百草枯誘導(dǎo)AML12細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體活性氧的作用

孔德欽，劉江正，于衛(wèi)華，張　 濤，龍　 子，王　 欣，張曉迪，柏　 樺*，海春旭*（第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系毒理學(xué)教研室，陜西　 西安　 710032）

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百草枯誘導(dǎo)AML12細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體活性氧的作用

孔德欽，劉江正，于衛(wèi)華，張 濤，龍 子，王 欣，張曉迪，柏 樺*，海春旭*
（第四軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系毒理學(xué)教研室，陜西 西安 710032）

【摘要】目的： 探討百草枯誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體活性氧的作用。方法：AML12細(xì)胞分別給予0、25、50、100、200、300 μmol/L的百草枯處理。采用四甲基噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)細(xì)胞活力；AnnexinV/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；DCFH-DA熒光探針經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平；MitoSOX熒光探針檢測(cè)線粒體活性氧變化；激光共聚焦測(cè)定JC-1探針熒光強(qiáng)度以檢測(cè)線粒體膜電位變化。結(jié)果：與對(duì)照組比較，25~300 μmol/L的百草枯處理后可以誘導(dǎo)AML12細(xì)胞活力下降，且具有劑量效應(yīng)關(guān)系(r=-0.94，P<0.01)；300 μmol/L的百草枯作用24 h可明顯誘導(dǎo)AML12細(xì)胞發(fā)生凋亡(P<0.05)；25~300 μmol/L 百草枯處理24 h后細(xì)胞內(nèi)活性氧依次增加(P<0.05)，25~100 μmol/L百草枯作用24 h時(shí)線粒體活性氧增加且呈劑量效應(yīng)關(guān)系(r=0.98，P<0.05)，而200 和300 μmol/L的百草枯作用24 h時(shí)線粒體活性氧水平降低(P<0.05)。細(xì)胞活力下降與細(xì)胞內(nèi)活性氧升高呈負(fù)相關(guān)(r=-0.90， P<0.05)；晚期凋亡細(xì)胞的比例與細(xì)胞內(nèi)活性氧呈正相關(guān)(r=0.96，P<0.01)；JC-1檢測(cè)線粒體膜電位結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，300 μmol/L的百草枯處理24 h時(shí)線粒體膜電位顯著降低(P<0.05)。結(jié)論：百草枯誘導(dǎo)AML12細(xì)胞凋亡過(guò)程主要由細(xì)胞整體水平的活性氧介導(dǎo)，提示線粒體活性氧并未直接參與百草枯誘導(dǎo)的肝損傷過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】百草枯；活性氧；線粒體活性氧；線粒體膜電位；凋亡

作者信息： 孔德欽，Tel：029-84774882-804；E-mail：1084789645@qq.com。*通信作者，海春旭，E-mail：cx-hai@fmmu.edu.cn；柏 樺，E-mail：hua_bai@126.com

Involvement of mitochondrial reactive oxygen species on paraquat-induced apoptosis in AML12 cells

KONG Deqin，LIU Jiangzheng，YU Weihua，ZHANG Tao，LONG Zi，WANG Xin，ZHANG Xiaodi，BAI Hua*，HAI Chunxu*
(Department of Toxicology, School of Preventive Medicine, the Forth Military Medical University, Xi’an 710032, Shaanxi, China)

【ABSTRACT】OBJECTIVE: To investigate the role of mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) on the apoptosis of a mouse liver cell line-AML12 cells after their exposure to paraquat. METHODS：AML12 cells were treated with paraquat at concentrations of 0，25，50，100，200 and 300 μmol/L for 24 h，and cell viability was measured by MTT assay. Apoptosis was assessed by flow cytometry using Annexin V-FITC apoptosis detection kit. DCFH-DA fluorescent probe and MitoSOX were used to determine the level of ROS in whole cell and in mitochondria by flow cytometry，respectively. Mitochondrial membrane potential was evaluated by confocal microscope using JC-1 probe.

RESULTS：Paraquat from 25 to 300 μmol/L induced dose-dependent decrease of AML12 cells viability. Apoptosis was significantly induced by paraquat at 300 μmol/L for 24 h. Treatment with 25-100 μmol/L paraquat raised the level of mitochondrial reactive oxygen species. However，200 and 300 μmol/L paraquat decreased the level of mtROS. The increase of ROS level was closely related to the decrease of AML12 cells viability (r=-0.90，P<0.05)，and the ROS level was positively correlated with the proportion of the late apoptotic cells (r=0.96，P<0.01). Additionally，300 μmol/L paraquat markedly reduced mitochondrial membrane potential. CONCLUSION：Paraquat could induce apoptosis of AML12 cells via the induction o f w hole c ell R OS w hich s uggest t hat m tROS m ay n ot b e d irectly i nvolved i n p araquat-induced liver i njury.

【KEY WORDS】paraquat；reactive oxygen species；mitochondrial reactive oxygen species；mitochondrial membrane potential；apoptosis

百草枯(paraquat，PQ)，化學(xué)名稱為1-1-二甲基-4-4-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽，是一種快速有效的滅生性除草劑，在世界范圍內(nèi)被廣泛使用。但百草枯對(duì)人體毒性極大，口服中毒死亡率可達(dá)90%以上，目前尚無(wú)特效解毒藥。據(jù)美國(guó)中毒控制中心統(tǒng)計(jì)，2008年因百草枯中毒死亡人數(shù)居農(nóng)藥中毒死亡人數(shù)之首[1]。百草枯進(jìn)入人體后可通過(guò)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[2]，進(jìn)而導(dǎo)致多臟器功能損害，其中肝臟是百草枯中毒的重要靶器官之一[3]。百草枯中毒可引起嚴(yán)重肝損傷、肝功能衰竭。目前急性百草枯誘導(dǎo)肝損傷的中毒機(jī)制尚不十分清楚。

線粒體作為細(xì)胞損傷反應(yīng)最為敏感的細(xì)胞器之一，除了為細(xì)胞提供能量外，在細(xì)胞凋亡、分化、腫瘤形成、免疫反應(yīng)啟動(dòng)、缺氧感應(yīng)、鈣代謝調(diào)節(jié)等生理病理活動(dòng)中也均發(fā)揮重要作用[4]。近年的研究發(fā)現(xiàn)百草枯誘導(dǎo)的細(xì)胞整體水平ROS的增加主要來(lái)源于線粒體[5-7]，但百草枯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體活性氧(mtROS)的作用仍不明確，本實(shí)驗(yàn)以小鼠肝細(xì)胞系A(chǔ)ML12細(xì)胞為靶細(xì)胞，使用24 h 的百草枯干預(yù)模型[8-9]，初步探討百草枯誘導(dǎo)AML12細(xì)胞凋亡過(guò)程中mtROS的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

AML12細(xì)胞系由第四軍醫(yī)大學(xué)毒理學(xué)教研室細(xì)胞庫(kù)提供；四甲基噻唑藍(lán)(methyl thiazol tetrazolium，MTT)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)和2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(2′，7′-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)均購(gòu)自Sigma公司；Annexin V /PI雙染凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；JC-1染料購(gòu)自南京建成生物工程研究所；MitoSOX購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；新生牛血清(newborn bovine serum，NBS)購(gòu)自四季青公司；PBS、0.25%胰蛋白酶購(gòu)自上海吉諾醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器

醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)(SW-CJ，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo for 3111/371，USA)；倒置熒光顯微鏡(Olympus公司)；全波段酶標(biāo)儀(infinite M200 PRO，Austria)；激光共聚焦顯微鏡 (Olympus fluo FV10i，Japan)；流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6，USA)；全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(Sigma公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) AML12細(xì)胞是小鼠來(lái)源的正常肝細(xì)胞系，使用含10% NBS的DMEM高糖培養(yǎng)基在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%及飽和濕度條件下培養(yǎng)。在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶消化，以含10% NBS的DMEM高糖培養(yǎng)基吹打均勻，稀釋成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后接種于相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)AML12細(xì)胞的活力 將AML12細(xì)胞以3×104/mL的濃度接種于96孔板，每孔100 μL，使用含10% N BS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，分別加入終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L的PQ， 每孔200 μL，培養(yǎng)24 h后吸棄PQ，按每孔200 μL加入0.5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，吸棄上清液，再加入150 μL的DMSO，上全波段酶標(biāo)儀振蕩60 s，然后在490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度D(490)值，以各PQ處理組與對(duì)照組的D(490)比值計(jì)算細(xì)胞活力的相對(duì)水平。

1.3.3 AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞以1×105/mL的濃度接種于6孔板，每孔1 mL，使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜后，分別加入2 mL 終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L的PQ，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，PBS(pH7.2~7.4)洗2次，按AnnexinV/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟每個(gè)樣品分別加入500 μL結(jié)合緩沖液、5 μL Annexin V和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況(EX 488 nm，EM 530 nm)。

1.3.4 DCFH-DA染色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS 將細(xì)胞以1×105/mL的濃度接種于6孔板，每孔1 m L，過(guò)夜后，分別加入2 mL終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L 的PQ，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細(xì)胞，加入DCFHDA染料(終濃度10 μmol/L)，37 ℃避光孵育30 min。離心后棄上清，PBS洗2次，離心收集細(xì)胞。加1 m L P BS使 細(xì)胞重懸，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(EX 488 nm，EM 530 nm)。數(shù)據(jù)獲取和分析均采用CFlowPlus軟件。

1.3.5 mtROS的檢測(cè) MitoSOX是一種線粒體靶向的新型熒光染料，可以迅速進(jìn)入活細(xì)胞中的線粒體。進(jìn)入線粒體后，可被線粒體內(nèi)的超氧陰離子自由基氧化，氧化之后可與核酸結(jié)合發(fā)出紅色的熒光。因此，通過(guò)檢測(cè)紅色熒光的強(qiáng)弱可反映線粒體內(nèi)ROS的水平[10]。紅色熒光越強(qiáng)，提示mtROS水平越高；熒光越弱，提示mtROS水平越低。將細(xì)胞以3×104/mL的濃度接種6個(gè)激光共聚焦專用細(xì)胞培養(yǎng)皿，每皿1 mL，過(guò)夜后，分別加入1 mL終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L的PQ，24 h后加入終濃度為5 μmol/L 的MitoSOX，37 ℃避光孵育30 min，棄去染色液，用PBS 洗2次，加1 mL PBS后上共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察(EX 510 nm，EM 580 nm)，并用Image-Pro Plus 6軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度的分析和處理。

1.3.6 線粒體膜電位的檢測(cè) JC-1是一種廣泛用于檢測(cè)線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential，△Ψm)的理想熒光探針。正常的膜電位水平可以使JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中形成聚合物，并發(fā)出紅色熒光；而在異常情況下各種因素導(dǎo)致線粒體膜電位下降或喪失時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，只能以單體的形式存在于胞漿中，并產(chǎn)生綠色熒光。常用紅綠熒光強(qiáng)度的相對(duì)比例來(lái)衡量和評(píng)估線粒體去極化的程度。紅綠熒光強(qiáng)度比例越大，線粒體膜電位越高，紅綠熒光比例越小，膜電位越低。將細(xì)胞以3× 104/mL的濃度接種6個(gè)激光共聚焦小皿，每皿1 mL，過(guò)夜后，分別加入1 mL終濃度為0、25、50、100、200、300 μmol/L的PQ，24 h后按照J(rèn)C-1試劑盒操作要求進(jìn)行染色，上共聚焦顯微鏡觀察紅綠熒光強(qiáng)弱(EX 510 nm，EM 580 nm)，并用Image-Pro Plus 6軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度的分析和處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法-采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)以x ±s表示，組間數(shù)據(jù)的比較用t檢驗(yàn)，兩組間的相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度PQ對(duì)AML12細(xì)胞活力的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，PQ各濃度組均可明顯誘導(dǎo)AML12細(xì)胞活力下降(P均<0.05)，且呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=-0.94，P<0.01)。PQ濃度從25 μmol/L升高至300 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活力損傷程度從0.84降至約0.5。

與對(duì)照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05.圖1 PQ對(duì)AML12細(xì)胞活力的影響(n=6)

2.2 不同濃度PQ對(duì)AML12細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示。對(duì)照組正常細(xì)胞占98.1%，凋亡細(xì)胞為0.5%；與對(duì)照組相比，PQ在200 μmol/L以內(nèi)對(duì)AML12細(xì)胞均未引起明顯的凋亡(P>0.05)；而當(dāng)PQ的濃度達(dá)到300 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率顯著增加至約20%(P<0.05)，提示300 μmol/L的PQ可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

Annexin V-FITCA：不同濃度的PQ處理24 h后用AnnexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果；B：Ⅱ象限+Ⅳ象限的凋亡細(xì)胞百分率(%). 與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖2 PQ對(duì)AML12細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

2.3 不同濃度PQ對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

用流式細(xì)胞儀CFlow Plus軟件分析細(xì)胞內(nèi)ROS如圖3所示。與對(duì)照組相比，不同濃度的PQ處理后細(xì)胞內(nèi)ROS峰值發(fā)生右移，25、50、100、200、300 μmol/L的PQ處理后，ROS升高的細(xì)胞比例從空白對(duì)照組的50%依次升高至65%、72.2%、87.9%、91.1%、95.1%，如圖3A；分析熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)，隨著PQ濃度的依次增加，峰值整體右移，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS染料的熒光強(qiáng)度依次增加(P均<0.05)，如圖3B和3C。因此，PQ處理可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，并存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.96，P<0.01)。

A：不同濃度的PQ處理24 h后對(duì)AML12細(xì)胞內(nèi)ROS峰值的影響；B：不同處理組AML12細(xì)胞內(nèi)ROS峰值的比較；C：對(duì)各組熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果. 與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖3 不同濃度的PQ對(duì)AML12細(xì)胞內(nèi)ROS的影響(n=3)

2.4 不同濃度PQ對(duì)mtROS的影響

如圖4所示，MitoSOX染色AML12細(xì)胞內(nèi)的mtROS熒光強(qiáng)度分析結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，25~100 μmol/L的PQ處理24 h后，紅色熒光逐漸增強(qiáng)(P均<0.05)，至100 μmol/L時(shí)達(dá)到最大，200、300 μmol/L的PQ使熒光明顯降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。這說(shuō)明PQ在25~100 μmol/L范圍內(nèi)可以劑量依賴性地增加mtROS的水平(r=0.98， P<0.05)，而200和300 μmol/L的PQ使mtROS水平下降。

2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS、mtROS與細(xì)胞活力、晚期凋亡細(xì)胞比例的相關(guān)性分析

經(jīng)相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力下降與細(xì)胞內(nèi)ROS升高呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)ROS越高，細(xì)胞活力越低(r=-0.90，P<0.05，如圖5A)；而細(xì)胞活力與mtROS的變化無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.17，P>0.05)。晚期凋亡細(xì)胞的比例與細(xì)胞內(nèi)ROS呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.96，P<0.01，如圖5B)；而晚期凋亡細(xì)胞的比例與mtROS無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(r=-0.48，P>0.05)。

2.6 不同濃度PQ對(duì)線粒體膜電位的影響

JC-1檢測(cè)線粒體膜電位結(jié)果和熒光強(qiáng)度分析如圖6、7所示。與對(duì)照組相比，25~100 μmol/L的PQ處理后，紅綠熒光的比值逐漸增加(P均<0.05)，至100 μmol/L時(shí)達(dá)最大值，200 μmol/L的PQ使熒光強(qiáng)度開(kāi)始降低，但高于對(duì)照組水平(P<0.05)，而300 μmol/L的PQ可以明顯降低紅綠熒光的比值，并低于對(duì)照組水平(P< 0.05)，這說(shuō)明PQ在25~200 μmol/L范圍內(nèi)可以增加線粒體膜電位，而300 μmol/L PQ可顯著降低線粒體膜電位。

A：MitoSOX染色后激光共聚焦檢測(cè)結(jié)果；B：Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析結(jié)果. 與對(duì)照組比較，*P<0.05.圖4 不同濃度的PQ對(duì)mtROS的影響(n=6)

A：細(xì)胞活力相對(duì)水平與細(xì)胞內(nèi)ROS相關(guān)性分析圖；B：晚期凋亡細(xì)胞比例與細(xì)胞內(nèi)ROS相關(guān)性分析圖.圖5 相關(guān)性分析

圖6 激光共聚焦測(cè)定不同濃度PQ對(duì)線粒體膜電位的影響(JC-1染色)

與對(duì)照組(0 μmol/L)比較，*P<0.05.圖7 Image-Pro Plus 6.0軟件分析線粒體膜電位紅綠熒光比值

3 討 論

目前對(duì)百草枯中毒尚無(wú)特異性解毒藥物。百草枯中毒的機(jī)制尚不清楚，研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在百草枯中毒中起著重要作用[11]。百草枯進(jìn)入細(xì)胞后可作為電子受體，在細(xì)胞內(nèi)與多種分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生過(guò)量的ROS，如過(guò)氧化氫和超氧陰離子自由基，擾亂細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA的氧化損傷，從而引發(fā)細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和壞死[12]。線粒體在維持正常的細(xì)胞生理活動(dòng)中起著非常關(guān)鍵的作用，可以調(diào)控細(xì)胞的生存和死亡[13]。

ROS作為重要的凋亡誘導(dǎo)因子，在線粒體途徑的凋亡過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。正常情況下，線粒體電子傳遞鏈中會(huì)有部分電子“漏出”，稱為“電子漏”，從“電子漏”產(chǎn)生的超氧陰離子是胞內(nèi)ROS的主要來(lái)源，占細(xì)胞內(nèi)ROS總量的98%左右，可以滿足胞內(nèi)對(duì)適量ROS的需求[14]。而各種因素導(dǎo)致“電子漏”即線粒體活性氧增加時(shí)，會(huì)導(dǎo)致線粒體功能改變、氧化還原水平失衡，發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

本文對(duì)PQ誘導(dǎo)AML12細(xì)胞凋亡過(guò)程中線粒體活性氧的作用進(jìn)行了初步探究，發(fā)現(xiàn)25~300 μmol/L的PQ處理后可以劑量依賴性的降低細(xì)胞活力，雖然隨著PQ濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸下降，但由于MTT實(shí)驗(yàn)的固有局限性，尚不能判斷細(xì)胞活力下降原因是由于PQ抑制細(xì)胞增殖還是促進(jìn)凋亡壞死，故對(duì)PQ處理過(guò)的細(xì)胞進(jìn)行凋亡的檢測(cè)。凋亡檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)300 μmol/L的PQ可以顯著誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，這與Chang等[15]報(bào)道的大于1 μmol/L的PQ誘導(dǎo)神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)生凋亡的結(jié)果不一致，這可能是神經(jīng)元前體細(xì)胞的抗氧化防御能力較弱，對(duì)各種氧化損傷更敏感的原因[16-18]。

我們發(fā)現(xiàn)隨著PQ濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)整體ROS水平逐漸增加。Castello等[7]研究腦組織的損傷時(shí)提出PQ引起的細(xì)胞內(nèi)ROS增加主要來(lái)源于線粒體，我們用MitoSOX檢測(cè)線粒體ROS水平發(fā)現(xiàn)，PQ在25~100 μmol/L范圍內(nèi)可以劑量依賴性地增加線粒體活性氧的水平，與細(xì)胞內(nèi)ROS變化不同，200、300 μmol/L的PQ會(huì)降低線粒體活性氧水平，這其中的機(jī)制暫不清楚，有待進(jìn)一步研究。

為了明確PQ誘導(dǎo)細(xì)胞損傷與細(xì)胞內(nèi)ROS及mtROS的關(guān)系，我們對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS和mtROS與細(xì)胞活力、晚期凋亡細(xì)胞比例進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)雖然低劑量的PQ可以增加mtROS的水平，但真正與細(xì)胞損傷相關(guān)的是細(xì)胞內(nèi)整體ROS水平的增加。因?yàn)樵赑Q誘導(dǎo)細(xì)胞氧化還原紊亂過(guò)程中線粒體ROS的增加先于胞漿中的ROS[7]，因此，mtROS增加引發(fā)的細(xì)胞水平的ROS升高在PQ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中可能位于初始環(huán)節(jié)。目前常使用維生素C等光譜抗氧化劑治療PQ中毒患者[19-20]，但療效常不肯定，可能是有兩個(gè)原因：一是ROS發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)具有細(xì)胞內(nèi)隔室效應(yīng)，一般光譜抗氧化劑很難到達(dá)ROS存在位點(diǎn)，限制了其抗氧化效果；二是對(duì)PQ中毒患者往往不能早期給藥。因此，使用具有線粒體靶向的抗氧化劑如MitoQ進(jìn)行早期治療[21-25]是否更有效值得進(jìn)一步研究。

正常情況下，線粒體內(nèi)膜通透性很小，線粒體將電子傳遞鏈產(chǎn)生的質(zhì)子(H+)儲(chǔ)存于線粒體內(nèi)膜，形成橫跨線粒體內(nèi)膜的電化學(xué)質(zhì)子梯度和電位差，以維持線粒體膜電位。為明確ROS增加對(duì)線粒體功能膜電位的影響，我們還檢測(cè)了不同濃度PQ處理后線粒體膜電位的變化，發(fā)現(xiàn)300 μmol/L以下濃度的PQ使線粒體膜電位增加，其意義可能為促進(jìn)PQ進(jìn)入線粒體[6，26]；300 μmol/L的PQ可以明顯降低線粒體膜電位水平，提示細(xì)胞已進(jìn)入凋亡的早期階段[27]。以上結(jié)果均說(shuō)明百草枯誘導(dǎo)AML12細(xì)胞凋亡過(guò)程主要由細(xì)胞整體水平的ROS介導(dǎo)，提示mtROS并未直接參與百草枯誘導(dǎo)的肝損傷過(guò)程。

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收稿日期：2015-09-01；

修訂日期：2015-11-30

中圖分類號(hào)：R994.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-616X(2016)01-0001-07

doi:1 0.3969/j.issn.1004-616x.2016.01.001