線粒體熒光探針最新研究進展

姜娜，樊江莉，楊洪寶，彭孝軍

（1大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點實驗室，遼寧 大連 116024；2濟南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 濟南 250022）

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線粒體熒光探針最新研究進展

姜娜1,2，樊江莉1，楊洪寶1，彭孝軍1

（1大連理工大學(xué)精細(xì)化工國家重點實驗室，遼寧 大連 116024；2濟南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 濟南 250022）

摘要：細(xì)胞器的研究一直是認(rèn)識細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的重要手段。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，參與眾多的新陳代謝過程，許多病理學(xué)過程均與它相關(guān)，是一種重要的細(xì)胞器，一直以來都是研究的熱點。定位于線粒體的熒光探針主要分為3大類，本文重點介紹并討論近10年基于帶有正電荷的熒光團或者在熒光團中引入三苯基膦等定位基團實現(xiàn)對線粒體染色熒光探針的研究進展。

關(guān)鍵詞：熒光；探針；線粒體；細(xì)胞生物學(xué)；生物技術(shù)；成像

2015-06-29收到初稿，2015-07-31收到修改稿。

聯(lián)系人：彭孝軍。第一作者：姜娜（1987—），女，博士研究生。

Received date: 2015-06-29.

引 言

線粒體是細(xì)胞的能量工廠，在細(xì)胞生命過程中起到至關(guān)重要的作用，其功能異常與許多疾病密切相關(guān)，因此開發(fā)線粒體相關(guān)的熒光探針具有重要的生物學(xué)和生理學(xué)意義。目前已報道的定位于線粒體的熒光探針主要分為3大類：一類是基于線粒體帶有-180 mV的膜電位，進而利用本身帶有正電荷的熒光團或者在熒光團中引入三苯基膦等正電荷基團來實現(xiàn)其對線粒體的染色；另一類是將探針與能夠標(biāo)記線粒體的蛋白質(zhì)或者短肽鏈連接（一般由20～40個氨基酸序列組成），進而達(dá)到線粒體特異性染色的目的。這類探針具有較好的生物相容性，但水溶性差、細(xì)胞通透性不好等限制其應(yīng)用發(fā)展；第3類是利用膠束或者囊泡將藥物等不能夠滲透線粒體膜的物質(zhì)包裹，進而選擇性堆積在線粒體。一般選用帶有正電荷的脂質(zhì)體等作為囊泡的外表面，通過內(nèi)吞作用，磷脂層與線粒體膜相融合后釋放內(nèi)含物。該類探針能夠?qū)ж?fù)電的藥物或者大分子協(xié)同帶入線粒體內(nèi)部，但是內(nèi)含物的釋放率是值得關(guān)注的方面。本文將著重討論第一類熒光探針近10年的發(fā)展。

1 線粒體成像類熒光探針

線粒體是1894年德國科學(xué)家Altmann在動物細(xì)胞內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的，它具有雙層膜結(jié)構(gòu)，外膜是界膜，內(nèi)膜向內(nèi)折入形成嵴；內(nèi)外膜不相通，形成約-180 mV的膜電位。目前大多數(shù)線粒體定位類熒光探針是基于線粒體負(fù)膜電位特性，利用本身帶有正電荷的熒光團或者在熒光團中引入帶有正電荷基團，實現(xiàn)對線粒體的染色，其中最為常用的是三苯基膦正電荷基團。線粒體不僅為人體生命活動提供能量，還積極參與多種生理過程，它的異常與癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病等疾病相關(guān)，同時線粒體對各種外界損傷又極為敏感，通常其數(shù)量、大小和結(jié)構(gòu)隨損傷均有改變。細(xì)胞受到損傷時，線粒體可由線狀變大或者變圓，損傷嚴(yán)重時可變成小空心泡狀結(jié)構(gòu)。2013年，本課題組合成一例能夠長時間觀測線粒體形態(tài)變化的氟硼吡咯類（BODIPY類）熒光探針OBEP（1.1）（圖1）[1]。該探針具有良好的光學(xué)穩(wěn)定性，小的細(xì)胞毒性，在生理pH范圍內(nèi)對酸堿不敏感，可以通過激光共聚焦成像觀測到處于不同形態(tài)的線粒體。通過探究，作者認(rèn)為探針（1.1）是基于吡啶N原子乙基季銨化后使得探針整體帶正電荷，易于與線粒體負(fù)的膜電位相結(jié)合進而特異性染色到線粒體。

圖1 探針1.1的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中不同損傷程度線粒體的熒光成像Fig.1 Structure of probe 1.1, and confocal fluorescence image for various damaged mitochondrial forms in living cells

圖2 探針1.2和1.3的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中線粒體的熒光成像Fig.2 Structures of probes 1.2 and 1.3, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

近紅外熒光探針可以有效地避開蛋白自發(fā)熒光，具有較深的組織穿透力，因此開發(fā)能夠定位于線粒體的近紅外熒光探針意義重大。2010年Shi課題組證實以吲哚季銨鹽為基礎(chǔ)的七甲川菁染料可以定位于線粒體[2]。由于探針I(yè)R-780（1.2）（圖2）具有較好的光學(xué)性質(zhì)和生物相容性，優(yōu)先聚集于腫瘤組織，因此作者希望可以利用該探針建立一個腫瘤診斷和治療的平臺。2013年Tung課題組報道一例基于七甲川菁染料的無細(xì)胞毒性探針AcQCy7 （1.3）（圖2）[3]，該探針本身不發(fā)射熒光，當(dāng)進入細(xì)胞后發(fā)生乙?；庾饔蒙苫衔颭Cy7，同時伴隨紅色熒光發(fā)射。分子1.3可以很好地選擇性堆積在線粒體上，即使與細(xì)胞共孵育時間長達(dá)兩天，其染色位置不變，而且無任何細(xì)胞毒性表達(dá)，這為長時間觀測線粒體形態(tài)變化提供有利的研究工具。

2011年 Kawazoe課題組報道首例成像于線粒體膜的熒光探針[4]，并且通過細(xì)胞磨碎技術(shù)、凝膠電泳、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等各種實驗證明該分子在膜上發(fā)生成環(huán)反應(yīng)，由本身沒有熒光的分子1（1.4）在線粒體膜上反應(yīng)生成發(fā)射綠色熒光的分子2（1.5）（結(jié)構(gòu)如圖3），但是該分子定位于線粒體膜及其環(huán)化反應(yīng)的機制尚不明確。

圖3 探針1.4和1.5的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中線粒體的熒光成像Fig.3 Structures of probes 1.4 and 1.5, and confocal images of HeLa cells

雙光子激光共聚焦成像由于具有高的空間分辨率、組織穿透性深、光損傷程度低和耐光性好等優(yōu)點，目前受到廣泛關(guān)注。山東大學(xué)于曉強教授基于咔唑母體，設(shè)計合成兩例用于線粒體成像的雙光子熒光探針CAI（1.6）和CAEI（1.7）（圖4）[5]。這兩例探針之所以能夠定位于線粒體，很大部分是因為吡啶被碘代烷化合物取代后形成季銨鹽，使探針分子帶有正電荷。

目前已報道的能夠定位于線粒體的熒光探針大部分是基于三苯基膦基團或者探針本身帶有正電荷，而2013年Reddy及其合作者報道一例基于銪-β二酮絡(luò)合物用于線粒體定位的探針Eu(pfppd)3(tpy) （1.8）（圖5）[6]，豐富了線粒體熒光探針的數(shù)據(jù)庫。

圖4 探針1.6和1.7的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中線粒體的熒光成像Fig.4 Structures of probes 1.6 and 1.7, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

圖5 探針1.8的分子結(jié)構(gòu)及其與商品化線粒體染料在H9c2細(xì)胞中線粒體的熒光成像Fig.5 Structure of probe 1.8, and confocal images of H9c2 cells treated with Mitochondria tracker CellLight?Mitochondria-GFP BacMam 2.0 or molecule 1.8

2 線粒體內(nèi)離子類熒光探針

鋅作為一種重要的過渡金屬元素，在人體中的含量僅次于鐵，Zn2+含量異常會影響相關(guān)蛋白以及DNA的轉(zhuǎn)化和功能，進一步影響正常生理過程，造成腦發(fā)育遲緩、癲癇等疾病。2003年Gee課題組報道一例基于羅丹明的探針RhodZin-3 AM（2.1）（圖6）[7]，該探針與Zn2+結(jié)合后可實現(xiàn)75倍熒光增強，并且選擇性堆積于線粒體上，實現(xiàn)對線粒體中內(nèi)源性自由Zn2+的檢測。2011年，韓國Cho課題組報道一例基于FRET機理檢測線粒體內(nèi)Zn2+的紅色熒光探針5[8]。該探針?biāo)雇锌怂刮灰拼?，可減少激發(fā)光的干擾，在生理范圍內(nèi)不受pH干擾，實現(xiàn)了Zn2+的比率成像。緊接著，2012年，Cho和Kim合作，利用三苯基膦基團對線粒體的定位作用合成一例檢測Zn2+的雙光子熒光探針SZn2-Mito（2.2）（圖6）[9]。當(dāng)與Zn2+結(jié)合后，探針536 nm處有70倍熒光增強，對鼠海馬組織深達(dá)100～200 μm處實現(xiàn)Zn2+雙光子激光共聚焦成像。

圖6 探針2.1和2.2的分子結(jié)構(gòu)及其分別與相對應(yīng)的線粒體商品化染料在活細(xì)胞中線粒體的共定位熒光成像Fig.6 Structures of probes 2.1 and 2.2, and co-localization of 2.1 and MitoTracker Green, and confocal images of HeLa cells treated 2.2 or Mitotracker Red FM

鐵是人體內(nèi)含量最多的過渡金屬元素，具有重要的生理學(xué)意義，包括呼吸作用、電子轉(zhuǎn)移、遺傳信息轉(zhuǎn)錄等。尤其在線粒體內(nèi)，鐵含量異常所引起的相關(guān)疾病正在增加，例如弗里德里奇共濟失調(diào)癥。這種疾病是由共濟蛋白的缺陷引起的，而三價鐵離子是這種蛋白合成的控制因素。大連理工大學(xué)寧桂玲教授帶領(lǐng)課題組設(shè)計合成一例基于羅丹明探針母體用于檢測細(xì)胞內(nèi)三價鐵離子的探針RNP1（2.3）（圖7）[10]，該探針基于萘酐與羅丹明之間發(fā)生FRET作用調(diào)節(jié)對Fe3+的絡(luò)合能力。值得注意的是，探針2.3定位于線粒體同樣是依賴于三苯基膦基團。Cabantchik課題組同樣通過修飾羅丹明母體來監(jiān)測線粒體內(nèi)Fe3+水平[11-14]RdITPA-TG（圖8）[15]。該系列探針在中性環(huán)境下選擇性與Cu+反應(yīng)，使得母體螺環(huán)打開，發(fā)射542 nm的黃橙色熒光。當(dāng)TG基團為三苯基膦基團時，探針2.4可很好地定位于線粒體上，達(dá)到對線粒體內(nèi)。

圖7 探針2.3的分子結(jié)構(gòu)及與商品化線粒體綠色染料在HeLa細(xì)胞中共定位實驗Fig.7 Structure of 2.3, and localization of MitoTracker Green FM or 2.3 in HeLa cells

圖8 探針2.4的分子結(jié)構(gòu)Fig.8 Structure of probe 2.4

圖9 分子2.5-a和2.5-b由零價鈀催化發(fā)生鈴木反應(yīng)生成2.5的過程[16]Fig.9 Pd0-mediated Suzuki-Miyaura cross-coupling reaction for synthesis of anthofluorescein 2.5 from 2.5-a and 2.5-b[16]

銅同樣是線粒體內(nèi)重要的基本金屬元素，參與線粒體細(xì)胞色素c氧化酶及超氧歧化酶的合成，而這兩種酶在能量產(chǎn)生和能量凋亡中起調(diào)配作用。Taki教授基于香豆素母體設(shè)計合成一系列探針Cu+檢測識別的目的。

鈀及其離子化合物在生物體內(nèi)含量很低，大多數(shù)是通過呼吸作用吸入，進而滯留在肺部，其中一部分吸收的鈀化合物會快速轉(zhuǎn)運至肝、腎等器官。但是由于環(huán)境中鈀離子的濃度很低，又存在基體干擾，因此對它的檢測分析仍較為困難。Bradley及其合作者利用細(xì)胞內(nèi)的耦合反應(yīng)合成化合物5（2.5）（圖9）[16-17]。首先脂溶性不能夠發(fā)射熒光的探針母體2.5-a與帶有三苯基膦部分的2.5-b部分進入細(xì)胞后，在Pd0的催化作用下發(fā)生鈴木反應(yīng)生成探針2.5，同時伴隨著綠色熒光的發(fā)射，而三苯基膦基團的引入，使得探針可以定位于線粒體。

氟離子是一種重要的陰離子，它廣泛地參與生物、醫(yī)藥和化學(xué)過程。當(dāng)人體氟離子含量超標(biāo)時，最常見的表現(xiàn)是氟斑牙、新陳代謝失調(diào)、骨質(zhì)疏松癥和尿石癥等。研究表明，當(dāng)線粒體暴露在高濃度的氟離子環(huán)境時，其呼吸作用效率下降，進而導(dǎo)致線粒體功能紊亂，誘發(fā)遲發(fā)性神經(jīng)退行性類疾病。2014年，本課題組設(shè)計合成一例高選擇性和高靈敏性檢查F-的熒光探針FP（2.6）（圖10）[18-19]。分子2.6本身不發(fā)射熒光，當(dāng)與F-發(fā)生水解作用后，將會在485 nm處發(fā)射強烈的綠色熒光，且對F-的檢測限達(dá)19×10-9mol·L-1。該探針雖不帶有正電荷（與F-作用后的產(chǎn)物YG也不帶正電荷），卻很好地選擇性定位于活細(xì)胞線粒體上。

圖10 探針2.6的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中線粒體的熒光成像Fig.10 Structure of probe 2.6, and its fluorescent images for mitochondria in living cells

圖11 探針3.1和3.2的分子結(jié)構(gòu)以及探針3.2對HeLa細(xì)胞內(nèi)線粒體選擇性染色Fig.11 Structures of probes 3.1 and 3.2, and localization of 3.2 in mitochondria in HeLa cells

3 線粒體內(nèi)活性氧類熒光探針

氧氣是生物進行生命活動的必要因素。在生命活動中，機體通過呼吸作用產(chǎn)生一系列氧的衍生物，例如活性氧系列，通常包括超氧負(fù)離子（O-2·）、羥基自由基（HO·）、過氧自由基（ROO·）、過氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（1O2）等。在正常的細(xì)胞環(huán)境內(nèi)，活性氧的產(chǎn)生是必須的，但是當(dāng)因外界刺激產(chǎn)生過量的活性氧時，可對機體造成損傷乃至損害[20]。早在2006年，Chang課題組合成一例基于FRET機理比率檢測過氧化氫的新型熒光探針RPF1（3.1）（圖11）[21]。未與H2O2反應(yīng)前，只能觀察到香豆素的藍(lán)色熒光；與H2O2相互作用后，香豆素的藍(lán)色熒光逐漸減弱，而熒光素的綠色熒光恢復(fù)并且逐漸增強。探針RPF1（3.1）激發(fā)和發(fā)射波長均處于可見光區(qū)，不僅可減少對生物樣品的光損傷，還可以避開蛋白的自發(fā)熒光。值得注意的是，作者是將線粒體從細(xì)胞分離出后進行的檢測。緊接著，2007年Nagano課題組基于羅丹明母體帶有正電荷的性質(zhì)，設(shè)計合成一例真正能夠檢測線粒體中活性氧的探針MitoAR（3.2）（圖11）[22]，并實現(xiàn)在活細(xì)胞中對活性氧的熒光成像。

2010年，Shioji課題組將三苯基膦基團引入到四苯基芘熒光母體上，報道一例能夠檢測線粒體內(nèi)過氧化合物的探針MitoDPPP（3.3）（圖12）[23]。通過觀察探針的染色情況，作者認(rèn)為脂溶性的過氧化合物可有效地穿透線粒體膜。Robinson及其合作者同樣將三苯基膦基團引到乙啡啶母體上，合成能夠定位于線粒體的探針6（3.4）和7（3.5）（圖12）[24]。這兩例探針的熒光發(fā)射具有不同的形式。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)僅發(fā)生自動氧化作用（無超氧化合物）時，探針510 nm激發(fā)時只產(chǎn)生乙啡啶部分的熒光；而當(dāng)超氧化合物存在時，它將氧化探針生成2-羥基-乙啡啶的形式，并且在396 nm和510 nm處均可被激發(fā)，因此通過檢測396 nm和510 nm兩處的激發(fā)波長，可區(qū)分細(xì)胞一般氧化過程和超氧誘導(dǎo)過程。

2014年，新加坡國立大學(xué)的劉斌教授，通過三苯基膦基團的線粒體定位功能，很巧妙地利用癌細(xì)胞的線粒體膜電位比正常細(xì)胞更負(fù)，設(shè)計合成一例聚集態(tài)發(fā)光的探針AIE-mito-TPP（3.6）（圖13）[25]。該探針可以選擇性堆積在癌細(xì)胞中的線粒體上，并且通過探針的聚集達(dá)到熒光從無到有的過程。另外探針的進一步堆積可以誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生更多的活性氧，達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的。

圖12 探針3.3～3.5的分子結(jié)構(gòu)Fig.12 Structures of probes 3.3—3.5

次氯酸和次氯酸根是常見的活性氧物種，在日常生活中，次氯酸一般被用于漂白織物。在生物體內(nèi)，次氯酸一般存在于白細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過氧化氫和氯化物在過氧化物酶的催化作用下產(chǎn)生，次氯酸本身具有一定的防御功能，可以殺死多種病原體。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)次氯酸含量異常時，動脈粥樣硬化、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和肺部炎癥等疾病都有可能產(chǎn)生?；谌交⒒鶊F的線粒體定位功能，本課題組程光輝博士將其引入到BODIPY母體上，基于肟的還原反應(yīng)合成一例對次氯酸根快速響應(yīng)的熒光探針MitoClO（3.7）（圖14）[26]。測試體系中加入次氯酸根后，溶液由粉紅色變?yōu)辄S色，肉眼可見，伴隨著綠色熒光的發(fā)射，并且探針3.7可對線粒體內(nèi)次氯酸根進行共聚焦成像。

2014年，四川大學(xué)李坤副教授和余孝其教授合作，合成兩例基于羅丹明母體用于檢測細(xì)胞內(nèi)源性次氯酸的熒光探針Rh-TPP（3.8）和Rh-Py（3.9）（圖15）[27]。其中探針3.8由于三苯基膦基團的引入，使得它能夠定位于活細(xì)胞中的線粒體，并且對線粒體中次氯酸的含量可通過共聚焦成像。

生物體內(nèi)的過氧硝酸根一般認(rèn)為是在酶的催化作用下由一氧化氮和超氧化物形成的。過氧硝酸根與蛋白質(zhì)、磷脂、核酸等的合成密切相關(guān)。研究認(rèn)為阿爾茨海默病、關(guān)節(jié)炎、癌癥、自身免疫缺陷病等均與過氧硝酸根含量的異常相關(guān)。2015年山西大學(xué)郭煒教授基于羅丹明母體合成探針1（3.10）（圖16）[28]。該探針可排除其他活性氧物種，只對過氧硝酸根響應(yīng)，熒光由無到明亮綠色，并且響應(yīng)快速（幾秒內(nèi)即可完成響應(yīng)）。該探針定位于線粒體是基于羅丹明母體帶有正電荷的性質(zhì)。

圖13 探針3.6的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中線粒體的熒光成像[25]Fig.13 Structure of probe 3.6, and diagram of apoptosis was induced by 3.6[25]

圖14 探針3.7的分子結(jié)構(gòu)及其與商品化線粒體深紅色染料在MCF-7細(xì)胞中共定位熒光成像Fig.14 Structure of probe 3.7, and confocal images of 3.7 or a mitochondria-specific probe MitoTracker Deep Red FM in MCF-7

圖15 探針3.8和3.9的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中線粒體的熒光成像Fig.15 Structures of probes 3.8 and 3.8, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

4 線粒體內(nèi)有機小分子類熒光探針

硫化氫是一種有臭雞蛋味的無色氣體，是繼一氧化碳、一氧化氮后，人體內(nèi)存在的第3種內(nèi)源性氣體。在血管舒張、抗氧化作用、抗細(xì)胞凋亡和抗炎癥等生理過程中，硫化氫起著舉足輕重的作用，它含量異常與阿爾茨海默病、唐氏綜合征等息息相關(guān)。2013年，南京大學(xué)郭子建教授帶領(lǐng)團隊，將香豆素和半菁探針結(jié)合，設(shè)計合成一例超快速（30 s之內(nèi)完成檢測）比率檢測線粒體內(nèi)硫化氫的熒光探針CouMC（4.1）（圖17）[29-30]。由于探針本身帶有一個正電荷，因此無需額外引入其他線粒體定位基團便可很好地染色于線粒體上。探針4.1本身只在652 nm處發(fā)射強烈的紅色熒光，當(dāng)與硫化氫作用后，652 nm處熒光強度不斷降低，510 nm處產(chǎn)生一個新的綠色熒光，隨著硫化氫濃度的增加該熒光強度不斷增強，實現(xiàn)對硫化氫的比率檢測。

圖16 探針3.10的分子結(jié)構(gòu)及其與商品化紅光線粒體染料在BIU-87細(xì)胞中激光共聚焦成像Fig.16 Structure of probe 3.10, and fluorescence images of 3.10 and MitoTracker Red FM in BIU-87 cells

圖17 探針4.1的分子結(jié)構(gòu)及其與商品化線粒體紅色熒光染料在MCF-7細(xì)胞中共定位成像Fig.17 Structure of probe 4.1, and confocal fluorescence images of MCF-7 cells costained by 4.1 and Mito tracker Deep Red

硫醇類化合物在細(xì)胞內(nèi)氧化還原、細(xì)胞凋亡、DNA合成和血管形成等過程中起著重要的調(diào)控作用。谷胱甘肽和硫醇還蛋白是細(xì)胞內(nèi)最重要的兩大類硫醇類化合物。硫醇還蛋白的功能主要體現(xiàn)在蛋白質(zhì)二硫鍵的去除上，例如核苷酸還原酶、甲硫氨酸還原酶和過氧化還原酶等。然而，過量的硫醇還蛋白將會引起癌癥及心血管疾病。韓國Kim教授于2012年在J. Am. Chem. Soc. 雜志上發(fā)表一篇基于萘酰亞胺母體來檢測線粒體內(nèi)硫醇還蛋白的熒光探針Mito-Naph（4.2）（圖18）[31]。作者的設(shè)計思想很明確，即一方面通過二硫鍵的去除來識別硫醇還蛋白，另一方面利用三苯基膦基團的正電荷特性來定位于線粒體。探針4.2本身不發(fā)射熒光，當(dāng)與硫醇還蛋白類物質(zhì)作用后，發(fā)射出強烈的綠色熒光（λem= 540 nm），檢測限可達(dá)50 nmol·L-1?；谠撈脚_，陸續(xù)又有該類探針被報道[32-34]。

盡管許多檢測線粒體硫醇化合物的探針是基于二硫鍵的去除或者邁克爾加成反應(yīng)設(shè)計的，但是一例能夠用于單獨檢測線粒體內(nèi)谷胱甘肽的近紅外熒光探針MitoGP（4.3）（圖19）[35]。菁探針本身帶有一個正電荷，因此該探針可以選擇性定位于線粒體；而七甲川菁探針中位氧-對氨基類化合物的取代，使得該探針對谷胱甘肽的選擇性大大高于半胱氨酸和高半胱氨酸，這正是該工作的亮點。

2011年，Miyata等報道首例能夠誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生一氧化氮的熒光探針RpNO（4.4）（圖）[36]，該探針可用于研究生物體一氧化氮的生物學(xué)及生理學(xué)意義。探針4.4之所以能夠定位于線粒體也是基于羅丹明母體帶有正電荷的性質(zhì)。緊接著該課題組又報道一例能夠光致釋放一氧化氮的熒光探針NBDNO（4.5）（圖20）[37]。不同的是，該探針是利用三苯基膦基團的正電荷性質(zhì)定位到線粒體。

圖18 探針4.2的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中線粒體的熒光成像Fig.18 Structure of probe 4.2 and its fluorescent images for mitochondria in living cells

5 線粒體內(nèi)酸堿環(huán)境熒光探針

圖19 探針4.3的分子結(jié)構(gòu)及其對線粒體中谷胱甘肽響應(yīng)Fig.19 Structure of probe 4.3, and glutathione detection in mitochondria

線粒體許多功能是依賴于其酸堿性來實現(xiàn)的，例如正常生理狀態(tài)下，基于呼吸作用將質(zhì)子由線粒體內(nèi)膜傳輸?shù)骄€粒體外膜，因此線粒體基質(zhì)會處于堿性環(huán)境（pH約為8）。當(dāng)線粒體酸化時，將會發(fā)生自噬過程進而誘導(dǎo)一系列疾病的產(chǎn)生。2014年，Kim課題組設(shè)計合成一例用于實時檢測線粒體pH的探針1（5.1）（圖21）[38]。由于哌嗪基團上的N原子可對萘酰亞胺母體發(fā)生PET作用，因此探針本身無熒光；而當(dāng)N原子與H+結(jié)合后，PET作用消失，探針發(fā)射出525 nm的綠色熒光。三苯基膦基大多數(shù)探針是不能夠?qū)⒐入赘孰呐c半胱氨酸和高半胱氨酸進行區(qū)分的。2014年Kang課題組設(shè)計合成團的引入使得該探針可以很好地定位于線粒體上。通過細(xì)胞饑餓實驗，可以明顯地觀察到線粒體pH的變化與其酸化和融合等是相互依賴的。作者推論利用該探針檢測線粒體pH的異常將會對疾病的發(fā)現(xiàn)和診斷提供方便，但是該探針存在發(fā)射波長較短的不足。于是2014年山東師范大學(xué)唐波教授合成探針Spring Red（5.2）（圖21）[39]。探針5.2發(fā)射波長達(dá)到660 nm，屬于近紅外區(qū)，可有效地避開生物組織的本體熒光，利于實際應(yīng)用。

圖20 探針4.4和4.5的分子結(jié)構(gòu)及其對活細(xì)胞中線粒體的熒光成像Fig.20 Structures of probes 4.4 and 4.5, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

圖21 探針5.1和5.2的分子結(jié)構(gòu)及5.2對HepG2細(xì)胞中線粒體不同酸堿環(huán)境的熒光成像Fig.21 Structures of probes 5.1 and 5.2, and fluorescent confocal microscopy images of 5.2 in HepG2 cells defined at pH 4.0—8.5

相比單一強度檢測的探針，比率熒光檢測具有兩個以上發(fā)射峰，相對來說每個發(fā)射峰不受探針濃度影響，熒光強度及比值能夠提供更多的信息，具有抗干擾能力強等優(yōu)點。2015年李坤副教授和余孝其教授合作，合成一例基于香豆素母體通過比率方法檢測線粒體pH的熒光探針CP（5.3）（圖22）[40]。水溶性探針5.3對pH非常敏感，而對細(xì)胞內(nèi)的陽離子、陰離子、反應(yīng)類硫醇化合物和單線態(tài)氧等均無響應(yīng)，可實時監(jiān)測因細(xì)胞凋亡、藥物刺激等引起的線粒體酸化過程中線粒體pH的變化，這為定量線粒體pH提供有利的工具。

6 檢測線粒體內(nèi)黏度的熒光探針

細(xì)胞內(nèi)黏度在信號傳遞、核功能化、染色質(zhì)定位、單線態(tài)氧的定位等生物過程中起著十分重要的作用[41-42]。細(xì)胞內(nèi)黏度的突然變化會導(dǎo)致相關(guān)的功能化缺陷和疾病。線粒體是細(xì)胞的能量制造工廠，它對癌癥、阿爾茨海默病、帕金森綜合征等疾病都有著敏感的響應(yīng)。線粒體膜黏度的降低，電子傳輸鏈活性的減弱，活性氧含量的增加，細(xì)胞色素c釋放量的增加等均可以引起線粒體功能損傷[43]，因此檢測活細(xì)胞內(nèi)線粒體內(nèi)黏度具有重要的醫(yī)學(xué)和生物學(xué)意義。

圖23 探針6.1和6.2的分子結(jié)構(gòu)及其與商品化線粒體染料的復(fù)染實驗Fig.23 Structures of probe 6.1 and 6.2, and fluorescent images of them for mitochondria in living cells

2013年，本課題組基于香豆素和BODIPY探針，合成一例自校準(zhǔn)的黏度探針1（6.1）（圖23）[44]，在設(shè)計階段作者將三苯基膦基團引入，使得探針可以選擇性定位于活細(xì)胞的線粒體上。該工作第一次估算出HeLa細(xì)胞內(nèi)線粒體的黏度值在62 mPa·s，當(dāng)細(xì)胞受到離子載體、莫能菌素、制霉菌素等刺激時，線粒體黏度可升高至110 mPa·s。同年，本課題組基于咔唑設(shè)計合成一例具有雙光子性能的黏度探針Caz-Cy2（6.2）（圖23）[45]。該探針可以比率檢測溶液黏度變化，不受極性或生物大分子的干擾，可以對線粒體內(nèi)黏度進行成像。緊接著，設(shè)計合成雙模式監(jiān)測線粒體黏度的熒光探針Mito-V（6.3）（圖24）[46]。探針6.3本身帶有一個正電荷，易于定位于線粒體上，可通過熒光比率成像和熒光壽命成像兩種方法來檢測活細(xì)胞中線粒體黏度的變化，并且作者觀察到線粒體黏度在細(xì)胞凋亡中增大的現(xiàn)象。

圖24 探針6.3分子結(jié)構(gòu)及其與商品化深綠色熒光染料在HeLa細(xì)胞中共定位熒光成像Fig.24 Structures of probe 6.3, and confocal fluorescence images of HeLa cells stained with MitoTracker Green FM and 6.3

7 檢測線粒體內(nèi)極性的熒光探針

在生物系統(tǒng)中，特別是在細(xì)胞水平上，極性的變化影響蛋白質(zhì)、酶等的相互作用，并且在一定程度上反映出細(xì)胞膜的通透性。此外，它的異常變化與一些疾病密切相關(guān)，例如糖尿病、肝硬化等[47-49]。然而極性受許多復(fù)雜的因素影響，包括非共價相互作用、偶極和去偶極化作用、氫鍵相互作用等[50-51]。因此簡單地測試細(xì)胞內(nèi)的極性是十分困難的，亟需發(fā)展一種新方法。另外，細(xì)胞內(nèi)有多種細(xì)胞器，每種細(xì)胞器的極性也是不同的（其他參數(shù)，例如極性、單線態(tài)氧等也不同），所以更精確地檢測某一細(xì)胞器的極性具有更加明確的生物學(xué)意義[52-55]。

線粒體極性變化會強烈地影響蛋白質(zhì)和生物大分子的運輸和交互作用。另一方面，線粒體極性還能夠在一定程度上反映該種亞細(xì)胞器的位置、形態(tài)和組件的變化等。而當(dāng)線粒體功能異常時，其內(nèi)部酶、蛋白質(zhì)和生物大分子基質(zhì)等將不能正常傳輸[56-57]，例如線粒體蘋果酸脫氫酶的活性和穩(wěn)定性會受到周圍環(huán)境極性的強烈影響[58]，因此研究和開發(fā)出能夠用于檢測線粒體極性的熒光探針具有重要意義。2015年，本課題組設(shè)計合成一例以香豆素為基礎(chǔ)的半菁探針BOB（7.1）（圖25）[59]。該探針具有兩個吸收峰和兩個發(fā)射峰，隨著溶液極性增加，探針在短波長與長波長處熒光強度比例與溶液極性呈線性關(guān)系，可用作比率型極性熒光探針。BOB探針可對活細(xì)胞中的線粒體進行特異性染色，發(fā)現(xiàn)并驗證線粒體極性在細(xì)胞凋亡過程中降低，還發(fā)現(xiàn)線粒體極性在癌細(xì)胞中低于正常細(xì)胞，期望通過監(jiān)測線粒體極性的異常來區(qū)分癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。

圖25 探針7.1的分子結(jié)構(gòu)及其與商品化深綠色熒光染料在MCF-7細(xì)胞中共定位熒光成像Fig.25 Structures of probe 7.1, and confocal fluorescence images of MCF-7 cells stained with Mito Tracker Green FM and 7.1

8 結(jié)論與展望

目前對于線粒體內(nèi)黏度、極性等微環(huán)境參數(shù)檢測的熒光探針雖有報道，但是靈敏度不足限制了它的發(fā)展，成為生物醫(yī)學(xué)研究和診斷治療中的薄弱領(lǐng)域，所以提高探針檢測靈敏度將是研究的熱點之一。另一方面，把藥物通過二硫鍵等特殊基團連接到探針上，利用探針的線粒體定位功能將藥物攜入到線粒體內(nèi)部，達(dá)到藥物定位釋放的目的，也將是線粒體相關(guān)類熒光探針的研究熱點。

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Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (21136002, 21422601, 21421005), the National Basic Research Program of China (2013CB733702), Ministry of Education (NCET-12-0080) and the Natural Science Foundation of Liaoning Province (2013020115).

Progress in research of mitochondrial fluorescence probes

JIANG Na1, 2, FAN Jiangli1, YANG Hongbao1, PENG Xiaojun1
(1State Key Laboratory of Fine Chemicals, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China;2School of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jinan, Jinan 250022, China)

Abstract：The researches on organelles are important ways to study the structure and function of cells. Mitochondria, the principal energy-producing compartments in most cells, play roles in the numerous vital cellular processes. Thus, the organelles are crucially involved in various pathologies. As one of the most important cellular organelles, mitochondria are always the focus of researches. There are three kinds of mitochondrial fluorescence probes. This paper mainly introduces and discusses the progresses of mitochondrial staining kind of fluorescent probes in recent 10 years on the basis of the fluorophore with positive charge or the introduction of positioning groups such as triphenylphosphine.

Key words：fluorescence; probe; mitochondria; cell biology; biotechnology; imaging

Corresponding author:Prof. PENG Xiaojun, pengxj@dlut.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（21136002，21422601，21421005）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目（2013CB733702）；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計劃（NCET-12-0080）；遼寧省自然科學(xué)基金項目（2013020115）。

中圖分類號：TQ 618.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0438—1157（2016）01—0176—15

DOI：10.11949/j.issn.0438-1157.20151007