MTA2基因敲除抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞株增殖和遷移能力

翁 偉，徐元宏，宋曉菲

MTA2基因敲除抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞株增殖和遷移能力

翁 偉1，徐元宏1，宋曉菲2

目的探討人乳腺癌MDA-MB-231細胞MTA2基因敲減后，人乳腺癌生物學特性的改變。方法體外化學合成MTA2序列特異性的shRNA，經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染人乳腺癌細胞系MDA-MB-231后，挑選出穩(wěn)定低表達MTA2的細胞株。收集敲除了MTA2的細胞，定量實時熒光PCR（qRT-PCR）、Western blot法分別檢測MTA2 mRNA和蛋白的抑制水平。采用CCK-8法、Transwell遷移實驗以及劃痕實驗觀察敲減MTA2對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移能力的影響，體外利用裸鼠荷瘤實驗進一步觀察MTA2敲除后乳腺癌生長、轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果MTA2的shRNA有效地抑制了MTA2 mRNA和蛋白水平（P＜0.05）。shRNA干擾MTA2組的MDA-MB-231細胞，細胞增殖能力顯著降低（P＜0.05）；細胞侵襲、遷移能力明顯降低（P＜0.05）；裸鼠荷瘤實驗中MTA2下調(diào)組瘤體明顯更小，而且肺部轉(zhuǎn)移灶明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論MTA2被穩(wěn)定干擾后，乳腺癌的某些惡性生物學行為能有效抑制；表明MTA2與乳腺癌的生長、轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。

RNA干擾；MTA2；乳腺癌；生長；轉(zhuǎn)移

轉(zhuǎn)移相關(guān)基因家族（metastasis-associated gene family，MTA）家族包含3個成員，MTA1、MTA2和MTA3。MTA1在很多腫瘤中高表達，如乳腺癌、食管癌、胰腺癌和肝細胞肝癌等［1］，并且參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移和浸潤［2-3］。MTA2在蛋白結(jié)構(gòu)上與MTA1具有很高的同源性，并且與核小體重構(gòu)及組蛋白去乙?；窷uDR復(fù)合物有關(guān)［4-5］。因此MTA2也可能參與了實體腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。RNA干擾技術(shù)可以有效地在轉(zhuǎn)錄后水平沉默基因，是一種具有高度特異性、高效性以及自我維持能力的技術(shù)，目前已成為基因沉默療法更為理想的工具［6］。該研究組體外化學合成MTA2的shRNA，進行慢病毒包裝，構(gòu)建穩(wěn)定低表達MTA2基因的細胞株MDA-MB-231。通過對該細胞系與未感染慢病毒的細胞進行細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力的對比，以及裸鼠荷瘤實驗中兩組裸鼠瘤體大小及肺部轉(zhuǎn)移灶的差別，觀察MTA2干擾后人乳腺癌生物學特性的改變。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人乳腺癌細胞系MDA-MB-231（中科院細胞庫）；MTA2、β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成；RNA TRIzol（美國Invitrogen公司）；PrimerScript RT reagent Kit、SYBR Premix EX TagTM試劑（日本TaKaRa公司）；小鼠抗人單克隆抗體MTA2、β-actin以及羊抗鼠二抗（美國Santa Cruz公司）；NC shRNA以及特異性干擾MTA2的shRNA序列由上海吉凱公司合成；MTA2的shRNA序列為5′-CCCTCTTGAATGAGACAGATACTCGAGTATCTGT CTCATTCAAGAGGG-3'；Transwell小室（美國Corning公司）；Matrigel膠（美國BD公司）。

1.2 方法

1.2.1定量實時熒光PCR（qRT-PCR）法檢測MTA2的mRNA表達 轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，按TRIzol試劑說明書提取總RNA，經(jīng)PrimeScript RT reagent Kit合成cDNA。然后使用SYBR Premix EXTaqTM試劑，進行熒光PCR定量檢測。MTA2上游引物：5′-TGTACCGGGTGGGAGATTAC-3′，下游引物：5′-TGAGGCTACTAGAAATGTCCCTG-3′。β-actin為內(nèi)參，上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 s，94℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)。Ct值為每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)，空白對照組與實驗組及陰性對照組的比較以MTA2熒光定量結(jié)果的Ct值減去β-actin的Ct值得ΔCt，以空白對照組RNA的ΔCt作為矯正數(shù)，計算2-ΔΔCt值，以2-ΔΔCt值為MTA2基因的相對表達量。

1.2.2Western blot法檢測 用RIPA和PMSF提取轉(zhuǎn)染48 h的各組培養(yǎng)細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。經(jīng)12%SDS-PAGE膠電泳后轉(zhuǎn)膜，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜。次日加二抗37℃溫育1 h，ECL發(fā)光液顯色。以β-actin為內(nèi)參。

1.2.3熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率 參照吉凱基因提供的說明書，在轉(zhuǎn)染后8 h熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖能力 正常和感染了病毒的MDA-MB-231細胞分別混懸，按5×103個/孔接種于96孔板。分別于培養(yǎng)后1、2、3、4、5 d為檢測點。每次檢測前，在培養(yǎng)液中每孔加入10μl CCK-8試劑，37℃溫箱孵育2 h，然后用酶標儀檢測450 nm處吸光度值。吸光度值代表細胞增殖情況。1.2.5劃痕試驗 取對數(shù)生長期MDA-MB-231細胞，按1×105個孔接種于6孔板，溫育24 h后分別加入濃度50 nmol含有Lv-shNC（陽性對照組）或Lv-shMTA2（實驗組）的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后細胞已鋪滿6孔板，利用槍頭尖在細胞培養(yǎng)液表面劃一條劃痕（長約為2 cm），繼續(xù)培養(yǎng)12、24 h后鏡下觀察各組MDA-MB-231細胞遷移變化情況。

1.2.6Transwell侵襲試驗 將Matrigel膠（50μl/孔）均勻地鋪在Transwell小室膜上，收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組細胞2×105個，用200μl無血清1640培養(yǎng)液稀釋后接種到小室中，將小室置于加有600μl 15%FBS 1640培養(yǎng)液的24孔板內(nèi)，37℃、5%CO2孵育72 h后取出小室，小心擦掉小室細胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，4%多聚甲醛固定，Giemsa染色，顯微鏡下計數(shù)5個視野的細胞數(shù)，求出每個視野的平均穿膜細胞數(shù)。

1.2.7裸鼠荷瘤實驗 將分別感染了Lv-shNC和Lv-shMTA2病毒顆粒的MDA-MB-231細胞混懸，以200μl/支的細胞懸液注射入乳腺脂肪墊。兩組裸鼠除注射的細胞懸液不同外，操作一致。以后每隔3 d檢測一次裸鼠荷瘤的瘤體大小。到第30天將兩組裸鼠安樂死。分別解剖，觀察計數(shù)肺部轉(zhuǎn)移灶情況。

1.3 統(tǒng)計學處理應(yīng)用SPSS 15.0軟件進行分析，計量資料以-x±s表示。組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR及Westernblot法檢測shRNA干擾MTA2基因及蛋白的表達分別感染了含LvshNC和Lv-shMTA2的病毒顆粒轉(zhuǎn)MDA-MB-231細胞內(nèi)，當細胞生長密度達到約70%時，在熒光顯微鏡下觀察：計數(shù)100個細胞，其中有綠色熒光的約占80%。見圖1。轉(zhuǎn)染后48 h分別收集細胞的總RNA和總蛋白，經(jīng)qRT-PCR分析可見實驗組MTA2相對量（1.090±0.098）較陰性對照組（0.205± 0.004）顯著降低（t=20.18，P＜0.05）。見圖2。Western blot法檢測實驗組和陰性對照組MTA2蛋白水平也表明，實驗組的MTA2水平顯著降低。見圖3。提示MTA2在人乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞內(nèi)被明顯敲除。

2.2 MTA2干擾后MDA-MB-231細胞增殖能力檢測CCK-8法顯示，陰性對照組與實驗組在第二個監(jiān)測點（第2天）時開始出現(xiàn)明顯差異，表現(xiàn)為實驗組細胞增殖能力明顯降低，到第5天時實驗組細胞吸光度值為（4.67±0.09），而陰性對照組為（2.47±0.12），實驗組約為陰性對照組細胞活力的一半（F=9.220，P＜0.05）。見圖4。

2.3 MTA2敲除后細胞侵襲、遷移能力的變化劃痕試驗顯示，隨著時間的推移，陰性對照組愈合速度較實驗組快（圖5）；Transwell遷移試驗顯示，在高倍鏡視野下，陰性對照組的細胞數(shù)目顯著高于實驗組［（591.0±32.1）vs（237.0±20.4），P＜0.05］，見圖6。因此，MTA2被敲減后，MDA-MB-231細胞的侵襲、遷移能力明顯降低。

2.4 MTA2干擾后腫瘤大小及肺部轉(zhuǎn)移灶的改變

為了在體內(nèi)研究MTA2干擾后乳腺癌生長的改變以及乳腺癌轉(zhuǎn)移到肺部的轉(zhuǎn)移灶變化情況，進行了裸鼠荷瘤實驗。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了shMTA2后，小鼠負荷的腫瘤大小明顯較陰性對照組小。而在計數(shù)肺部轉(zhuǎn)移灶時顯示，陰性對照組有4只裸鼠出現(xiàn)了肺部轉(zhuǎn)移灶（4/6），這4只裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶個數(shù)分別為32、45、15、40個。實驗組6只裸鼠則有3只出現(xiàn)了肺部轉(zhuǎn)移灶（3/6），3只裸鼠肺部轉(zhuǎn)移灶個數(shù)分別為9、10、4個。說明MTA2干擾后，乳腺癌細胞的肺轉(zhuǎn)移能力也明顯被抑制（P＜0.05），見圖7。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在我國位居女性惡性腫瘤發(fā)生率的首位。據(jù)GLOBOCAN 2008統(tǒng)計，乳腺癌新發(fā)病例占2011年所有腫瘤的23%，并且占所有腫瘤致死病例的14%［7］?？梢姡橄侔﹪乐赝{女性的健康，因此探索乳腺癌的發(fā)病機制及尋求臨床治療的分子靶點對乳腺癌的診斷及防治有重要意義。目前RNA技術(shù)是分子水平研究疾病的常用手段，RNA干擾技術(shù)的發(fā)現(xiàn)及其應(yīng)用為乳腺癌的基因治療帶來了新的思路［6］。

腫瘤轉(zhuǎn)移是目前腫瘤治療的關(guān)鍵障礙。腫瘤的轉(zhuǎn)移包括很多步驟，涉及很多分子表達的改變［8-11］。這些分子主要與腫瘤轉(zhuǎn)移及分子黏附相關(guān)。研究［10］顯示，敲除黏附分子plakoglobin，顯著降低了乳腺癌的侵襲能力。此外，C末端結(jié)合蛋白2（CtBP2）也被認為與乳腺癌的遷移有關(guān)［10-11］。研究［1-3］顯示，MTA1在多種實體腫瘤中呈高表達，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。結(jié)構(gòu)上MTA2與MTA1類似，因此也被廣泛研究。MTA2首先被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌中高表達［4］。此后，MTA2相繼被發(fā)現(xiàn)在卵巢上皮癌、肝細胞肝癌、非小細胞肺癌存在異常表達，且與腫瘤的浸潤性表型相關(guān)，如腫瘤更大、預(yù)后更差以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等［12-14］。但是雖然MTA2與MTA1結(jié)構(gòu)類似，MTA1在乳腺癌中已被證實與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)，有關(guān)于MTA2在乳腺癌中的作用卻很少有報道。

本研究結(jié)果顯示，MTA2特異性shRNA處理后，細胞的增殖能力明顯受限，到第5天時，實驗組約為陰性對照組細胞數(shù)目的一半。而進一步的Transwell實驗顯示，MTA2敲除后，MDA-MB-231細胞的侵襲、遷移能力也明顯受抑制，說明癌細胞的生長和增殖能力均下降。裸鼠荷瘤實驗顯示，感染特異性干擾MTA2的RNA病毒后，瘤體較小，且肺部轉(zhuǎn)移灶明顯減少，這與體外實驗結(jié)果一致，表明抑制MTA2后，乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移能力受限，進一步說明MTA2有促進乳腺癌生長、轉(zhuǎn)移的能力。

MTA2在腫瘤的調(diào)節(jié)機制還不清楚。研究［4］顯示，MTA2是NuRD復(fù)合物的重要組成部分。其功能很可能與NuRD密切相關(guān)。研究［15］顯示MTA2促進胃癌促進生長和轉(zhuǎn)移，并且受轉(zhuǎn)錄蛋白sp1調(diào)節(jié)。因此，進一步研究MTA2促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的機制將有利于為乳腺癌轉(zhuǎn)移的防治提供新的思路。

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Inhibition of M TA2 suppresses the proliferation and m igration of MDA-MB-231 breast cancer cells

Weng Wei1，Xu Yuanhong1，Song Xiaofei2
（1Dept of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of AnhuiMedical University，Hefei 230022；2Dept of Blood Transfusion，Tongling First People's Hospital，Tongling 244009）

ObjectiveTo study the expression and role ofmetastasis-associated tumor gene family 2（MTA2）in human breast cancer.MethodsThe shRNA sequence targeting human MTA2 gene was designed and chemically synthesized，then we constructed MDA-MB-231 cell lines that stably expressed the specific shRNA against MTA2，mRNA and protein levels of MTA2 were detected by quantitative Real-time polymerase chain reaction（qRT-PCR）and Western blot，respectively.CCK-8 and Transwell assay were performed to detect the MDA-MB-231 cell viability and metastasis in vitro，xenograftmodel was constructed to investigate cancerous cell growth and metastasis ability in vivo.ResultsKnockdown of MTA2 by lentivirus-delivered shRNA againstMTA2（Lv-shMAT2）significantly reduced mRNA and protein levels of MTA2 in MDA-MB-231 cell line（P＜0.05）.Lv-shMAT2 significantly slowed down cell proliferation and invasion.Furthermore，depletion of MAT2 significantly limited tumor growth and tumor transfer to lung in a xenograftmodel.ConclusionDepletion of MTA2 could significantly inhibit human breast cancer cell growth and metastasis，implying that MTA2 might be involved in the progression of breast cancer.

RNA interference；MTA2；breast cancer；growth；metastasis

R 737.9

A

1000-1492（2016）03-0373-05

時間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.028.html

2015-12-08接收

安徽省科技創(chuàng)新公共服務(wù)平臺項目（編號：PT20081011）作者單位：1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，合肥 230022

2銅陵市人民醫(yī)院輸血科，銅陵 244009

翁 偉，男，主管檢驗師；

徐元宏，男，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：xyhong1964@163.com