不同結(jié)構(gòu)大麥多糖降血糖活性差異的研究

侯圓圓，楊延超，徐德平（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

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不同結(jié)構(gòu)大麥多糖降血糖活性差異的研究

侯圓圓，楊延超，徐德平*
（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

摘要：大麥不同溶劑提取物中多糖結(jié)構(gòu)及其降血糖效果差異的研究。用水、30 %乙醇、70 %乙醇對(duì)大麥進(jìn)行提取，最終得水提醇沉物、30 %乙醇提醇沉物、70 %乙醇提取物。將各提取物分別灌胃給予鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠，檢測(cè)其降血糖作用。用DEAE-cellulose柱、HW-55F柱和Sephacryl S-400柱分別對(duì)有降血糖作用的水提醇沉物、30 %乙醇提醇沉物進(jìn)行分離提純，各得到一種多糖。多糖（BP）I為呋喃葡萄糖分子以1→3鍵相連，α和β構(gòu)型交替出現(xiàn)，無側(cè)鏈，分子式為（C21H33O16）n；多糖（BP）II為半乳糖分子以1→4鍵相連形成主鏈，另有一個(gè)半乳糖分子連在主鏈糖分子的C-6位上，形成側(cè)鏈，分子式為（C37H62O26）n。大麥水提多糖與30 %乙醇提多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，使得兩種多糖的降血糖作用有區(qū)別。

關(guān)鍵詞：大麥；多糖；血糖；糖耐量

大麥（Hordeum vulgare L.）為禾本科植物，主要用作糧食和飼料，也是釀造啤酒的主要原料。大麥因?yàn)榉犀F(xiàn)代飲食營養(yǎng)學(xué)“三高兩低”，即高蛋白、高纖維素、高維生素、低脂肪、低糖的特性，加之鈣、磷、鐵等金屬離子含量比較充足，它的用途顯示出多元化的趨勢(shì)[1]。

大麥組成成分復(fù)雜，含有多糖、低聚糖、萜類、生物堿類、醌及其衍生物、香豆素、黃酮類等多種化合物[2-3]。有文獻(xiàn)報(bào)道[4-5]，大麥水提物和醇提物均具有降血糖作用，其活性成分多集中在β-葡聚糖上。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，大麥多糖（非β-葡聚糖）也是降血糖的主要活性成分，且不同濃度乙醇提取所得大麥多糖降血糖活性也有所差別。本實(shí)驗(yàn)以不同溶劑提取大麥多糖，通過構(gòu)建糖尿病小鼠模型，研究不同結(jié)構(gòu)大麥多糖對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用，旨在使得大麥的食療保健功能得到進(jìn)一步的開發(fā)利用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品與儀器

大麥：購于江蘇省農(nóng)墾麥芽有限公司；GF254薄層硅膠板：山東煙臺(tái)芝罘化工廠；鏈脲佐菌素：美國Sigma公司；血糖測(cè)定儀及試紙：德國羅氏診斷有限公司。

CQ-005型萃取罐：常州市特威電氣自動(dòng)化系統(tǒng)有限公司；SS-450型三足式離心機(jī)：江蘇張家港市輕工設(shè)備廠；R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申順生物科技有限公司；DFY-600型搖擺式高速中藥粉碎機(jī)：溫嶺市林大機(jī)械有限公司；TU-1900型雙光束紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DEAE-cellulose、HW-55F柱：日本TOSOH公司；Sephacryl S-400柱：Pharmacia公司。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR種雄性小鼠，4周齡，SPF級(jí)，20 g~25 g，合格證號(hào)2008001637275，上海西普爾必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)SCXK（滬）2013-0016。

1.2方法

1.2.1大麥不同溶劑提取物的制備

水提物制備：取6 kg大麥粉碎過60目篩，加入100 L提取罐中，按料液比1∶8（kg/L）加去離子水，40℃條件攪拌提取5 h，離心取濾液。濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，真空減壓濃縮至5 L。再向濃縮液中邊攪拌邊加入15 L 95 %乙醇，于3℃～4℃的冰箱內(nèi)靜置24 h，將沉淀物濾出，并用95 %的乙醇洗滌2次，得到水提醇沉物。

30 %乙醇提取物制備：取6 kg大麥粉碎過60目篩，按水提取物制備方法用30 %乙醇提取、濃縮和醇沉，得到30 %乙醇提取醇沉物。

70 %乙醇提取物制備：將6 kg大麥粉碎過60目篩，加入100升提取罐中，按料液比1∶8（kg/L）加70 %乙醇，40℃提取5 h，離心取濾液。濾渣重復(fù)提取2次，合并濾液，真空濃縮至浸膏狀，得70 %乙醇提取物。

1.2.2多糖含量按苯酚-硫酸法[6]測(cè)定

1.2.3大麥不同溶劑提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病小鼠空腹血糖的影響

對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的方法[6-8]稍作改進(jìn)，取健康ICR雄性小鼠70只，10只作正常組，其余每只腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kg，連續(xù)5 d，制造糖尿病小鼠模型，正常組腹腔注射相應(yīng)量的生理鹽水。7 d后禁食（不禁水）12 h，測(cè)空腹血糖值。選取空腹血糖值在12.0 mmol/L～18.0 mmol/L之間的小鼠50只，按血糖水平隨機(jī)分為5組：模型組、二甲雙胍（240 mg/kg）組、大麥30 %乙醇提物組（2 g/kg）、大麥水提物組（2 g/kg），大麥70 %乙醇提物組（2 g/kg），每組10只。4個(gè)給藥組分別按體質(zhì)量灌胃相應(yīng)劑量的二甲雙胍和大麥不同溶劑提取物，正常組和模型組灌胃相應(yīng)量的生理鹽水。給藥容積均為10 mL/kg，每天給藥1次，連續(xù)4周，第二周和末次給藥后禁食6 h，尾靜脈取血，測(cè)各組小鼠空腹血糖值。

1.2.4大麥不同溶劑提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病小鼠口服糖耐量的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠分組情況如表2所示，各組小鼠禁食12 h，給藥20 min后，各組均灌胃2 g/kg葡萄糖溶液，分別于0、30、60、120 min后尾靜脈取血測(cè)血糖值（BG）。計(jì)算各組曲線下面積（AUC）：

1.2.5大麥水提醇沉物的分離

將水提醇沉物過DEAE-cellulose柱，分別用去離子水、0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液洗脫。

將洗脫出來的主要組分水洗中性多糖反復(fù)過HW-55F柱和Sephacryl S-400柱進(jìn)行純化，用去離子水洗脫，并用薄層色譜進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，最終得單一組分，多糖I。

1.2.6大麥30 %乙醇提取醇沉物的分離

將30 %乙醇提取醇沉物過DEAE-cellulose柱，分別用去離子水、0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液洗脫。水洗脫部分為主要組分。將水洗脫的中性多糖反復(fù)過HW-55F柱和Sephacryl S-400柱，用去離子水洗脫，并用薄層色譜進(jìn)行跟蹤檢測(cè)，最終也得到一個(gè)單一組分，多糖II。

1.2.7大麥多糖I、II結(jié)構(gòu)測(cè)定

將多糖I、II樣品分別溶于D2O中，并以四甲基硅烷作為內(nèi)標(biāo)物，進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR、135DEPT-NMR測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1不同溶劑提取大麥多糖提取率和含量分析

實(shí)驗(yàn)前，將大麥粉碎以增加生物質(zhì)的孔隙率和提高其與提取溶劑接觸比表面積，使植物多糖充分溶解出來，從而提高植物多糖的得率和純度，并維持多糖結(jié)構(gòu)和性質(zhì)穩(wěn)定。不同溶劑提取大麥多糖提取率和含量分析見圖1。

圖1大麥各溶劑提取物中多糖提取率和含量柱狀圖Fig.1 Polysaccharide extraction yield and content histogram in the different solvent extracts of barley

由1圖可知，水提取物中大麥多糖提取率為7.367 %，含量為28.6 %；30 %乙醇提取物中大麥多糖提取率為8.892 %，含量為43.2 %。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：30 %乙醇提取物中多糖含量及提取率均高于水提取物，一般來講多糖易溶于水，水是最佳提取溶劑，本文中得出在30 %乙醇濃度條件下多糖提取率更高，分析原因是大麥中含有豐富的酶如木聚糖酶、β-葡聚糖酶等，在水提取條件下這些酶將多糖部分降解，而30 %乙醇提取條件下相關(guān)酶的活性被抑制[9]。

70 %乙醇提取物中含多糖極少，利用薄層色譜法定性分析得出提取物中含有生物堿、色氨酸等小分子物質(zhì)。與文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道的相符合。

2.2大麥不同溶劑提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體重和空腹血糖的影響

用不同溶劑分別提取大麥得到各自提取物，研究分析提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠體重和空腹血糖的影響見表1所示。

表1大麥不同溶劑提取物對(duì)鏈脲佐菌素引起的糖尿病小鼠體重和空腹血糖的影響（x±s）Table 1 Effects of different solvent extracts of barley on body weight and fasting blood sugar level in Streptozotocin-induced hyperglycemic rats（x±s）

由表1可知，灌胃給藥前，與正常組小鼠相比，各組小鼠體重?zé)o顯著性差異。各實(shí)驗(yàn)組小鼠血糖濃度與正常組小鼠相比，差異極顯著，各溶劑提取物組、陽性對(duì)照組、模型組間無顯著差異，表明糖尿病小鼠造模成功。

灌胃給藥后，與模型組小鼠體重相比，大麥水提物組小鼠的體重有所增加，差異不顯著，大麥30 %乙醇提物組和二甲雙胍組小鼠體重增加明顯，差異顯著。說明大麥多糖能夠有效改善糖尿病小鼠體重減少的癥狀。與各組給藥前空腹血糖相比，給藥4周后，水提物（2 g/kg）組小鼠空腹血糖值下降18.0 %，大麥30 %乙醇提物（2 g/kg）組小鼠空腹血糖值下降27.7 %，大麥70 %乙醇提取物（2 g/kg）組小鼠空腹血糖值基本不變。與模型組小鼠空腹血糖相比，大麥水提物（2 g/kg）組小鼠空腹血糖值有顯著性降低，差異具有顯著性（P＜0.05）；大麥30 %乙醇提物（2 g/kg）組小鼠空腹血糖值也顯著性降低，差異具有顯著性（P＜0.01）。

以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：大麥多糖能夠緩和糖尿病小鼠因糖代謝紊亂引起的體重減少癥狀，且可有效地控制糖尿病小鼠空腹血糖水平。大麥30 %乙醇提取物比水提取物在降低鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的空腹血糖值上作用效果更顯著。而大麥70 %乙醇提物沒有降血糖作用。

2.3大麥不同溶劑提取物對(duì)鏈脲佐菌素誘發(fā)的高血糖小鼠口服糖耐量的影響

葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)受損以及胰島素敏感性降低是糖尿病模型小鼠的明顯癥狀，口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)可以表征胰島β細(xì)胞功能和機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力以及高血糖對(duì)葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)損害的大小，結(jié)果如圖2所示。葡萄糖耐量曲線下積分面積見表2。

圖2各組小鼠口服葡萄糖耐量（OGTT）曲線Fig.2 Oral glucose tolerance（OGTT）curves of different group mice

表2各組小鼠葡萄糖耐量曲線下積分面積（x±s）Table 2 Integral area of each group mice under glucose（x±s）

由圖2可以看出，正常組小鼠空腹血糖濃度于實(shí)驗(yàn)開始后30 min達(dá)到最大值，并在120 min內(nèi)，血糖恢復(fù)到基礎(chǔ)水平。模型組小鼠在30 min~60 min內(nèi)，血糖值處于較高水平并保持穩(wěn)定，到120 min時(shí)仍未有顯著下降，表明糖尿病模型小鼠胰島素分泌延遲，胰島β細(xì)胞功能受損、機(jī)體對(duì)血糖的調(diào)節(jié)能力下降，葡萄糖耐量受損嚴(yán)重，葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)紊亂。二甲雙胍組小鼠在30 min~120 min內(nèi)血糖值下降非常明顯，120 min時(shí)血糖值接近正常組小鼠。水提取物組小鼠的血糖值在0 min~30 min內(nèi)比30 %乙醇提取物組上升的更快，此后，兩組小鼠血糖值下降的幅度差別不大。70 %乙醇提取物組在0 min~30 min內(nèi)血糖值雖然上升的幅度接近水提取物組，但是在120 min時(shí)血糖值仍大于水提取物組并且接近于模型組。

表2表明，陽性對(duì)照組AUC與模型組小鼠相比明顯減小，差異極顯著；大麥水提物和30 %乙醇提取物組AUC與模型組小鼠相比減小，差異顯著。

圖2和表2結(jié)果共同表明，大麥水提取物、30 %乙醇提取物均能有效減慢葡萄糖的吸收速率，減輕胰島負(fù)擔(dān)，從而改善糖尿病模型小鼠葡萄糖耐量受損，改善葡萄糖內(nèi)穩(wěn)態(tài)。且30 %乙醇提取物作用效果更佳。然而70 %乙醇提取物作用效果不顯著。

2.4大麥水提物與30 %乙醇提取物多糖結(jié)構(gòu)鑒定

經(jīng)1H-NMR、13C-NMR、135DEPT-NMR解析鑒定，得大麥水提物中的多糖為呋喃葡萄糖分子以1→3鍵相連，α和β構(gòu)型交替出現(xiàn)，無側(cè)鏈。結(jié)構(gòu)式如圖3所示。

圖3大麥水提取物多糖的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structural formula of Barley polysaccharides I

大麥30 %乙醇提取物中的多糖為半乳糖分子以1→4鍵相連形成主鏈，另有一個(gè)半乳糖分子連在主鏈糖分子的C-6位上，形成側(cè)鏈。結(jié)構(gòu)式如圖4所示。

圖4大麥30 %乙醇提取物中的多糖結(jié)構(gòu)Fig4. Structural formula of Barley polysaccharides II

3結(jié)果與討論

糖尿病是一類由遺傳、環(huán)境、免疫等因素引起的具有明顯異質(zhì)性的慢性高血糖癥及并發(fā)癥所組成的綜合癥。當(dāng)前在我國所用的口服降血糖藥物主要有三大類：胰島素促泌劑、胰島素增敏劑及α-葡萄糖苷酶抑制劑。目前研究的重點(diǎn)是胰島素促泌劑，而從植物藥中提取抗高血糖的有效成分是一個(gè)研究的熱點(diǎn)。

多糖（polysaccharides）廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，是一種具有多種生物活性的大分子，在促進(jìn)免疫、抗突變、降血脂、降血糖、抗病毒等諸多方面都有著獨(dú)特的療效[11]。許多植物多糖具有降血糖作用，如茶多糖[12]，山藥多糖[13]等，本研究中發(fā)現(xiàn)大麥水提取物多糖、30 %乙醇提取物多糖都有降血糖活性，從多糖提取率來看，水提取物中多糖提取率和含量均低于30 %乙醇提取物，分析原因是大麥中豐富的酶如木聚糖酶、β-葡聚糖酶、異構(gòu)酶，水提取時(shí)這些酶能降解多糖，使多糖提取率下降，在30 %乙醇提取時(shí)酶活受到抑制，使得提取率相對(duì)較高。

大麥30 %乙醇提取物比水提取物在降低鏈脲佐菌素誘發(fā)的高血糖小鼠的空腹血糖和提高其糖耐量方面上作用效果更顯著。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)大麥水提取物中的多糖為呋喃葡萄糖分子以1→3鍵相連，30 %乙醇提取物的多糖為半乳糖分子以1→4鍵相連形成主鏈，另有一個(gè)半乳糖分子連在主鏈糖分子的C-6位上，形成側(cè)鏈。其降血糖活性的差異是源于多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同。因而大麥多糖分子結(jié)構(gòu)與生物活性之間的構(gòu)效關(guān)系以及多糖分子的降血糖機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]謝明勇,聶少平.天然產(chǎn)物活性多糖結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J].中國食品學(xué)報(bào),2010,10(2):1-11

[2] Ahmed F,Sairam S,Urooj A.In vitro hypoglycemic effects of selected dietary fiber sources[J].J Food Sci Technol,2011,48(3):285-289

[3] Alminger M,Eklund-Jonsson C.Whole-grain cereal products based on a high-fibre barley or oat genotype lower post-prandial glucose and insulin responses in healthy humans[J]. Eur J Nutr,2008 (47): 294-300

[4] Yokoyama W H, Hudson C A, Knuckles B Chiu,et a1.Effect of barley β-glucan in durum wheat pasta on human glycemic response[J]. Cereal Chemistry,1997,74(3):293-296

[5] Tembhurne S V, Sakarkar D M. Anti-obesity and hypoglycemic effect of ethanolic extract of Murraya koenigii (L) leaves in high fatty diet rats[J], Asian Pacific Journal of Tropical Disease,2012,2:S166-S168 [6]秦川.貫葉連翹褪黑素測(cè)定及其提取物降血糖作用的初步研究[D].陜西:陜西師范大學(xué),2013

[7]陳福軍,盧軍,張永煜.桑葉降血糖有效組分對(duì)糖尿病動(dòng)物糖代謝的影響[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào),1996,1(1):24-26

[8]張文,陳建偉,李祥,等.猴頭菌粉提取物對(duì)2型糖尿病小鼠降血糖作用研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012, 7(18):176-180

[9]單守水,程美科,王芳,等.非淀粉粘性多糖酶在大麥水解中的應(yīng)用研究[J] .食品研究與開發(fā)2008,4(29):34-38

[10]夏巖石.大麥生物活性成分的遺傳分析及應(yīng)用研究[D].廣州:華南理工大學(xué),2012

[11]陳海華,董海洲.大麥的營養(yǎng)價(jià)值及其在食品工業(yè)中的開發(fā)利用[J].山東食品發(fā)酵,2002,1(1):28-30

[12]王黎明,夏文水.茶多糖降血糖機(jī)制的體外研究[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2010,3(29):354-358

[13]楊宏莉,張宏馨,李蘭會(huì),等.山藥多糖對(duì)2型糖尿病大鼠降糖機(jī)理的研究[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,3(33):100-103

Study on the Hypoglycemic Effect of Different Structures of Barley Polysaccharide

HOU Yuan-yuan，YANG Yan-chao，XU De-ping*
（School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China）

Abstract：Study on the hypoglycemic effect of different structures of barley polysaccharide. Streptozotocininduced diabetic mice model was built，in which the hypoglycemic effect of barley malt water extract，30 % ethanol extract，70 % ethanol extract was determined. The water extract and 30 % ethanol extract from barley malt decreased fasting plasma glucose of the diabetes mice and reduce blood glucose area under the curve. Further isolation of the water extract and 30 % ethanol extract，BP I was isolated from water extract by DEAE-cellulose，HW-55F and Sephacryl S-400. BP II was further isolated from 30 % ethanol extract by DEAE-cellulose，HW-55F and Sephacryl S-400. BP I consists only of glucofuranose units joined by 1→3 bond，and both of α and β configureation appear alternately. The main chain of BP II was galactoses linked by 1→4 bond，and the galactose，forming lateral chain，was linked to C-6 of the galactose in the main chain.

Key words：barley；polysaccharides；blood glucose；glucose tolerance

收稿日期：2014-09-09

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.02.011

*通信作者：徐德平，副教授，主要從事天然產(chǎn)物化學(xué)方面的研究。

作者簡介：侯圓圓（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。