機選擇3只大鼠，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉80 μg·g－1處死。用于Western blot檢測的標(biāo)本用300～400 mL生理鹽水快速沖洗血液，之后取出脊髓的腰膨大段快速放入液氮中短暫保持。用于免疫熒光檢測的標(biāo)本則再用400～500 mL 4%多聚甲醛先快后慢的灌注，取出脊髓的腰膨大段后，將其放入4%的多聚甲醛中后固定3 h，隨后轉(zhuǎn)入30%蔗糖中脫水2 d。

1．7Western blot將脊髓組織剪切成細(xì)小的碎片。取適量的RIPA裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mmol·L－1。按照每20mg組織加入150～250 mL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。蛋白定量后，加入SDS上樣緩沖液，沸水煮浴使其變性后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加一抗:兔抗大鼠SIRT1( 1∶2000，Abcam，美國)或兔抗大鼠乙酰化NF-κB p65( 1∶1000，Pierce，美國)，4℃孵育過夜。復(fù)溫后，棄一抗，TBST清洗5min×6次，加HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗( 1∶1000，Cell Signaling Technology公司，美國)室溫孵育1 h，TBST清洗5min×6次，暗室內(nèi)加顯色底物顯色曝光。定影內(nèi)參為β-actin ( 1∶1000，Cell Signaling Technology公司，美國)。以目的條帶灰度值與βactin灰度值的比值反映SIRT1和乙?；痯65的表達(dá)水平。所得條帶經(jīng)Adobe公司Photoshop軟件半定量分析處理。

1．8免疫組織熒光染色取多聚甲醛固定的L4～6腰膨大標(biāo)本，經(jīng)蔗糖溶液梯度脫水后用冰凍切片機進(jìn)行連續(xù)切片，片厚20μm。5%的BSA封閉1h，隨后加入磷酸化p65單克隆抗體( 1∶200，Santa Cruz Biotechnology，美國)，4℃孵育過夜。用PBS清洗5min×3次后，加入異硫氰酸熒光素標(biāo)記的二抗( 1 ∶300，Santa Cruz Biotechnology，美國)，室溫避光孵育2h，漂洗3次。每個標(biāo)本隨機抽取5張切片，普通熒光顯微鏡下觀察。

1．9統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 16. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示。大鼠行為學(xué)結(jié)果采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，SIRT1、乙?；痯65蛋白表達(dá)采用單因素方差分析。組間兩兩比較采用LSD檢驗。

2　結(jié)果

2．1大鼠PWL的變化6組大鼠術(shù)前PWL差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0. 05)。Sham組術(shù)側(cè)后肢PWL各時間點未見明顯改變( P＞0. 05)。SNL組大鼠與Sham組比較，PWL明顯降低( P＜0. 05) ; High、Middle組與SNL組比較，大鼠術(shù)后各時間點PWL增高( P＜0. 05)，但與Sham組相比仍存在統(tǒng)計學(xué)意義( P＜0. 05)，提示鞘內(nèi)注射300、30 μg白藜蘆醇均可以減輕SNL大鼠的熱痛敏反應(yīng)。SNL組和Low組術(shù)后各時間點PWL差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0. 05)，提示鞘內(nèi)注射3 μg白藜蘆醇無鎮(zhèn)痛作用。見Fig 1。

Fig 1 Changes of PWL in all rats

2．2大鼠脊髓SIRT1蛋白和乙?；痯65的表達(dá)變化SNL術(shù)后d 7，與Sham組相比，SNL組脊髓腰膨大中的SIRT1蛋白含量明顯降低( P＜0. 05)。與SNL組相比，High、Middle組脊髓腰膨大中SIRT1含量明顯升高( P＜0. 05)，而Low組SIRT1蛋白含量無明顯變化( P＞0. 05)。見Fig2A。與Sham相比，SNL組脊髓腰膨大中的乙?；痯65的含量明顯升高( P＜0. 05)。與SNL相比，High、Middle組脊髓腰膨大中乙?；痯65含量明顯下降( P＜0. 05)，而Low組乙?；痯65蛋白量無明顯變化( P＞0. 05)。見Fig 2B。

2．3腰段脊髓背角活化NF-κB的表達(dá)變化免疫熒光染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠腰段脊髓背角中活化的NF-κB表達(dá)量較少。與Sham組相比，SNL活化的NF-κB表達(dá)量明顯增加。與SNL相比，Low組表達(dá)無明顯變化，而High組活化的NF-κB表達(dá)量明顯降低，見Fig 3。

3　討論

乙?；且环N重要的翻譯后修飾，可以調(diào)節(jié)目標(biāo)蛋白質(zhì)的功能活性，與多種生理和病理過程密切相關(guān)。用藥物干擾組蛋白乙酰化的過程可以影響疼痛的行為，相反地，病理性疼痛狀態(tài)可能影響相關(guān)的傷害感受器基因的組蛋白乙?；癄顟B(tài)［7］。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶( histone acetyltransferases，HAT)以及組蛋白去乙?；? histone deacetylase，HDAC)相互拮抗、共同維持蛋白質(zhì)乙?；降膭討B(tài)平衡。

Fig 2 Expression of SIRT1 and Ac-p65 in the lumbar spinal cord of rats at d7( n =5)

Yeung等［2］率先提出，SIRT1作為一種重要的HDAC，可以直接去乙酰化NF-κB的p65亞單位，降低其乙酰化水平。敲除SIRT1基因可導(dǎo)致NF-κB過度乙酰化［8］。這都提示SIRT1是催化NF-κB去乙?；年P(guān)鍵酶。白藜蘆醇是去乙?；窼IRT1的激動劑，屬于多酚化合物，具有抗氧化、抗自由基、抗炎等生物學(xué)活性。同時白藜蘆醇還可穿透血腦屏障，對神經(jīng)產(chǎn)生保護(hù)作用，對外周和中樞神經(jīng)炎癥疾病有較好的防治作用［9］。有研究證實鞘內(nèi)注射白藜蘆醇能通過上調(diào)SIRT1蛋白表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮延遲或減輕神經(jīng)病理性疼痛的作用［3］，但其具體機制還未見完整的報道。本研究探索了SIRT1激活劑白藜蘆醇對神經(jīng)病理性疼痛的影響。由于SNL模型熱痛閾變化明顯，穩(wěn)定性好，可靠性高，所以我們選擇SNL模型作為本次神經(jīng)病理性疼痛的模型。外周給予白藜蘆醇難以通過血腦屏障，為了更好的研究中樞效應(yīng)，本實驗選擇鞘內(nèi)注射。

Fig 3　NF-κB expression in the spinal cord at d7( n =5) (×200)

行為學(xué)顯示SNL術(shù)后即產(chǎn)生了明顯的熱痛閾值降低現(xiàn)象，并且持續(xù)至術(shù)后14 d。實驗結(jié)果表明每天注射300 μg和30 μg白藜蘆醇可以緩解SNL大鼠神經(jīng)病理性疼痛的熱痛敏癥狀，并且緩解效果以連續(xù)給藥后d 4為甚。所以我們選擇給藥后d 4來研究大鼠脊髓中蛋白的變化。而停止給藥后，白藜蘆醇的鎮(zhèn)痛作用呈逐漸減弱的趨勢。提示每天注射一定劑量的白藜蘆醇可以明顯減輕大鼠神經(jīng)病理性痛，這種鎮(zhèn)痛作用隨著給藥時間的延長逐漸減弱。每天注射3 μg白藜蘆醇沒有明顯鎮(zhèn)痛作用。同時，實驗過程中各組大鼠均無明顯不良反應(yīng)，說明鞘內(nèi)注射白藜蘆醇是安全、可靠的。

NF-κB信號通路的異常激活與神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［1］。我們發(fā)現(xiàn)疼痛組大鼠脊髓中NF-κB的表達(dá)明顯高于正常對照組，這與之前的研究相一致［10］。研究證實白藜蘆醇可以抑制NF-κB信號通路［11］。因此，我們推測白藜蘆醇通過抑制NF-κB信號通路活性，來達(dá)到緩解神經(jīng)病理性疼痛的作用。本研究中，我們利用免疫熒光法來檢測磷酸化p65亞基的表達(dá)來代表大鼠脊髓背角中NF-κB的活化程度。白藜蘆醇干預(yù)4 d后，High組( 300 μg白藜蘆醇組)大鼠脊髓背角中活化的NF-κB表達(dá)減少，Low組( 3 μg白藜蘆醇組)大鼠脊髓NF-κB活化程度無明顯變化。免疫熒光的結(jié)果與各組大鼠PWL變化情況相一致，進(jìn)一步確認(rèn)了白藜蘆醇的鎮(zhèn)痛作用，并且表明其鎮(zhèn)痛作用至少有一部分是通過抑制NF-κB通路而實現(xiàn)。

NF-κB/p65亞單位上310位賴氨酸( lysine，Lys)的乙?；揎椝脚cNF-κB的活性有明顯的正相關(guān)性。p65去乙酰化過程中，發(fā)揮主要作用的HDAC是SIRT1［12］。因此，我們推測白藜蘆醇是否通過激活SIRT1的HDAC活性來影響p65乙?；_(dá)到對NF-κB的抑制作用。為此，我們進(jìn)一步檢測了各組大鼠脊髓中乙?；膒65和SIRT1的含量。結(jié)果顯示: SNL術(shù)后大鼠脊髓中乙?；痯65含量明顯升高，提示p65的過度乙酰化可能參與了神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展。連續(xù)4 d鞘內(nèi)注射300、30 μg白藜蘆醇后，模型大鼠脊髓內(nèi)乙?；痯65水平明顯降低，同時也逆轉(zhuǎn)了SNL導(dǎo)致的痛覺高敏現(xiàn)象。同時我們發(fā)現(xiàn)SNL組大鼠脊髓腰膨大組織中SIRT1呈低表達(dá)狀態(tài)，這與之前研究結(jié)果一致［3］，300μg和30μg白藜蘆醇對SIRT1蛋白有明顯的激活作用，但不能使SIRT1升至正常水平。提示SIRT1激活劑白藜蘆醇逆轉(zhuǎn)了p65的過度乙酰化，影響NF-κB表達(dá)，這可能是白藜蘆醇鎮(zhèn)痛作用的機制之一。

綜上所述，結(jié)扎腰5脊神經(jīng)可降低SIRT1水平，乙?；痯65蛋白表達(dá)增多，激活NF-κB通路，促進(jìn)大鼠產(chǎn)生神經(jīng)病理性疼痛。鞘內(nèi)注射一定量的白藜蘆醇能通過上調(diào)SIRT1來抑制p65乙?；?，從而降低NF-κB的表達(dá)，發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。本研究在更深入闡明神經(jīng)病理性痛的發(fā)病機制的同時，為治療神經(jīng)病理性疼痛提供新的思路。

(致謝:本實驗在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科麻醉科實驗室完成，在此衷心感謝我的導(dǎo)師李偉彥教授的耐心培養(yǎng)，實驗室劉清珍老師的細(xì)心指導(dǎo)，各位同學(xué)的合作和幫助! )

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Resveratrol facilitates neuropathic pain in rats model by decreasing acetylation of NF-κB p65

WANG Yi-wei1，2，LIU Qing-zhen3，CHEN Chun-long3，ZHI Yi-bo3，Zhang Jie1，2，LI Wei-yan3
( 1．Key Laboratory of Anesthesiology of Jiangsu Province，Xuzhou Medical College，Xuzhou Jiangsu 221004，China; 2．Key Laboratory of Anesthesia and Analgesia Application Technology of Jiangsu Province，Xuzhou Medical College，Xuzhou Jiangsu 221004，China; 3．Dept of Anesthesiology，Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command，Naning 210002，China)

Abstract:AimTo investigate the antagonistic effect of resveratrol on neuropathic pain and its underlying mechanism．Methods Neuropathic pain was induced by ligation of L5spinal nerve ( SNL) in rats．90 male Sprague-Dawley rats，fit with intrathecal catheters were divided randomly into six groups ( n = 15) : naive group; sham group; SNL group; high dosage of resveratrol group ( 300μg) ; middle dosage of resveratrol group ( 30μg) and low dosage of resveratrol group ( 3μg)．The naive group did not make any process．In sham group，the L5spinal nerve was only exposed without ligation．Other groups received SNL．Different dosages of resveratrol dissolved in 10μL 100% DMSO were administered by intrathecal injections once a day for 4 days，starting on day 4 after SNL．Paw withdrawal latency ( PWL) was measured on day 1，3，5，7，9，11，14 days after surgery separately．On day 7 after behavioral testing，the lumbar segments of the spinal cord were removed to measure the level of SIRT1 and acetylated-p65( Ac-p65) for western blot．The activation of NF-κB was determined through calculating the percentage of NF-κB-immunofluorescence positive staining cells in this study．ResultsCompared with sham groups，the SNL group showed an obvious decrease( P ＜0. 05) of PWL and SIRT1 after surgery，whereas Acp65 and actived NF-κB significantly increased ( P＜0. 05) in the spinal cord．Administration with high and middle dosages of resveratrol markedly attenuated( P＜0. 05) SNL-induced thermal hyperalgesia and downregulation of SIRT1 and blocked ( P＜0. 05) the SNL-induced up-regulation of Ac-p65 and actived NF-κB in the spinal cord．ConclusionIntrathecal resveratrol can inhibit the development of neuropathic pain and suppress the activation of NF-κB signaling in SNL rats ．The analgesic effect of resveratrol is implemented partly via increasing the level of SIRT1 and deacetylating p65．

Key words:neuropathic pain; resveratrol; silent information regulator 1; NF-kappa B; p65; acetylation

作者簡介:王依慰( 1990－)，女，碩士，研究方向:麻醉與鎮(zhèn)痛的基礎(chǔ)與臨床，E-mail: wywtiantian@ sina．com;

基金項目:全軍“十二五”面上資助項目( No CWS11J017) ;南京軍區(qū)醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助項目( No 14ZX15)

收稿日期:2015－09－03，修回日期: 2015－11－03

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0089－05

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．019