PEDF對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲能力和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

程 宇，束 軍，徐 勝，李曉峰

PEDF對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲能力和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

程 宇，束 軍，徐 勝，李曉峰

目的觀察色素上皮衍生因子（PEDF）對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移、侵襲能力以及對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白如纖維連接蛋白（FN）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）表達(dá)水平的影響。方法設(shè)不加PEDF的肺腺癌A549細(xì)胞為陰性對(duì)照組，PEDF干預(yù)組細(xì)胞分別加入180、360和720 nmol/L PEDF；Transwell檢測(cè)PEDF對(duì)A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響；半定量RT-PCR法檢測(cè)PEDF對(duì)FN、MMP-9mRNA表達(dá)水平的影響；ELISA法檢測(cè)PEDF對(duì)A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和細(xì)胞內(nèi)的FN、MMP-9蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果PEDF干預(yù)組的A549細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著低于陰性對(duì)照組（P＜0.05），隨著PEDF濃度的增加，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少（P＜0.05）。各濃度PEDF干預(yù)組A549細(xì)胞的FN、MMP-9表達(dá)水平較陰性對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），隨著PEDF濃度的增加，F(xiàn)N、MMP-9表達(dá)水平逐漸降低（P＜0.05）。結(jié)論P(yáng)EDF在體外能顯著抑制肺腺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力，能顯著抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白（FN、MMP-9）的表達(dá)水平。

色素上皮衍生因子；肺腺癌；轉(zhuǎn)移；遷移；侵襲

肺癌在惡性腫瘤發(fā)病率及死亡率中居于首位。全世界每年新發(fā)肺癌病例數(shù)為180多萬(wàn)，占所有惡性腫瘤的13%；因肺癌導(dǎo)致的死亡患者近160萬(wàn)，占所有惡性腫瘤死亡的19.4%［1］。轉(zhuǎn)移是肺癌患者預(yù)后不良的重要因素，對(duì)其轉(zhuǎn)移能力的研究對(duì)于肺癌患者的治療和預(yù)后有非常重要的意義。腫瘤的轉(zhuǎn)移是有多步驟的復(fù)雜過(guò)程，其中腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellularmatrix，ECM）之間的相互作用在介導(dǎo)和調(diào)節(jié)腫瘤的轉(zhuǎn)移中起重要作用［2］。纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，參與細(xì)胞黏附、遷移、侵襲和腫瘤轉(zhuǎn)移。同時(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）介導(dǎo)的ECM的降解對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有重要意義［3］。色素上皮衍生因子（pigment epithelial-derived factor，PEDF）在體內(nèi)生理和病理過(guò)程中有多種活性，包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抗血管生成、抗腫瘤生成和抗轉(zhuǎn)移等。然而，關(guān)于PEDF對(duì)肺腺癌轉(zhuǎn)移能力的影響及其機(jī)制目前仍不十分清楚。該研究旨在觀察不同濃度PEDF對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，以及對(duì)轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白FN和MMP-9表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器人肺腺癌細(xì)胞株A549由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原微生物實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。人重組PEDF蛋白（美國(guó)Peprotech公司）；Matrigel膠（美國(guó)B&D公司）；Transwell小室（美國(guó)Corning公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國(guó)Thermo Scientific公司）；ELISA試劑盒（上海源葉公司）；TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）；RT-PCR引物（上海Invitrogen公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)HyClone公司）；DEPC（美國(guó)Sigma公司）；DL2000 DNA Marker（日本TaKaRa公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；PCR儀（德國(guó)Biometra公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；JD-801凝膠成像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）；超低溫冰箱（日本Sanyo公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞。細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長(zhǎng)，每2～3 d傳代1次。

1.3 PEDF干預(yù)組與陰性對(duì)照組肺腺癌A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力

1.3.1A549細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，PEDF干預(yù)組分別加入720、360和180 nmol/L PEDF，陰性對(duì)照組不加PEDF，分別作用于A549細(xì)胞24 h。常規(guī)消化，1 000 r/min離心5 min后，用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整各組A549細(xì)胞密度為2×105/m l，取100μl細(xì)胞懸液輕輕加入Trasnwell小室上室，下室中加入10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基600μl，每組3個(gè)復(fù)孔。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄上室內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗兩遍，4%多聚甲醛固定30 min，風(fēng)干后用0.1%結(jié)晶紫染色液染色約30 min，醫(yī)用棉棒輕輕擦去小室膜上表面尚未穿過(guò)的細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡（×200）下觀察拍照，400倍高倍鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨機(jī)選取6個(gè)高倍鏡視野/孔計(jì)數(shù)穿過(guò)底膜的細(xì)胞數(shù)，即遷移細(xì)胞數(shù)，取平均值作為結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2A549細(xì)胞體外侵襲實(shí)驗(yàn) Martigel膠4℃融化后，用4℃預(yù)冷的無(wú)血清1640培養(yǎng)基按1∶8比例稀釋Matrigel。在Transwell上室底部加入50 μl稀釋后的Matrigel，鋪滿(mǎn)小室底，置37℃培養(yǎng)箱干燥30 min，待Martrigel膠凝固后，小心棄去上層析出的液態(tài)培養(yǎng)基，每個(gè)小室再加入50μl無(wú)血清1640培養(yǎng)基，置于37℃30 min水化基底膜。后續(xù)步驟同Transwell遷移實(shí)驗(yàn)。

1.4 半定量RT-PCR法檢測(cè)肺癌A549細(xì)胞株中FN、MMP-9mRNA

1.4.1RNA提取 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，PEDF干預(yù)組分別加入720、360和180 nmol/L PEDF，陰性對(duì)照組不加PEDF，分別作用于A549細(xì)胞24 h后重懸細(xì)胞，加入TRIzol（1 m l），吹打后分別吸入EP管（無(wú)RNA酶）中，加入0.2 ml氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上靜置3 min，低溫4℃12 000 r/min離心15 min，取上清液至另一EP管中，加入0.5 ml異丙醇溫和混勻，冰上靜置10 min，低溫4℃12 000 r/min離心10 min，棄上清液，加1 ml75%乙醇（DEPC處理水配制），低溫4℃7 500 r/min離心5 min，棄上清液，室溫放置10 min干燥RNA沉淀，加20μl DEPC水于55℃促溶RNA，-80℃保存。

將樣品稀釋后，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量各組在260、280 nm波長(zhǎng)的吸光度（absorbance，A），計(jì)算A260/A280，要求比值在1.8～2.0，表明純度較高。

1.4.2使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA

各組分別取總RNA 2μg，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，最后合成cDNA產(chǎn)物總體積為20μl，放入-20℃保存。

1.4.3PCR擴(kuò)增 以合成的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。FN的上游引物為：5′-TCGAGGAGGAAATTCCAATG-3′，下游引物為：5′-CTCTTCATGACGCTTGTGGA-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度382 bp；MMP-9的上游引物為：5′-GGCGCTCATGTACCCTATGT-3′，下游引物為：5′-TCAAAGACCGAGTCCAGCTT-3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度468 bp；GAPDH的上游引物為：5′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，下游引物為：5′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。PCR儀擴(kuò)增，程序?yàn)?5℃5 min，（95℃30 s，55℃40 s，72℃50 s）35個(gè)循環(huán)，72℃10 min，4℃10 min。

1.4.4瓊脂糖凝膠電泳 用0.8%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，每100 ml瓊脂糖凝膠溶液加5μl核酸染料。凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并進(jìn)行拍照，分析比較各組FN、MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液和細(xì)胞內(nèi)FN、MMP-9蛋白含量取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期細(xì)胞，PEDF干預(yù)組分別加入720、360和180 nmol/L PEDF，陰性對(duì)照組不加PEDF，分別作用于A549細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，4℃3 000 r/min離心20 min，小心吸取上清液，分裝后于-80℃凍存?zhèn)溆?；然后將A549細(xì)胞消化離心（1 000 r/min、5 min），重懸后用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，取含106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液離心，1 m l PBS重懸后，每管細(xì)胞加100μl細(xì)胞裂解液，用吸管吹打數(shù)下，使細(xì)胞和裂解液充分接觸，室溫裂解1 h，再用反復(fù)凍融方法裂解細(xì)胞，隨后4℃12 000 r/min離心30 min，小心吸取上清液，分裝后于-80℃凍存?zhèn)溆?。依?jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)FN、MMP-9蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用-x±s表示，多組樣本均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，并進(jìn)行Levene′s方差齊性檢驗(yàn)，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以α =0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 PEDF抑制A549細(xì)胞的遷移720、360和180 nmol/L PEDF干預(yù)組和陰性對(duì)照組的遷移細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為（16.44±3.47）、（30.78±2.17）、（42.11±2.36）、（63.67±1.45）個(gè)。與陰性對(duì)照組相比，各濃度PEDF干預(yù)組遷移細(xì)胞數(shù)均明顯減少，且隨著PEDF濃度的增加，遷移細(xì)胞數(shù)逐漸減少，各干預(yù)組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=138.831，P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 PEDF抑制A549細(xì)胞的侵襲720、360和180 nmol/L PED干預(yù)組和陰性對(duì)照組的侵襲細(xì)胞個(gè)數(shù)分別為（11.44±1.58）、（21.67±1.20）、（35.11±2.71）、（44.89±1.07）個(gè)。與陰性對(duì)照組相比，各濃度PEDF干預(yù)組侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯減少，且隨著PEDF濃度的增加，侵襲細(xì)胞數(shù)逐漸減少，各干預(yù)組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=208.998，P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 RT-PCR結(jié)果720、360和180 nmol/L PEDF干預(yù)組和陰性對(duì)照組A549細(xì)胞中FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是（0.245±0.016）、（0.378± 0.021）、（0.488±0.040）和（0.616±0.026）（圖3），MMP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別是（0.378± 0.020）、（0.521±0.047）、（0.711±0.016）和（0.859±0.021）（圖4）。與陰性對(duì)照組相比，各濃度PEDF干預(yù)組A549細(xì)胞的FN、MMP-9 mRNA表達(dá)水平均明顯降低。隨著PEDF干預(yù)劑量增加，F(xiàn)N mRNA表達(dá)水平逐漸降低，各干預(yù)組間組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=100.161，P＜0.05）；MMP-9 mRNA表達(dá)水平也逐漸降低（F=156.162，P＜0.05）。見(jiàn)圖5、6。

2.4 ELISA結(jié)果比較不同濃度PEDF處理的A549細(xì)胞培養(yǎng)上清液中和細(xì)胞內(nèi)FN、MMP-9蛋白濃度，PEDF干預(yù)組比陰性對(duì)照組A549細(xì)胞上清液中和細(xì)胞內(nèi)的FN、MMP-9表達(dá)水平均明顯降低。隨著PEDF干預(yù)劑量增加，細(xì)胞上清液中FN的表達(dá)水平逐漸降低，不同劑量PEDF干預(yù)組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=446.055，P＜0.05），細(xì)胞內(nèi)FN的表達(dá)水平依次遞減（F=70.117，P＜0.05），細(xì)胞上清液中MMP-9的表達(dá)水平（F=1 009.000，P＜0.05）和細(xì)胞內(nèi)MMP-9的表達(dá)水平（F= 1 719.000，P＜0.05）也均逐漸降低。見(jiàn)表1、2。

3 討論

PEDF廣泛表達(dá)于人體組織，包括腦、眼、脊髓、肝、血漿、骨、心臟和肺。PEDF是Tombran-Tink et al［4］首次在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)并提取到的多功能糖蛋白，最初被鑒定為人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生的神經(jīng)元分化因子。

Chen et al［5］發(fā)現(xiàn)在肺腺癌A549細(xì)胞和肺鱗癌SKMES1細(xì)胞中，人重組PEDF蛋白顯著降低肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力；同時(shí)在肺癌組織中，PEDF的低表達(dá)與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和肺癌病人的不良預(yù)后密切相關(guān)。鄭民等［6］在對(duì)50例非小細(xì)胞肺癌組織的研究中發(fā)現(xiàn)，PEDF陽(yáng)性組的微血管密度值和在發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者中所占的比例均低于PEDF陰性組，表明PEDF可能通過(guò)抑制微血管的形成從而抑制肺癌的轉(zhuǎn)移，PEDF的檢測(cè)可能對(duì)于判斷肺癌是否發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有一定的意義。研究［7］顯示野生型PEDF和三磷酸突變的PEDF都能夠通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和腫瘤內(nèi)血管的破裂來(lái)抑制新生血管生成，阻礙內(nèi)皮細(xì)胞和人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞本身的遷移。He etal［8］發(fā)現(xiàn)在Lewis肺癌鼠模型中，腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的PEDF基因表達(dá)能夠在體內(nèi)抑制其血管生成。馬建梅等［9］發(fā)現(xiàn)PEDF能有效抑制肺鱗癌細(xì)胞SK-MES-1的侵襲能力，對(duì)肺鱗癌的轉(zhuǎn)移可能發(fā)揮潛在的對(duì)抗效應(yīng)。這些結(jié)果表明，PEDF可能有潛在的抑制肺癌及其惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。本研究中肺腺癌A549細(xì)胞體外遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEDF能有效抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

關(guān)于FN和MMPs各自不同功能的研究已有不少，但是關(guān)于PEDF與FN、MMPs之間的相互作用仍然知之甚少。關(guān)于PEDF與FN相互關(guān)系的研究［10］發(fā)現(xiàn)，PEDF在體內(nèi)和體外均能顯著抑制乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移；并且，PEDF通過(guò)p-ERK和p-AKT信號(hào)通路下調(diào)纖維連接蛋白和隨后的MMP2/MMP9的表達(dá)來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的遷移和侵襲。在前列腺癌、乳腺癌和骨肉瘤等惡性腫瘤細(xì)胞中，已發(fā)現(xiàn)PEDF特異性下調(diào)膜型基質(zhì)金屬蛋白酶（MT1-MMP）和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2），這兩種在轉(zhuǎn)移性腫瘤中最常見(jiàn)的基質(zhì)金屬蛋白酶。在對(duì)64例膀胱腫瘤組織的關(guān)于PEDF與MMP-9相互關(guān)系的免疫組化研究［11］中發(fā)現(xiàn)，相比于正常尿路上皮，PEDF表達(dá)顯著下降，而VEGF和MMP-9的表達(dá)顯著升高。在EL-Kras（G12D）小鼠模型中，PEDF缺乏導(dǎo)致的浸潤(rùn)性胰腺導(dǎo)管腺癌與MMP-2和MMP-9的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)［12］。PEDF抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和侵襲，同時(shí)，PEDF下調(diào)VEGF和MMP-9的表達(dá)，上調(diào)血小板反應(yīng)蛋白的表達(dá)［13］。本研究中半定量RT-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PEDF能顯著抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白FN和MMP-9的表達(dá)水平。

綜上所述，PEDF在肺腺癌A549細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮拮抗效應(yīng)。PEDF可作為內(nèi)源性抗A549細(xì)胞生物活性因子，檢測(cè)其表達(dá)水平可能對(duì)判斷肺腺癌患者的預(yù)后有一定指導(dǎo)意義。但是，本研究只涉及體外細(xì)胞層面，PEDF是否能在體內(nèi)抑制肺腺癌的轉(zhuǎn)移，還有待于下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。本研究組前期研究［14-15］表明PEDF可以顯著地抑制A549細(xì)胞和NCI-H460細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)變化，并誘導(dǎo)其凋亡。因此，PEDF可以發(fā)揮限制肺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的雙重效應(yīng)，使其有望成為治療肺癌的新途徑。

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Effects of PEDF on them igration and invasion of lung adenocarcinoma A549 cells and the expression ofmetastatic-related proteins

Cheng Yu，Shu Jun，Xu Sheng，et al
（Dept of Respiratory Medicine，The Fourth Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230022）

ObjectiveTo observe the effects of pigment epithelium-derived factor（PEDF）on the migration and invasion of human lung adenocarcinoma A549 cell，aswell as the expression ofmetastatic-related proteins including fibronectin（FN）and matrixmetalloproteinase 9（MMP-9）.MethodsA549 cells cultured without PEDF were defined as negative control group，the cells in PEDF intervention group were added 180，360 and 720 nmol/L PEDF，respectively.The effects of PEDF on themigration and invasion of A549 cellwere detected by Transwell assay.The effects of PEDF on the expression of FN and MMP-9 mRNA were detected by semi-quantitative RT-PCR assay，meanwhile the protein of them in supernatant of cell culture and within cellswas detected by ELISA.ResultsThe numbers ofmigrating cells and invasive cells in PEDF intervention group were significantly lower than those in the negative control group（P＜0.05）.With the increase of PEDF concentration，the numbers ofmigrating and invasve cells decreased by degrees（P＜0.05）.The expression of FN and MMP-9 in A549 cellswas significantly lower than that in the control group（P＜0.05）and the expression levelwas remarkably decreased by degreeswith the increase of PEDF concentration（P＜0.05）.ConclusionPEDF can significantly inhibit themigration and invasion of A549 cells in vitro，furthermore，PEDF can significantly inhibit the expression ofmetastasis associated proteins（FN and MMP-9）.

pigment epithelium-derived factor；lung adenocarcinoma；metastasis；migration；invasion

R 734.2；R 73-37

A

1000-1492（2016）03-0345-06

時(shí)間：2016/1/28 14：23：10 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160128.1423.016.html

2015-12-08接收

安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（編號(hào)：1308085MH141）；

安徽醫(yī)科大學(xué)科研基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：2010xkj115）

安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，合肥 230022

程 宇，女，碩士研究生；

束 軍，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：J.Shu @126.com