斑馬魚胚胎評價5種藥物的發(fā)育毒性與模型驗(yàn)證

許冰潔，張立將，李春啟，宣堯仙

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評價研究中心，浙江杭州　310013;2.杭州環(huán)特生物科技有限公司，浙江杭州　311231)

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斑馬魚胚胎評價5種藥物的發(fā)育毒性與模型驗(yàn)證

許冰潔1，張立將1，李春啟2，宣堯仙1

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院安全性評價研究中心，浙江杭州310013;2.杭州環(huán)特生物科技有限公司，浙江杭州311231)

中國圖書分類號: R-332; R321．3; R971．1; R979．1; R977．1; R978. 14; R991

摘要:目的用斑馬魚胚胎探究環(huán)磷酰胺、乙酰水楊酸、鹽酸四環(huán)素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷5種已知對人類胚胎致畸藥物的毒性和安全性。方法挑選4 hpf發(fā)育正常的受精卵，采用水浴染毒法，將藥物添加到人工海水中，每種藥物分別設(shè)置5個濃度組，另設(shè)空白對照組和溶劑對照組，觀察給藥120 hpf后斑馬魚的死亡情況，統(tǒng)計(jì)各實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎的死亡數(shù)、畸形數(shù)，并求出120 hpf時斑馬魚胚胎的死亡率、畸形率、半數(shù)致死濃度( LC50)、半數(shù)致畸濃度( EC50)、致畸指數(shù)( TI)。并利用公式: TI = LC50/EC50計(jì)算出陽性藥物的致畸指數(shù)。根據(jù)已經(jīng)測得的LC50，求出各藥物的最大非致死濃度( MNLC)，分別設(shè)置1/10 MNLC、1/3 MNLC，MNLC和LC104個濃度，以沙利度胺為陽性對照，維生素C為陰性對照，人工海水為空白對照，0. 5% DMSO為溶劑對照，28. 5℃下作用至120 h，每天觀察胚胎的發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)胚胎死亡及畸形狀態(tài)。結(jié)果5種藥物的LC50從大到小依次為:環(huán)磷酰胺＞阿扎胞苷＞鹽酸四環(huán)素＞乙酰水楊酸＞乙酸地塞米松。EC50從大到小依次為:環(huán)磷酰胺＞鹽酸四環(huán)素＞阿扎胞苷＞乙酰水楊酸＞乙酸地塞米松。環(huán)磷酰胺、乙酰水楊酸、鹽酸四環(huán)素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷TI值分別為1. 92，1. 11，1. 05，1. 44，2. 99。結(jié)論斑馬魚胚胎模型可用于初步評價藥物的發(fā)育毒性和安全性。

關(guān)鍵詞:斑馬魚胚胎;半數(shù)致死濃度;半數(shù)致畸濃度;致畸;發(fā)育毒性;模型驗(yàn)證

宣堯仙( 1954－)，女，研究員，研究方向:藥理毒理學(xué)，通訊作者，Tel: 0571-87568016，E-mail: nndsvc@ mail．hz．zj．cn

斑馬魚( Daniorerio)屬于輻鰭亞綱( Actinopterygii)鯉科( Cyprinidae)短擔(dān)尼魚屬( Danio)的一種淡水魚，原產(chǎn)于巴基斯坦和印度，是國家衛(wèi)生機(jī)構(gòu)認(rèn)可的模式生物之一，在世界范圍內(nèi)，斑馬魚已成為一種流行的生物醫(yī)學(xué)和毒理學(xué)模型。用斑馬魚胚胎檢驗(yàn)藥物的致畸效應(yīng)，具有體積小，成本低，易于飼養(yǎng)，重復(fù)性好、便于觀察，繁殖周期短，繁殖頻率高等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此它是一種理想的試驗(yàn)?zāi)Ｐ停瑫r，斑馬魚與人類基因組相似度高達(dá)87%［1］，與人類各種器官系統(tǒng)極為相似，如心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等［2］。斑馬魚毒理學(xué)模型雖然仍處于起步階段，但存在著巨大的潛力，歐洲經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織( OECD)將斑馬魚胚胎發(fā)育試驗(yàn)列為藥物安全性評價標(biāo)準(zhǔn)方法之一，促使斑馬魚胚胎發(fā)育試驗(yàn)廣泛的應(yīng)用于環(huán)境、農(nóng)業(yè)、水產(chǎn)等領(lǐng)域［3－6］。

常規(guī)毒性實(shí)驗(yàn)常采用嚙齒類和非嚙齒類動物進(jìn)行，能較準(zhǔn)確地反映藥物的安全性，但實(shí)驗(yàn)周期一般較長，藥物用量較大，而斑馬魚試驗(yàn)周期短，相對哺乳動物成本低，藥物用量少，給藥方式簡單［7］。全身透明，易于觀察，能較直觀的反映藥物吸收、分布、代謝過程，還有各項(xiàng)生化指標(biāo)，早期各個階段的發(fā)育形態(tài)等，確定藥物暴露在胚胎中的毒性［8］。

實(shí)驗(yàn)所用的環(huán)磷酰胺、乙酰水楊酸、鹽酸四環(huán)素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷5種藥物均為臨床常用藥物。環(huán)磷酰胺在體內(nèi)代謝后有抗腫瘤活性，用于治療白血病及其他腫瘤。乙酰水楊酸是一種解熱鎮(zhèn)痛藥，通過與環(huán)氧化酶中的COX-1活性部位多肽鏈530位絲氨酸殘基的羥基發(fā)生不可逆的乙?；?，導(dǎo)致COX失活，繼而阻斷了AA轉(zhuǎn)化為血栓烷A2( TXA2)的途徑，抑制PLT聚集，主要用于發(fā)熱、疼痛及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。鹽酸四環(huán)素為廣譜抗菌素，高濃度時具殺菌作用，應(yīng)用本品超過2g/日可能引起致命的肝毒性。乙酸地塞米松是腎上腺皮質(zhì)激素藥，其抗炎、抗過敏、抗休克作用效果明顯。阿扎胞苷胞是嘧啶核苷類藥物，能直接參入DNA中，抑制DNA和RNA合成，可殺傷處于S期的細(xì)胞，可引起胃腸道反應(yīng)、白細(xì)胞減少、肝損害。

采用已知的胚胎致畸陽性藥物沙利度胺和陰性藥物維生素C建立斑馬魚胚胎發(fā)育毒性模型。針對不同靶器官的毒性，選取了環(huán)磷酰胺、乙酰水楊酸、鹽酸四環(huán)素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷5種陽性藥物，格列本脲、頭孢噻肟鈉兩種陰性藥物對前期建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

1　材料與方法

1．1實(shí)驗(yàn)動物AB型成年斑馬魚，由杭州環(huán)特生物科技有限公司提供( AAALAC)。

1．2主要藥物與試劑陽性藥物:環(huán)磷酰胺由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。乙酰水楊酸由Sigma公司(美國)提供。沙利度胺由Sigma公司(美國)提供。鹽酸四環(huán)素由北京綠源大德生物科技有限公司提供。乙酸地塞米松由阿拉丁試劑(上海)有限公司提供。阿扎胞苷由Sigma公司(美國)提供。分別稱取一定量的5種藥物，充分溶解于DMSO中，再按0. 5%比例稀釋于人工海水中。

陰性藥物:維生素C由華中藥業(yè)股份有限公司提供，格列本脲由天津太平洋制藥有限公司提供，頭孢噻肟鈉由華北制藥河北華民藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。

DMSO購自Sigma公司(美國)。超純水取自EPED超純水機(jī)。

1．3主要儀器奧林巴斯SZX7解剖顯微鏡，EPED超純水機(jī)。上海博訊實(shí)業(yè)有限公司SPX-250B-Z生化培養(yǎng)箱。

1．4胚胎收集♀♂斑馬魚按1∶2比例放置在魚缸內(nèi)，由隔板分開。次日清晨，取下隔板開始交配，30 min后，收集胚胎。收集好的魚卵用養(yǎng)魚水沖洗3遍，置于培養(yǎng)皿中，挑選發(fā)育一致的斑馬魚魚卵備用。

1．5藥物配制及濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，以最大非致死濃度( MNLC)為下限，每個藥物設(shè)定5個濃度。陽性對照(沙利度胺)最大溶解度為7. 75×10－1mmol·L－1，所以只設(shè)4個濃度梯度。為了便于觀察斑馬魚胚胎畸形狀態(tài)，每個藥物設(shè)定4個致畸試驗(yàn)劑量，分別為MNLC/10、MNLC/3、MNLC、LC10。

1．6實(shí)驗(yàn)方法選取4 h pf已受精的斑馬魚胚胎加入6孔板中，每孔30尾，每孔3ml，置于5個不同濃度的藥物( DMSO先溶解)中，見Tab 1。在28. 5℃下發(fā)育至120 hpf，以0. 5% DMSO(人工海水稀釋)為溶劑對照，以人工海水為空白對照組，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。每天觀察斑馬魚胚胎死亡情況，并記錄死亡胚胎數(shù)、致畸胚胎數(shù)，分別計(jì)算5種藥物的半數(shù)致死濃度( LC50)、半數(shù)致畸濃度( EC50)。

根據(jù)5種藥物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定4個致畸試驗(yàn)劑量，分別為各個藥物的MNLC/10，MNLC/3，MNLC，LC10。陰性藥物選擇MNLC觀察。見Tab 2。設(shè)置1/10 MNLC、1/3 MNLC、MNLC和LC104個濃度是為了便于觀察胚胎畸形狀態(tài)而不至胚胎死亡。以沙利度胺為陽性對照、維生素C為陰性對照，用環(huán)磷酰胺、乙酰水楊酸、鹽酸四環(huán)素、乙酸地塞米松、阿扎胞苷5種陽性藥，格列本脲、頭孢噻肟鈉2種陰性藥物，對已建立的斑馬魚胚胎發(fā)育毒性模型進(jìn)行驗(yàn)證。觀察并記錄各藥物處理組斑馬魚胚胎的畸形情況，評價各藥物對斑馬魚胚胎的致畸性。

1．7數(shù)據(jù)處理與評價胚胎從4 hpf暴露給藥至120 hpf，計(jì)算120hpf斑馬魚胚胎死亡率、畸形率。

死亡率/% =死亡數(shù)/胚胎總數(shù)×100%

畸形率/% =畸形數(shù)/存活胚胎數(shù)×100%

在受精后120 hpf顯微觀察斑馬魚胚胎的發(fā)育變化。應(yīng)用SPSS16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，求取各藥物L(fēng)C50、EC50，并利用公式: TI = LC50/EC50，計(jì)算出陽性藥物及陰性藥物的致畸指數(shù)。采用單因素方差分析，顯著性水準(zhǔn)設(shè)在α= 0．05。

Tab 1 Five drugs lethal concentration

2　結(jié)果

2．1斑馬魚胚胎死亡率及畸形率空白對照組、溶劑對照組死亡數(shù)均≤3，并且未觀察到明顯畸形。空白對照組與溶劑對照組的死亡率、畸形率差異無顯著性( P＞0. 05)。5種藥物出現(xiàn)胚胎死亡和畸形發(fā)生率與空白對照組比較P＜0. 05，并呈明顯的濃度關(guān)系，濃度高，畸形發(fā)生率也隨之變高。見Tab 3，4。2．2受試藥物對120hpf斑馬魚胚胎的LC50，EC50，TI值的測定5種藥物L(fēng)C50從大到小依次為:環(huán)磷酰胺8. 25mmol·L－1、阿扎胞苷5. 63×10－1mmol·L－1、鹽酸四環(huán)素4. 69×10－1mmol·L－1、乙酰水楊酸1. 07×10－1mmol·L－1、乙酸地塞米松7. 71×10－2mmol·L－1; EC50的從大到小次序?yàn)?環(huán)磷酰胺4. 30 mmol·L－1、鹽酸四環(huán)素4. 46×10－1mmol·L－1、阿扎胞苷1. 88×10－1mmol·L－1、乙酰水楊酸9. 61×10－2mmol·L－1、乙酸地塞米松5. 35×10－2mmol·L－1。由LC50、EC50結(jié)果可知，5種藥物中乙酸地塞米松毒性最強(qiáng)，乙酰水楊酸次之，其次是鹽酸四環(huán)素、阿扎胞苷，環(huán)磷酰胺毒性較弱。利用公式: TI = LC50/EC50，計(jì)算出陽性藥物的致畸指數(shù)，結(jié)果表明:環(huán)磷酰胺1. 92，乙酰水楊酸1. 11，鹽酸四環(huán)素1. 05，乙酸地塞米松1. 44，阿扎胞苷2. 99。陰性藥格列本脲、頭孢噻肟鈉均未出現(xiàn)明顯的致畸作用。見Tab 5。

Tab 2 Five drugs teratogenicity concentration

Tab 3 Effect of five drugs on 120 hpf zebrafish embryo mortality

Tab 4 Effect of five drugs on 120 hpf zebrafish embryo malformation rate

Tab 5 The LC50，EC50，TI of test drugs on 120 hpf zebrafish embryos

2．3受試藥物對斑馬魚胚胎形態(tài)學(xué)的影響環(huán)磷酰胺在1/10 MNLC( 5. 38×10－1mmol·L－1)和1/3 MNLC( 1. 79 mmol·L－1)濃度時，發(fā)育至120 hpf斑馬魚胚胎未觀察到明顯畸形，在MNLC ( 5. 38 mmol·L－1) 和LC10( 7. 17 mmol·L－1)濃度時，畸形率100%，72 hpf表現(xiàn)為卵黃囊變黑，卵黃囊吸收延遲( Fig 1 C3)，96hpf表現(xiàn)為無鰾，心包水腫，卵黃囊變黑( Fig 1 D4)，120 hpf表現(xiàn)為體長短，卵黃囊吸收延遲，心包水腫，腎包水腫，心律不齊，肝變小( Fig 1 D5)。

乙酰水楊酸1/10 MNLC( 8. 33×10－3mmol· L－1)、1/3 MNLC( 2. 78×10－2mmol·L－1)和MNLC ( 8. 33×10－2mmol·L－1)濃度時，斑馬魚胚胎未觀察到明顯畸形，在LC10( 9. 44×10－2mmol·L－1)濃度時，畸形率100%，96hpf出現(xiàn)無鰾，卵黃囊吸收延遲，心包水腫、腦顱變性( Fig 1 D4)，120 hpf出現(xiàn)心包水腫、腎包水腫、腦顱變性( Fig 1 D5)。

鹽酸四環(huán)素在1/10 MNLC( 1. 35×10－2mmol· L－1)、1/3 MNLC( 4. 57×10－2mmol·L－1)和MNLC ( 1. 35×10－1mmol·L－1)濃度時，斑馬魚胚胎未觀察到明顯畸形，在LC10( 2. 70×10－1mmol·L－1)濃度時，表現(xiàn)為少數(shù)肝變性，在4. 16×10－1mmol·L－1濃度時，肝變性更加明顯，發(fā)生率較高( Fig 1 E5)。

乙酸地塞米松1/10 MNLC( 4. 37×10－3mmol· L－1)和1/3 MNLC( 1. 38×10－2mmol·L－1)濃度時，斑馬魚胚胎未觀察到明顯畸形，在MNLC ( 4. 37 ×10－2mmol·L－1)和LC10( 6. 21×10－2mmol· L－1)濃度時，畸形率100%，72 hpf表現(xiàn)為卵黃囊吸收延遲，心包水腫，96 hpf心包水腫更加嚴(yán)重，無鰾( Fig 1 F4)，120 hpf表現(xiàn)為心律不齊，心跳減慢，心包水腫發(fā)生率100%，無鰾( Fig 1 F5)。

阿扎胞苷1/10 MNLC( 1. 11×10－2mmol·L－1)和1/3 MNLC( 3. 69×10－2mmol·L－1)濃度時，斑馬魚胚胎未觀察到明顯畸形，在MNLC ( 1. 11×10－1mmol·L－1)和LC10( 2. 17×10－1mmol·L－1)濃度時，畸形率100%，24 hpf胚胎就有明顯的畸形，死亡胚胎出現(xiàn)卵凝結(jié)( Fig 1 G1)，48 hpf胚胎發(fā)育短小( Fig 1 G2)，72 hpf表現(xiàn)為眼睛小，卵黃囊吸收延遲，體長短( Fig 1 G3)，96 hpf發(fā)生心包水腫，卵黃囊吸收延遲，無鰾，眼睛小，皮膚紋理錯亂( Fig 1 G4)，120 hpf表現(xiàn)為無鰾，體長短，卵黃囊吸收延遲，心包水腫，肝變小，尾巴彎曲，色素分布異常( Fig 1 G5-1、G5-2)。5種藥物在LC10時都會出現(xiàn)少數(shù)胚胎死亡，表現(xiàn)為卵凝結(jié)( Fig 1 H)。

Fig 1 Five drugs used to treat the abnormal state of zebrafish embryos at different time

3　討論

我們采用已知的陽性藥物沙利度胺和陰性藥物維生素C建立了斑馬魚胚胎發(fā)育毒性模型，再使用5種陽性藥物和2種陰性藥物進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靈敏度、特異性均為100%。說明以斑馬魚胚胎為模式生物用于藥物安全性評價的實(shí)驗(yàn)方法安全、可靠，可以用來進(jìn)行藥物的早期毒性篩選。

目前國內(nèi)主要采用哺乳動物作為一般毒性的實(shí)驗(yàn)動物，但是成本高，用量大、實(shí)驗(yàn)周期長，實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易觀察。雖然斑馬魚模型也存在一定的局限性，還需要進(jìn)一步的優(yōu)化，但是可以快速篩選藥物，從而縮短實(shí)驗(yàn)的周期，減少動物使用量，節(jié)約成本。斑馬魚是一種新興的藥學(xué)研究工具，用于疾病模型和藥物的高通量篩選及藥物代謝，特別是應(yīng)用于早期的藥物安全性評價研究引起越來越多學(xué)者的重視和青睞［9－10］。

斑馬魚死亡觀測點(diǎn)通常為受精卵凝聚在一起，無心跳。觀察時長為4 hpf至120 hpf，以便更好的觀察整個毒性過程。并驗(yàn)證了斑馬魚胚胎模型的可靠性，說明該模型可用于藥物的早期發(fā)育毒性篩選。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在杭州環(huán)特生物科技有限公司完成。感謝導(dǎo)師宣堯仙研究員為本實(shí)驗(yàn)提供充足的資金支持和精心指導(dǎo);感謝張立將老師的整體思路指導(dǎo);感謝李春啟老師的盡心協(xié)助。)

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Model validation and evaluation of developmental toxicity of five drugs using zebrafish embryos

XU Bing-jie1，ZHANG Li-jiang1，LI Chun-qi2，XUAN Yao-xian1
( 1．Center of Safety Evaluation，Zhejiang Academy of Medical Sciences，Hangzhou 310013，China; 2．Hangzhou Hunter Biotechnology，Hangzhou 311231，China)

Abstract:AimTo explore the toxicity and safety of five kinds of known positive drugs，cyclophosphamide，acetyl salicylic acid，tetracycline hydrochloride，dexamethasone acetate and azacitidine，using zebrafish embryos．MethodsWe selected normally developed 4 hpf zygote，and used water bath infecting method to add the drug to the artificial seawater．Each drug had five concentrating groups，a separate control group and solvent control group．We observed the dead zebrafish embryos after 120 hpf drugs，counted the number of deaths and deformities of zebrafish embryos，and calculated mortality abnormal rate，the median lethal concentration ( LC50)，concentration for 50% of maximal effect ( EC50)，therapeutic index ( TI) under 120 hpf condition．We also used the formula TI = LC50/ EC50to calculate positive drug therapeutic index．Based on measured LC50we calculated most nonlethal concentration ( MNLC) of each drug setting，namely 1/10 MNLC，1/3 MNLC，MNLC，LC10four concentration，thalidomide as a positive control，vitamin C as a negative control，artificial seawater as control，0. 5% DMSO as solvent control．Put in 28. 5℃environment for 120book=79,ebook=88hours，embryo development was observed daily for developmental state，mortality，deforming rate and abnormal condition．Results The result of five drugs LC50in descending order: cyclophosphamide＞azacitidine ＞tetracycline hydrochloride＞acetylsalicylic acid＞dexamethasone acetate．EC50in descending order: cyclophosphamide＞tetracycline hydrochloride＞azacitidine＞acetylsalicylic acid＞dexamethasone acetate．The TI values of cyclophosphamide，acetyl salicylic acid，tetracycline hydrochloride，dexamethasone acetate，azacitidine were 1. 92，1. 11，1. 05，1. 44，2. 99，respectively．ConclusionZebrafish embryo model can be used in the preliminary evaluation of drugs，and the study of early developmental toxicity and safety．

Key words:zebrafish embryos; median lethal concentration; concentration for 50% of maximal effect; teratogenic; developmental toxicity; model validation

作者簡介:許冰潔( 1990－)，女，碩士生，研究方向:藥理學(xué)，E-mail: xbj1223@163．com;

基金項(xiàng)目:浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目( No 2014KYA046)

收稿日期:2015－09－29，修回日期: 2015－11－15

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978( 2016) 01－0074－06

doi:10．3969/j．issn．1001－1978．2016．01．016