豬流行性腹瀉弱毒疫苗研究進(jìn)展

胡鴻惠， 南文金， 龔中貴， 彭國(guó)良

1.韶關(guān)學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東韶關(guān) 512000)

?

豬流行性腹瀉弱毒疫苗研究進(jìn)展

胡鴻惠1， 南文金1， 龔中貴2， 彭國(guó)良1

1.韶關(guān)學(xué)院，廣東韶關(guān) 512005；2.韶關(guān)市動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督所，廣東韶關(guān) 512000)

分析了我國(guó)豬流行性腹瀉疫苗的使用現(xiàn)狀，從疫苗毒株的選擇、野毒株的分離和培養(yǎng)、毒株的致弱、疫苗安全性和免疫效力等方面綜述了豬流行腹瀉弱毒疫苗的研究進(jìn)展，以期為新形勢(shì)下進(jìn)一步開展豬流行腹瀉疫苗的研發(fā)提供借鑒與參考。

豬流行性腹瀉；豬流行性腹瀉病毒；弱毒疫苗；毒株

1971年英國(guó)首先發(fā)現(xiàn)豬流行性腹瀉(Porcineepidemicdiarrhea,PED)，隨后比利時(shí)、荷蘭、德國(guó)、瑞士、法國(guó)等均有該病的報(bào)道，我國(guó)于1976年首次報(bào)道該病的發(fā)生[1]。自2010年以來，我國(guó)大部分地區(qū)的豬場(chǎng)出現(xiàn)新的一輪仔豬腹瀉疫情，甚至出現(xiàn)在一些廣泛使用PED滅活苗和弱毒苗的豬場(chǎng)，與此同時(shí)韓國(guó)、日本、越南、泰國(guó)等亞洲國(guó)家也發(fā)生腹瀉疫情[2-3]。自2013年4月以來，美國(guó)、加拿大、墨西哥等美洲國(guó)家，甚至歐洲國(guó)家均有豬腹瀉疫情的報(bào)道[4-5]。2014年，日本大面積暴發(fā)仔豬腹瀉病[6]。目前，豬流行性腹瀉已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此該病的防疫與控制至關(guān)重要。疫苗免疫是預(yù)防動(dòng)物傳染病的有效方式，也是亞洲國(guó)家PED防疫控制的主要方式之一。一直以來，豬流行腹瀉疫苗的研制與應(yīng)用備受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的重視。近年來，不少豬流行性腹瀉相關(guān)疫苗陸續(xù)上市，2014年3月美國(guó)宣布豬病毒性腹瀉RNA核酸疫苗上市，2015年3月我國(guó)宣布豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-豬輪狀病三聯(lián)活疫苗上市等[7]。豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)主要寄生在豬的小腸，以細(xì)胞免疫為主，而弱毒疫苗是一種病原致病力減弱但仍然具有活力的完整病原疫苗，可以在免疫動(dòng)物體內(nèi)繁殖，具有使用劑量小、免疫原性好、不需佐劑、成本低、使用方便、可誘導(dǎo)較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，一次免疫即可獲得長(zhǎng)久免疫力等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。筆者從疫苗毒株的選擇、野毒株的分離和培養(yǎng)、毒株的致弱、疫苗安全性和免疫效力等方面綜述豬流行性腹瀉弱毒疫苗的研究進(jìn)展。

1　我國(guó)豬流行性腹瀉疫苗的使用現(xiàn)狀

已研制的豬流行性腹瀉疫苗有組織滅活苗、細(xì)胞滅活苗、細(xì)胞弱毒苗和轉(zhuǎn)基因植物疫苗、聯(lián)苗等，亞洲地區(qū)在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)通過疫苗免疫接種很好地控制了豬流行性腹瀉。國(guó)內(nèi)市售的豬流行性腹瀉相關(guān)疫苗以滅活苗為主，以弱毒苗為輔，其中大部分是聯(lián)苗，包括豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎(TGE)二聯(lián)苗和豬流行性腹瀉-豬傳染性胃腸炎-豬輪狀病(PoR)三聯(lián)疫苗等，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)廠家主要有哈維科、吉林正業(yè)、上海海利、成都天邦、普萊柯和諾倍威。滅活疫苗因其安全、穩(wěn)定而一直備受青睞，其中二聯(lián)滅活疫苗的市場(chǎng)份額相對(duì)較大?；钜呙缈梢哉T導(dǎo)豬體產(chǎn)生分泌性IgA(sIgA)，提供對(duì)病毒強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)，已成為目前企業(yè)研發(fā)推出產(chǎn)品的熱點(diǎn)。陳靜等[10]研究表明，與滅活疫苗相比，接種活疫苗后動(dòng)物攻毒保護(hù)性更好。盡管在一定程度上弱毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)，科研人員和企業(yè)仍在不斷完善和加強(qiáng)弱毒疫苗的研發(fā)，并在近年先后推出PED-TGE二聯(lián)活疫苗、PED-TGE-PoR三聯(lián)活疫苗投入市場(chǎng)。同時(shí)，新型疫苗(如亞單位疫苗、DNA疫苗、轉(zhuǎn)基因植物疫苗、重組活載體疫苗等基因工程疫苗)均在研發(fā)，但少有商品化。與傳統(tǒng)疫苗相比，新型疫苗在研發(fā)和投入使用的過程中人們更為關(guān)注疫苗的免疫原性和安全性，在我國(guó)等亞洲國(guó)家暫時(shí)沒有得到推廣和應(yīng)用[11-14]。

2　弱毒疫苗毒株的選擇

已經(jīng)實(shí)現(xiàn)商品化的弱毒疫苗所使用的豬流行性腹瀉病毒毒株主要有CV777株、P-5V株、KPED-9株和DR13株[15]。其中，CV777毒株最早由比利時(shí)Pensaert等分離得到，我國(guó)童有恩等[16]首次開展了CV777強(qiáng)毒株的致弱培育，隨后又開展了PED和TGE二聯(lián)弱毒苗的研制，并在2003年獲得TGE-PED二聯(lián)活疫苗新獸藥證書。目前，國(guó)內(nèi)很多企業(yè)仍然使用該毒株作為疫苗毒株進(jìn)行生產(chǎn)。在日本，廣泛用于活疫苗生產(chǎn)的毒株為P-5V。在韓國(guó)，Kweon等[17]成功從新生小豬小腸內(nèi)容物分離到的野毒株KPEDV-9，通過傳代適應(yīng)Vero細(xì)胞連續(xù)傳代致弱，并后續(xù)用于疫苗生產(chǎn)。Song等[18]也從新生仔豬小腸內(nèi)容物中分離到DR13毒株，經(jīng)過連續(xù)傳代并成功研制成口服疫苗，該疫苗口服效果強(qiáng)于肌注，并于2011年在菲律賓注冊(cè)商標(biāo)。此外，也有很多未能實(shí)現(xiàn)商品化的疫苗研發(fā)和正在研發(fā)中的腹瀉疫苗，童昆周等[19]開展了PEDV-G1的致弱培育工作。Sato等[20]開展了83P-5毒株的致弱培育。陶曉珊等[21]開展了SD10A1毒株的致弱研究。張?jiān)S科等[22]開展HN1301強(qiáng)毒株的致弱研究。

近年來，隨著豬流行性腹瀉疫情的暴發(fā)，研究人員發(fā)現(xiàn)以CV777毒株為代表的經(jīng)典毒株生產(chǎn)的疫苗對(duì)豬的保護(hù)力不足，造成免疫失敗的現(xiàn)象屢屢發(fā)生[23]。通過對(duì)流行毒株的分子流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)我國(guó)2010年以來的流行毒株與CV777相比，毒力基因發(fā)生了較大的改變，而2013～2014美國(guó)、韓國(guó)、日本的流行毒株與過去10年的流行毒株相比，也發(fā)生了變異。Chen等[24]在我國(guó)分離的LC毒株與CV777毒株相比有897個(gè)核苷酸不同，大部分差異主要存在ORF1和S基基因上，同樣的基因缺失和插入存在2010～2012年的中國(guó)分離株BJ-2011-1、CH/FJND-3/2011和GD-B中。SuzikiT等[25 ]于2013～2014年在日本分離的2個(gè)毒株(TTR-2/JPN/2014和MYG-1/JPN/2014)的S基因和ORF3基因上發(fā)現(xiàn)大范圍的缺失，這2個(gè)毒株與2013～2014年美國(guó)和韓國(guó)的廣泛流行的分離株有較近的親源關(guān)系，與經(jīng)典毒株相比在已知的中和表位中存在氨基酸的突變。

總之，毒株的選擇及其免疫原性、毒價(jià)是弱毒疫苗研發(fā)和投入生產(chǎn)并能實(shí)現(xiàn)市場(chǎng)化的關(guān)鍵因素之一。在新的養(yǎng)殖新形勢(shì)下，由于經(jīng)典疫苗對(duì)豬流行性腹瀉病毒感染的保護(hù)力不足和該病毒基因的變異，又一次啟發(fā)了新一輪的豬流行性腹瀉疫苗的研發(fā)之路，研究者們正從這些變異毒株中篩選代表性強(qiáng)、免疫原性好的毒株研發(fā)新的疫苗。

3　弱毒疫苗的分離培養(yǎng)與致弱

3.1毒株的分離和培養(yǎng)豬流行性腹瀉病毒野毒株的分離培養(yǎng)較為困難，有研究人員應(yīng)用豬胎腎、豬甲狀腺細(xì)胞進(jìn)行PEDV的分離未能成功。宣華等[26]應(yīng)用豬胎小腸組織原代單層細(xì)胞培養(yǎng)獲得成功，病毒滴度可達(dá)2×106.5～2×109.0TCID50/mL。Hofmann等首次在Vero細(xì)胞中成功傳代和培養(yǎng)PEDV。此后，陸續(xù)有成功應(yīng)用Vero細(xì)胞進(jìn)行PEDV的分離的報(bào)道[27-28]。此外，也有應(yīng)用PK15 細(xì)胞和Marc-145 細(xì)胞中成功分離或傳代PEDV的報(bào)道[29-30]?？傮w而言，PEDV分離率非常低，有的培養(yǎng)后基本檢測(cè)不到組織細(xì)胞感染量(TCID50)，給病毒的擴(kuò)大生產(chǎn)及病毒量的確定造成困難。

為了提高PEDV的臨床分離效率、在疫苗生產(chǎn)中提高病毒的低度，研究人員不斷探索研究。有些PEDV的分離會(huì)在第1代出現(xiàn)細(xì)胞病變，有的則需要盲傳多代后才出現(xiàn)病變[31]。馮曉聲等[32]通過使用細(xì)胞親和劑來改變病毒與細(xì)胞之間的關(guān)系，增加病毒和細(xì)胞之間的親和度，使得病毒更容易感染細(xì)胞。佟有恩等[33]采用加胰酶的辦法將二聯(lián)活疫苗的PEDV的毒價(jià)提高2個(gè)滴度。周靚靚等[34]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Vero細(xì)胞采用0.02%EDTA+0.25%胰酶為分散液與用PBS+0.25%胰酶為分散液，其使單層細(xì)胞的消化時(shí)間縮短，進(jìn)而縮短了病毒繁殖時(shí)間，且毒價(jià)能達(dá)到要求。王琳等[35]探索并優(yōu)化CV777疫苗株的培養(yǎng)條件，發(fā)現(xiàn)當(dāng)胰酶濃度為5.0～7.5μg/mL時(shí)，病毒增殖速度隨胰酶濃度的增加有所上升，且不同代次Vero細(xì)胞對(duì)病毒增殖的敏感性不同。為降低生產(chǎn)成本，有企業(yè)馴化疫苗毒株，以適應(yīng)低血清培養(yǎng)，采用分代次遞進(jìn)式減少營(yíng)養(yǎng)液中的血清濃度[36]。除病毒本身的特性以外，提高PEDV病毒培養(yǎng)的滴度不僅可以從培養(yǎng)基著手，也可以考慮培養(yǎng)條件、細(xì)胞系等。同時(shí)，需要建立一個(gè)敏感性高的檢測(cè)方法輔助病毒分離與鑒定，如熒光定量RT-PCR方法相比普通方法更具定量、敏感的優(yōu)越性。

3.2毒株的致弱常用的病毒致弱方法有4種：①從自然界中篩選弱毒株；②通過異種動(dòng)物或細(xì)胞傳代致弱；③采用物理和化學(xué)方法致弱；④利用基因工程技術(shù)對(duì)病原進(jìn)行重組。目前，應(yīng)用于豬流行性腹瀉病毒的致弱方法主要是通過細(xì)胞傳代致弱和利用基因工程技術(shù)對(duì)病原進(jìn)行重組致弱。

選擇合適的毒株進(jìn)行致弱是弱毒疫苗研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，而不同的毒株由于其毒力的強(qiáng)弱不同，因此通過傳代致弱的代次會(huì)有一定的差距。童昆周等[19]通過使用Vero細(xì)胞的傳代，并在一定代次用PK15和ST細(xì)胞進(jìn)行交替?zhèn)鞔鷮EDV-G1強(qiáng)毒株致弱，后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果表明PEDV-G1 第83代毒具有較高的免疫原性并具備作為弱毒疫苗株的條件。佟有恩等[16]將CV777強(qiáng)毒株的在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代進(jìn)行致弱，83代以后適應(yīng)了仔豬腎原代細(xì)胞(PK)，并自90代起做空斑培養(yǎng)，進(jìn)行病毒克隆純化，克隆后25代弱毒株穩(wěn)定性試驗(yàn)表明經(jīng)6代返祖?zhèn)鞔玖ξ匆姺祻?qiáng)，符合弱毒株標(biāo)準(zhǔn)。Kweon等[17]成功分離到野毒株KPEDV-9，通過傳代適應(yīng)Vero細(xì)胞，并連續(xù)傳代至93 代 。Song等[18,37]將DR13毒株經(jīng)過在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代100代致弱。日本Sato等[20]開展83P-5毒株的傳代致弱，該毒株在傳代22代時(shí)開始適應(yīng)細(xì)胞，并連續(xù)傳代至100代。陶曉珊等[21]對(duì)分離的SD10A1毒株進(jìn)行傳代致弱，第16代出現(xiàn)穩(wěn)定的細(xì)胞病變，病毒含量高于106.0TCID50/mL，在Vero細(xì)胞上傳代至121代時(shí)對(duì)未吃初乳仔豬安全，并命名為SD10。張?jiān)S科等[22]將HN1301分離株經(jīng)Vero細(xì)胞傳代致第46代時(shí)成功致弱，并命名為HN1302株。P-5V毒株雖已經(jīng)應(yīng)用于疫苗生產(chǎn)， 但無相關(guān)的致弱研究報(bào)道。已有的研究表明，PEDV在細(xì)胞傳代培養(yǎng)的過程中，隨著代次的增加，其毒力逐漸減弱，但也存在散失病毒復(fù)制能力的風(fēng)險(xiǎn)。目前使用的不同弱毒疫苗毒株致弱的代次各不相同。筆者認(rèn)為PED疫苗毒株的致弱方面仍然存在很多不足之處，比如可以考慮改良培養(yǎng)基縮短病毒復(fù)制周期、 改變病毒培養(yǎng)溫度致弱病毒、研發(fā)培育新的適應(yīng)性細(xì)胞系等。此外，在病毒的致弱研究中可以關(guān)注毒株的致弱標(biāo)志，有助于疫苗投入使用后的鑒別診斷。

4　凍干保護(hù)劑

動(dòng)物疫苗保護(hù)劑可以減少疫苗在高溫和長(zhǎng)時(shí)間保存中可能發(fā)生的物理和化學(xué)變化。常用的凍干保護(hù)劑有糖類、蛋白類、聚乙二醇等。國(guó)內(nèi)動(dòng)物疫苗最常使用的凍干保護(hù)劑主要有脫脂牛奶、蔗糖、明膠，其中一般蔗糖脫脂牛奶的比例為5%，明膠的比例為1.5%～3.0%，這些保護(hù)劑具有溶解性好、外型穩(wěn)定、保存方便和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，但具有熱穩(wěn)定性差和保護(hù)功能較弱的缺點(diǎn)，一般2～8 ℃下保存期為4～6個(gè)月。國(guó)外對(duì)耐熱凍干保護(hù)劑的研究起步較早，已有商品化的產(chǎn)品，2～8 ℃下保存期可達(dá)2年以上。近年來，國(guó)內(nèi)有研究人員探索以二糖類海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮、白蛋白等為組分的耐熱性凍干保護(hù)劑的研究工作[38-39]。關(guān)于PEDV的凍干保護(hù)劑的研發(fā)鮮有報(bào)道。陶曉珊等[21]選擇蔗糖和明膠為保護(hù)劑，其在疫苗中的質(zhì)量百分比終濃度分別為5%和1%，在保護(hù)劑中添加0.5%的酪蛋白酸鈉。凍干保護(hù)劑的選擇和質(zhì)量會(huì)影響疫苗的質(zhì)量、效價(jià)和穩(wěn)定性?？傮w來看，國(guó)內(nèi)對(duì)耐熱凍干保護(hù)劑的研究報(bào)道較少，僅有少量禽病疫苗的研發(fā)過程中對(duì)耐熱凍干保護(hù)劑進(jìn)行了研究，豬病疫苗普遍采用的是普通凍干保護(hù)劑。對(duì)PED疫苗在內(nèi)的豬病疫苗的凍干保護(hù)劑的研發(fā)具有一定的市場(chǎng)潛力。

5　疫苗的安全性和免疫效力

疫苗的安全性試驗(yàn)主要包括垂直傳播和水平傳播能力、不同日齡豬和妊娠母豬的免疫安全性、陽性豬群的免疫安全性、超劑量免疫的安全性以及毒力返強(qiáng)試驗(yàn)等。免疫效力試驗(yàn)則包括最小免疫劑量、免疫產(chǎn)生期與免疫持續(xù)期、不同的免疫途徑等。

童昆周等[19]將PEDV-G1第83代致弱毒株進(jìn)行免疫效力試驗(yàn) ，結(jié)果表明弱毒疫苗總免疫效力達(dá)94.6%。其中，口服或肌注免疫1～4 個(gè)發(fā)病量強(qiáng)毒攻擊的免疫豬均獲得100 %保護(hù)；6 個(gè)發(fā)病量攻擊的免疫豬, 則口服免疫獲得50%保護(hù), 肌注免疫獲得100 %保護(hù)。1998年，佟有恩等[16]將適應(yīng)Vero細(xì)胞系的不同代次的CV777 毒株進(jìn)行感染性及免疫效力試驗(yàn)，結(jié)果表明致弱毒株毒價(jià)可達(dá)3.33×107.0～3.33×107.5TCID50/mL，第83-7-斑5的克隆傳代毒的主動(dòng)免疫試驗(yàn)保護(hù)率為95.92%，被動(dòng)免疫試驗(yàn)保護(hù)率為96.2%，且該毒株經(jīng)6 代次返祖?zhèn)鞔玖ξ捶祻?qiáng)。佟有恩等[32]又研制了TGE-PED二聯(lián)活疫苗，免疫效力試驗(yàn)結(jié)果表明弱毒株的毒力穩(wěn)定，免疫后主動(dòng)保護(hù)率為97.7%，被動(dòng)保護(hù)率為98%，比二聯(lián)滅活疫苗約高10個(gè)百分點(diǎn)，而免疫劑量減少50%，免疫期可達(dá)7個(gè)月，仔豬的被動(dòng)免疫期可至斷奶后1 周，免疫后14d可產(chǎn)生較強(qiáng)的保護(hù)力，6 個(gè)豬場(chǎng)的田間試驗(yàn)保護(hù)率為95%～98%，緊急預(yù)防接種效果明顯。1999年，Kweon等[17]用KPEDV-9弱毒株免疫妊娠母豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)母豬的免疫力明顯提高。初乳前仔豬的致病性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)母豬所產(chǎn)生的抗體對(duì)抵抗PEDV野毒能力較強(qiáng)。懷孕母豬安全性試驗(yàn)表明接種KPEDV-9的母豬平均每窩產(chǎn)活仔數(shù)與對(duì)照組相同，無任何臨床癥狀。2000 年，李樹根等[40]將PEDV弱毒株G1-P83和TGE弱毒株AG1制成弱毒二聯(lián)疫苗，發(fā)現(xiàn)該疫苗可以使初生仔豬、斷奶仔豬和肥育豬對(duì)TGEV和PEDV強(qiáng)毒的攻擊有一定的抵抗能力，其中初生仔豬在8～10日齡用弱毒二聯(lián)疫苗口服免疫,在斷奶時(shí)能夠較好地保護(hù)仔豬,免受TGEV和PEDV強(qiáng)毒的感染。2007年，Song等[18]將13 株DR弱毒株通過口服及肌肉注射免疫妊娠母豬，其中口服免疫組發(fā)病率為13%，而肌肉免疫組為60%，口服組仔豬的IgA含量高于肌肉注射組，在強(qiáng)毒株攻毒情況下，新生仔豬口服組比肌肉注射組獲得了更好的免疫保護(hù)，病毒株在豬體內(nèi)連續(xù)3 次傳代毒力不返強(qiáng)。2014年，陶曉珊等[21]開展以SD10為毒株的弱毒疫苗研發(fā)，單劑量和超劑量試驗(yàn)均表明該毒株對(duì)小豬安全，主動(dòng)免疫妊娠母豬后其產(chǎn)仔豬攻毒保護(hù)率為100%，而仔豬的主動(dòng)免疫保護(hù)率也達(dá)100%，對(duì)照組發(fā)生典型的發(fā)病癥狀。2015年，張?jiān)S科等[22]研究弱毒株HN1302的免疫保護(hù)效力，試驗(yàn)結(jié)果表明攻毒后第14天血清中和抗體水平逐漸升高，多數(shù)達(dá)到1∶32的水平，此后隨著攻毒時(shí)間的增加，中和抗體水平增高，在攻毒后第28天達(dá)到最高，與CV777相比，弱毒株HN1302產(chǎn)生免疫效力較快，且能維持在一個(gè)較高的水平，能夠充分保護(hù)豬流行性腹瀉的攻擊。疫苗的免疫效力決定了動(dòng)物能否有效抵抗病毒的感染，弱毒疫苗接種后可以快速、持續(xù)地產(chǎn)生抵抗力，國(guó)內(nèi)PED弱毒疫苗推出市場(chǎng)后其占有的市場(chǎng)份額逐漸提升。同時(shí)，在研發(fā)過程中需要關(guān)注的一個(gè)問題是PED疫苗的免疫持續(xù)期，弱毒疫苗的免疫持續(xù)期越長(zhǎng)可以減少疫苗的免疫次數(shù)，減低生產(chǎn)成本、減少應(yīng)激，尤其是當(dāng)前養(yǎng)殖狀況復(fù)雜，豬場(chǎng)接種疫苗種類較多、相互干擾已成為影響疫苗免疫效果的因素之一。

6　展望

近年來，國(guó)內(nèi)外腹瀉疫情屢屢發(fā)生，豬流行性腹瀉的給全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病流行的相關(guān)問題主要集中在病毒發(fā)生較多的變異，與其他腸病毒共感染的比例逐年上升，疫苗的質(zhì)量問題等[41]。很多因素使得豬流行性腹瀉的防治成為今后一段時(shí)間內(nèi)集約化養(yǎng)豬面臨的亟待解決的問題之一。面對(duì)近年來的腹瀉疫情，在臨床生產(chǎn)實(shí)踐中一些經(jīng)典的腹瀉疫苗不能很好地抵抗疾病，有的發(fā)病豬場(chǎng)通過返飼、自家苗的制備和使用，在一定程度內(nèi)很好地控制了腹瀉疫情，但返飼、自家苗的使用缺乏規(guī)范的方法，且病毒的滴度難以控制，又存在其他疫病感染的風(fēng)險(xiǎn)，不能長(zhǎng)期使用。因此，飼養(yǎng)者們通過選擇合適的疫苗進(jìn)行免疫防疫才是科學(xué)有效的防控手段。

幾十年來，學(xué)者們對(duì)PED疫苗的研發(fā)工作一直沒有停滯。篩選和培育出具有良好免疫原性、高毒價(jià)的毒株是疫苗研制成功的關(guān)鍵。動(dòng)物機(jī)體抗感染免疫的過程中，體液免疫和細(xì)胞免疫都非常重要。由于PEDV的腸道親嗜性，局部腸黏膜免疫也發(fā)揮了重要作用，而活疫苗毒力減弱但保持完整的具有活力的病原，可以誘導(dǎo)良好粘膜免疫，是一個(gè)可持續(xù)發(fā)展和不斷完善的研究方向。但是，與滅活疫苗相比，弱毒疫苗的安全更為受到關(guān)注。弱毒疫苗的研發(fā)主要分為弱毒疫苗株的培育、疫苗的安全性檢驗(yàn)和疫苗的效力檢驗(yàn)等3個(gè)階段。

目前，基于腹瀉疫情發(fā)生形勢(shì)的變化，結(jié)合現(xiàn)有腹瀉疫苗研究概況，筆者認(rèn)為今后對(duì)豬流性腹瀉疫苗的研發(fā)可以從以下方面加以重視：①豬流行性腹瀉具有一定的地方流行性特征，研究人員可以長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)腹瀉疫情的發(fā)生，篩選地方流行毒株作為疫苗的候選毒株，追蹤變異的PEDV毒株，加強(qiáng)企業(yè)-高校-研究院所的合作，將工廠化的疫苗生產(chǎn)工藝與高校、研究院所的資源優(yōu)勢(shì)相結(jié)合。以臨床分離培養(yǎng)的變異毒株作為候選，優(yōu)化和改進(jìn)現(xiàn)有的商品化疫苗，加快科技轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的進(jìn)度，加快實(shí)驗(yàn)室研發(fā)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)的速度，也使養(yǎng)豬業(yè)受惠。②有針對(duì)性地考慮加強(qiáng)聯(lián)苗的研發(fā)。持續(xù)追蹤調(diào)查，檢測(cè)和分離臨床上與PEDV共感染的其他腸病毒，作為多聯(lián)疫苗毒株的候選。③考慮基因工程活疫苗的研發(fā)與應(yīng)用，保持活疫苗的免疫原性，但又減少活疫苗毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)。

[1]HOFMANNM,WYLERR.Propagationofthevirusofporcineepidemicdiarrheaincellculture[J].JClinMicro, 1988,26(11):2235-2239.

[2]SUNRQ,CAIRJ,CHENYQ,etal.Outbreakofporcineepidemicdiarrheainsuckingpiglets,China[J].EmergInfectDis, 2012,18(1):161-163.

[3] 蔡汝健,張樂宜,宋長(zhǎng)緒.2010-2013 年華南地區(qū)豬流行性腹瀉病流行情況調(diào)查及防控效果[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013(11):104-105.

[4]WANGL,BYRUMB,ZHANGY.Newvariantofporcineepidemicdiarrheavirus,UnitedStates, 2014[J].EmergInfectDis, 2014(20):917-919.

[5]CHUNGHC,NGUYENVG,MOONHJ,etal.IsolationofporcineepidemicdiarrheavirusduringoutbreaksinSouthKorea, 2013-2014 [J].EmergInfectDis,2015,21(12):2238-2240.

[6]HORIEM,KABEMURAM,MASATANIT,etal.IsolationandmolecularcharacterizationofporcineepidemicdiarrheavirusescollectedinJapanin2014[J].ArchVirol, 2016，161：2189.

[7] 張曉鵬.10年磨一劍哈獸研維科生物首創(chuàng)的豬傳染性胃腸炎、豬流行性腹瀉、豬輪狀病毒三聯(lián)活疫苗隆重上市[J].獸牧獸醫(yī)科技信息，2015 (8):83.

[8] 趙德明,張仲秋,周向梅,等.豬病學(xué)[M].10版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2014.

[9] 殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997.

[10] 陳靜,劉德清,張寧,等.7種常用豬流行性腹瀉疫苗臨床免疫效果觀察和評(píng)估[J]. 養(yǎng)豬,2013(4):106-108.

[11] 孟凡丹.豬傳染性胃腸炎和流行性腹瀉二聯(lián)核酸疫苗免疫效力研究[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[12] 陳建飛.豬流行性腹瀉病毒全基因組序列分析及感染性才cDNA克隆的構(gòu)建[D].哈爾濱,哈爾濱獸醫(yī)研究所研究生院,2012.

[13]KANGTJ,JANGYS,YANGMS.Cloningandsequenceanalysisofthekoreanstrainofspikegeneofporcineepidemicdiarrheavirusandexpressionofitsneutralizingepitopeinplants[J] .ProteinExprPurif, 2005, 41(2):378-383.

[14]ZHANGY,ZHANGX,LIAOX,etal.ConstructionofabivalentDNAvaccineco-expressingSgenesoftransmissiblegastroenteritisvirusandporcineepidemicdiarrheavirusdeliveredbyattenuatedSalmonella typhimurium[J].Virusgenes,2016,52(3):354-364.

[15]SONGD,MOONH,KANGB.Porcineepidemicdiarrhea:Areviewofcurrentepidemiologyandavailablevaccines[J].ClinExpVaccineRes,2015,4(2):166-176.

[16] 佟有恩,馮力,李偉杰,等.豬流行性腹瀉弱毒株的培育[J].中國(guó)畜禽傳染病,1998,20(6):329-332.

[17]KWEONCH,KWONBJ,LEEJG,etal.Derivationofattenuatedporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)asvaccinecandidate[J].Vaccine, 1999, 17: 2533-2546.

[18]SONGDS,OHJS,KANGBK,etal.OralefficacyofVerocellattenuatedporcineepidemicdiarrheavirusDR13strain[J].ResVetSci, 2007,82(1):134-140.

[19] 童昆周,李力復(fù),林志雄,等.豬流行性腹瀉弱毒疫苗的研究[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,1996,26(1):3-4.

[20]SATOT,TAKEYAMAN,KATSUMATAA,etal.Mutationsinthespikegeneofporcineepidemicdiarrheavirusassociatedwithgrowthadaptationinvitroandattenuationofvirulenceinvivo[J].VirusGenes,2011,43(1):72-78.

[21] 陶曉珊,劉蕾,申洪銀,等.一種豬流行性腹瀉活疫苗：中國(guó),CN103933561A[P].2014.

[22] 張?jiān)S科,孫進(jìn)忠,田克恭.一種豬流行性腹瀉病毒株、及其致弱毒疫苗株及應(yīng)用:中國(guó),CN104513827A[P].2015.

[23]LINCM,SAIFLJ,MARTHALERD,etal.Evolution,antigenicityandpathogenicityofglobalporcineepidemicdiarrheavirusstrains[J].VirusRes, 2016，16:30225-30232.

[24]CHENF,ZHUY,WUM,etal.Comparativegenomicanalysisofclassicalandvariantvirulentparental/attenuatedstrainsofporcineepidemicdiarrheavirus[J].Viruses,2015,7(10):5525-5538.

[25]SUZUKIT,MURAKAMIS,TAKAHASHIO,etal.MolecularcharacterizationofpigepidemicdiarrhoeavirusesisolatedinJapanfrom2013to2014[J].InfectGenetEvol, 2015,36(12):363-368.

[26] 宣華,邢德坤,王殿瀛,等.應(yīng)用豬胎腸單層細(xì)胞培養(yǎng)流行性腹瀉病毒的研究[J].中國(guó)人民解放軍獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1984,4(3):202-208.

[27] 王康,王鑫,楊德,等.豬流行性腹瀉病毒HeB10/2014 株的分離與鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2016,38(4):284-288.

[28]KADOIK,SUGIOKAH,SATOHT,etal.Thepropagationofaporcineepidemicdiarrheavirusinswinecelllines[J].NewMicro,2002,25(3):285-290.

[29]JUNGK,SAIFLJ.Porcineepidemicdiarrheavirusinfection:Etiology,epidemiology,pathogenesisandimmunoprophylaxis[J].VetJ, 2015,204(2):134-143.

[30]LAWRENCEPK,BUMGARDNERE,BEYRF,etal.Genomesequencesofporcineepidemicdiarrheavirus:Invivoandinvitrophenotypes[J].GenAnnou,2014,2(3):503-514.

[31] 付夢(mèng)瑾,朱玲,吳云飛,等.豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定及增殖規(guī)律[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2013,43(11):1133-1139.

[32] 馮曉聲,賈愛卿,王貴平.一種豬流行性腹瀉病毒的培養(yǎng)方法：中國(guó),CN104611297A[P].2015.

[33] 佟有恩,馮力,李偉杰,等. 豬傳染性胃腸炎與豬流行性腹瀉二聯(lián)弱毒疫苗的研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),1999,21(6):406-410.

[34] 周靚靚,孫心,吳蕾.豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉疫苗病毒培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2014,39(6):33-35.

[35] 王琳,邢育鋼 ,李繼昌.豬流行性腹瀉疫苗株在Vero細(xì)胞中繁殖條件的優(yōu)化[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2014(11):3-4.

[36] 徐宏軍,胡來根,牟和平,等.低血清培養(yǎng)Vero細(xì)胞生產(chǎn)豬流行性腹瀉CV777株病毒的方法：中國(guó),CN104630158A[P].2015.

[37]SONGDS,YANGJS,OHJS.DifferentiationofaVerocelladaptedporcineepidemicdiarrheavirusfromKoreanfieldstrainsbyrestrictionfragmentlengthpolymorphismanalysisofORF3[J].Vaccine, 2003, 21(17/18):1833-1842.

[38] 王佳佳.雞新城疫耐熱糖玻璃活疫苗制備技術(shù)研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大,2013.

[39] 陳果亮,杜元釗,管清江,等.常規(guī)動(dòng)物用活疫苗凍干保護(hù)劑的改良初探[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫,2007，24(10):28-29.

[40] 李樹根,周仲芳,李力復(fù),等.豬流行腹瀉和豬傳染性胃腸炎弱毒二聯(lián)疫苗研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2000,26(8):5-8.

[41]SUNDB,WANGXY,WEIS,etal.EpidemiologyandvaccineofporcineepidemicdiarrheavirusinChina:amini-review[J].JVetMedSci, 2016,78(3):355-363.

ResearchProgressofPocineEpidemicDiarrheaAttenutedVirusVaccine

HUHong-hui1,NANWen-jin1,GONGZhong-gui2etal

1.ShaoguanUniversity,Shaoguan,Guangdong512005; 2.ShaoguanAnimalHealthSupervisionInstitute,Shaoguan,Guangdong512000)

Inthispaper,thecurrentusagesituationofpocineepidemicdiarrheavaccine(PEDV)inChinawasdescribed,andtheresearchprogressofpocineepidemicdiarrhea(PED)attenutedvirusvaccinewassummarizedfromtheaspectsoftheselectionofvaccinestrains,theseparationandcultureofwildstrains,theattenuationofstrains,thesafetyandimmuneefficiencyofvaccine,andsoon.Itprovides< class="emphasis_italic">references

fortheresearchanddevelopmentofpocineepidemicdiarrheavaccineinthenewepidemicsituation.

PED;PEDV;Attenutedvirusvaccine;Strain

廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)體系建設(shè)專項(xiàng)；廣東省協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心平臺(tái)項(xiàng)目(YJK-2014-52-16)；韶關(guān)市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013CX/N06，韶科[2015]72號(hào))；2016年韶關(guān)學(xué)院校級(jí)科研項(xiàng)目；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A040402038)。

胡鴻惠(1982- )，女，湖南郴州人，助理研究員，碩士，從事動(dòng)物生產(chǎn)與疾病研究。

2016-08-05

S852.5

A

0517-6611(2016)26-0069-04