諾貝爾獎級科學成就究竟是怎樣取得的？
——綠色熒光蛋白的發(fā)現、表達與開發(fā)

周　程

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諾貝爾獎級科學成就究竟是怎樣取得的？
——綠色熒光蛋白的發(fā)現、表達與開發(fā)

周程

摘要：第二次世界大戰(zhàn)結束后不久，大科學開始興起，科學知識按“指數規(guī)律”持續(xù)高速增長，但生物學的發(fā)展卻遇到一個瓶頸：人們無法觀察蛋白質在活體細胞中的運動與變化情況。進入20世紀后期，以綠色熒光蛋白為代表的一系列生物熒光標記材料的發(fā)現與應用，為生物學的大發(fā)展提供了一種全新的工具。此后，科學家們能夠很方便地觀察活細胞的細微結構和生理過程，為深入研究腦細胞的發(fā)育過程以及癌細胞的擴散方式等問題打下了良好的基礎。論文基于已有研究，主要依據研發(fā)參與者撰寫的回憶文章和發(fā)表的論文，對多管水母綠色熒光蛋白分子的發(fā)現、基因的復制與表達、突變體的開發(fā)與應用、類似體的篩選與改進等研究開發(fā)關鍵環(huán)節(jié)進行考察，揭示熒光蛋白標記法的誕生經緯，解釋瑞典皇家科學院將2008年的諾貝爾化學獎授予下村修、馬丁·查爾菲和錢永健的主要原因。

關鍵詞：諾貝爾獎；熒光蛋白；下村修；查爾菲；錢永健

引言

回顧科學史不難發(fā)現：每當有人發(fā)明一種新的技術或方法，使人們的觀察視野大為擴展之時，科學就會向前跨出一大步。望遠鏡的發(fā)明，使伽利略(Galileo Galilei,1564—1642)清楚地看到月球上也有山峰，木星周圍也有衛(wèi)星，于是古希臘的四元素說被徹底顛覆；顯微鏡的發(fā)明，使列文虎克(Antony van Leeuwenhoek,1632—1723)看到水滴中有許多小生物在蠕動，血液中含有成千上萬的紅細胞，于是微生物世界的大門被打開。

第二次世界大戰(zhàn)結束后不久，大科學開始興起，科學知識按“指數規(guī)律”持續(xù)高速增長，但生物學的發(fā)展卻遇到一個瓶頸，那就是，盡管顯微鏡的倍數在不斷增加，人們仍無法觀察蛋白質在活體細胞中的運動與變化情況。蛋白質乃生命活動的主要承擔者，如果無法掌握細胞中蛋白質的動向，人類就無法深入揭示生命活動的奧秘。

20世紀后期，以綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)為代表的一系列生物熒光標記材料的發(fā)現與應用，為生物學的大發(fā)展提供了一種全新的工具。自此之后，科學家們似乎煉成了火眼金睛，能夠很方便地觀察活細胞的細微結構和生理過程，為深入研究腦細胞的發(fā)育過程以及癌細胞的擴散方式等問題打下良好基礎。

GFP無需依賴熒光素酶或其他輔助因子的作用，就可以在生物體內每一個被表達的細胞中“自動”出現。而且，GFP的熒光非常穩(wěn)定,在激發(fā)光照射下，其抗光漂白能力比熒光素強很多。是故，GFP及其變種今日被廣泛地用作分子標記。此外，GFP還被用作砷和一些重金屬的傳感器。正因為如此，瑞典皇家科學院決定將2008年的諾貝爾化學獎授予對GFP的發(fā)現、表達和開發(fā)做出杰出貢獻的三位科學家：下村修(Osamu Shimomura,1928—)、馬丁·查爾菲(Martin Chalfie,1947—)和錢永健(Roger Yonchien Tsien,1952—)。

下村修、查爾菲和錢永健三人榮獲2008年諾貝爾化學獎的消息傳開后不久，國內便涌現出一批介紹他們的研究業(yè)績以及GFP的性質與用途之類的文章。這些文章無疑有助于加深人們對三位科學家學術貢獻以及對GFP的理解。但是，這些文章并沒有深入揭示下村修、查爾菲和錢永健開展GFP研究的背景以及他們的研究與其他學者之間的傳承關系。實際上，從綠色熒光蛋白的發(fā)現到熒光蛋白標記法的發(fā)明應用，過程相當復雜?？梢哉f，如果沒有眾多科學家接力推進，使之成功穿越橫亙在發(fā)現與發(fā)明之間的“亞馬孫叢林”，熒光蛋白標記法就不可能獲得普及。

以下，筆者擬在馬克·季默(Marc Zimmer)*Marc Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology, New York: Prometheus Books, 2005.、宮脅敦史*宮脇敦史：「GFPをめぐる半世紀の歴史」，『科學』2009年第79卷第1期。等人的研究基礎上，主要依據研發(fā)參與者撰寫的回憶文章和發(fā)表的論文，對GFP分子的發(fā)現*筆者曾對下村修發(fā)現綠色熒光蛋白的業(yè)績進行過研究，具體可參見周程《杰出人才是怎樣煉成的？——下村修榮獲諾貝爾化學獎案例研究》(《科學學與科學技術管理》 2012年第4期)。出于本文整體結構上的需要，以下只對下村發(fā)現綠色熒光蛋白的過程作一簡要概述。、基因的復制與表達、突變體的開發(fā)與應用、類似體的篩選與改進等研發(fā)關鍵環(huán)節(jié)作一更為深入的考察，以期能夠較為全面地揭示熒光蛋白標記法的誕生經緯，從而加深人們對諾貝爾獎級科學貢獻的理解。

一、綠色熒光蛋白分子的發(fā)現

GFP革命的種子是由下村修于1962年埋下的。因此，下村修被認為是GFP革命的始祖。但是，下村當時并沒有意識到，自己在從事基礎研究過程中不經意間發(fā)現的GFP后來竟成為科學家們深入揭示生命活動奧秘的一個非常重要的工具。

下村修的中學時代是在戰(zhàn)亂中度過的。戰(zhàn)后初期，他在長崎醫(yī)科大學(長崎大學前身)附屬藥學專科部接受了三年的高等教育，畢業(yè)后留校任分析化學實驗室實驗指導教師。1955年，下村被選派到名古屋大學理學院化學系天然有機化學研究室進修。報到當天，其指導教授就把一個裝滿干燥海螢(Cypridinahilgendorfri)的真空防潮容器拿給他，希望能將發(fā)光海螢體內的熒光素提取出來并獲得結晶，以便為最終確定熒光素的分子結構奠定基礎。由于海螢熒光素遇到氧氣后很快就會分解，這項工作難度極大，以致普林斯頓大學哈維(Newton Harvey,1887—1959)教授帶著學生研究多年仍未取得成功?？墒沁@一難題卻因下村的一項意外發(fā)現而被解決了*下村修：『クラゲの光に魅せられて――ノーベル化學賞の原點』，東京:朝日新聞出版,2009年。。

下村修的工作引起了哈維的弟子——普林斯頓大學生物學系教授約翰遜(Frank Johnson,1908—1990)的注意。在約翰遜的盛情邀請下，剛被名古屋大學破格授予理學博士學位的下村于1960年9月來到普林斯頓，開始從事為期三年的博士后研究*O. Shimomura, Autobiography,[2010-02-12], http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/Shimomura.html.。當時，每到夏季在美國西北海岸的星期五港灣都可看到成群的多管水母(Aequoreavictoria)，但是人們不知道這種無色透明的水母為什么會發(fā)出綠光*下村修：『GFP発見の歴史』，宮脇敦史編，『GFPとバイオイメージング』，東京:羊土社，2000年，第13～16頁。。約翰遜建議二人間的合作研究就從這種水母入手。由于提取純化多管水母體內的發(fā)光物質看似與自己先前的研究跨度不大，下村欣然接受了這一提議。

1961年夏，下村修如約跟隨約翰遜來到華盛頓大學的星期五港灣研究所。令下村沒有料到的是，多管水母的發(fā)光機理好像和海螢的完全不同，無論他和約翰遜采用哪一種降低熒光素酶活性的方法或去氧措施，都無法讓多管水母發(fā)光物質提取液停止發(fā)光。在無法說服約翰遜放棄原定研究方案的情況下，下村不得不獨自行動。經過數周的苦苦探索后，下村突然意識到：多管水母體內的發(fā)光物質很有可能是蛋白質，若確實如此，則可通過改變提取液的pH值來降低蛋白質的活性，進而遏制發(fā)光物質發(fā)光。之后的實驗證明下村的判斷是正確的。富有戲劇性的是，當下村做完實驗把含有多管水母發(fā)光物質的溶液倒進污水池時，污水池里突然躥出一道藍光。當時，正巧有人往污水池里排放海水。于是下村推定，引起發(fā)光的主因極有可能是海水中的鈣離子。這意味著可以通過降低提取液中的鈣離子濃度來阻止發(fā)光物質發(fā)光。實際上，有效遏制多管水母發(fā)光物質發(fā)光的難題后來就這么簡單地解決了*下村修：「イクオリンとGFPの発見」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。

1961年9月，在星期五港灣辛苦工作了三個多月的約翰遜和下村等人帶著冷凍多管水母發(fā)光物質提取液回到普林斯頓。第二年春，他們提取到5毫克高純度多管水母發(fā)光物質，對其進行分析后發(fā)現，該發(fā)光物質確實是一種蛋白質，加微量鈣離子后會發(fā)藍光，而且在真空狀態(tài)下也能發(fā)光。下村等人將這種特殊蛋白質命名為“aequorin”，即水母素*下村修：「イクオリンとGFPの発見」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。在純化水母素過程中，下村等人還發(fā)現一個副產品——一種含量很低、在自然光的照射下發(fā)淺綠色熒光的新型蛋白質。在該年投給《細胞和比較生理學學報》的論文腳注中，下村等人首次公開了這項發(fā)現。當時，他們將這種新型蛋白質稱為“綠色蛋白質”*F. H. Johnson, O. Shimomura, Y. Saiga, L. C. Gershman, G. T. Reynolds, J. R. Waters, Quantum Efficiency of Cypridina Luminescence, with a Note on that of Aequorea, Journal of Cellular and Comparative Physiology, vol. 60, no. 1(1962), pp. 85-103.。

盡管下村和約翰遜等人在1962年就發(fā)現了多管水母“綠色蛋白質”，但是他們當時還顧不上對這種物質的生化性質展開深入研究，再說他們當初積攢的“綠色蛋白質”數量有限，根本滿足不了實驗最低需求。當時，下村和約翰遜最為關心的是，既然水母素對鈣離子非常敏感，那么可否利用它的這一特性來測定血清和牛奶中的鈣離子含量？1963年初，他們把自己在這方面所做的研究整理成文，美國的《科學》雜志同年6月就刊發(fā)了該文*O. Shimomura, F. H. Johnson, Y. Saiga, Microdetermination of Calcium by Aequorin Luminescence, Science,vol. 140(1963),pp. 1339-1340.。

1963年，35歲的下村修回到日本，就任名古屋大學水質科學研究所副教授。因其對生物發(fā)光研究情有獨鐘，在魚和熊掌不可兼得的情況下，他于1965年底辭去待遇優(yōu)厚的日本國立大學的教職，帶著夫人和一歲的兒子返回普林斯頓，在約翰遜研究室當起了依靠申請研究經費過活的博士后研究員*下村修：「発光生物研究40年」，『長薬同窓會會報』1995年第35期。。20世紀60年代后期，下村急于探明的主要是水母素的化學結構與發(fā)光機理*O. Shimomura， The Discovery of Aequorin and Green Fluorescent Protein, Journal of Microscopy, vol. 217,no. 1(2005), pp. 3-15.。為獲得足量的水母素，他每年夏天都要帶上家人到星期五港灣去大量捕撈多管水母。雖然非常辛苦，但他樂此不疲*下村修：「イクオリンとGFPの発見」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。在大量提取水母素的過程中，他也積攢了不少多管水母“綠色蛋白質”，不過他當時并未對其展開實質性的研究。

1969年，哈佛大學的伍迪·哈斯廷(Woody Hasting,1927—) 和詹姆斯·莫林(James Morin,1953—)在研究腔腸動物發(fā)光蛋白質特性時再次“發(fā)現”了多管水母“綠色蛋白質”，并將其命名為“Green Fluorescent Protein”，即綠色熒光蛋白*J. W. Hasting, J. G.Morin, Comparative Biochemistry of Calcium-activated Photoproteins from the Ctenophore, Mnemiopsis, and the Coelenterates Aequorea, Obelia, Pelagia and Renilla, Biological Bulletin, vol. 137(1969), p. 402.。二人在研究過程中還注意到，水母素遇到鈣離子后發(fā)出來的光是藍色的，而多管水母受到刺激后發(fā)出的卻是綠光。此后，水母素發(fā)出的藍光是怎樣轉變成綠色的，GFP在中間發(fā)揮了什么樣的作用之類的問題便一直縈繞在他們的腦海里。1971年，他們提出了熒光共振能量轉移理論(FRET)，對這類現象進行了解釋*J. G. Morin, J. W. Hasting, Energy Transfer in a Bioluminescent System, Journal of Cellular Physiology, vol. 77, no. 3(1971), pp. 313-318.。依據該理論，水母素生產的藍光先以無輻射的方式傳遞給GFP，GFP受到藍光激發(fā)后再以發(fā)綠光的方式將能量釋放出來。產生熒光共振能量轉移必須滿足兩個條件：(1)供體的發(fā)射波長和受體的吸收波長重疊；(2)供體和受體的距離小于3納米。1974年，下村等人使用自己提純的水母素和多管水母GFP首次驗證了這一理論*H. Morise, O. Shimomura, F. H. Johnson, J. Winant, Intermolecular Energy Transfer in the Bioluminescent System of Aequorea, Biochemistry, vol. 13, no. 12(1974), pp. 2656-2662.。

由于水母素分子的發(fā)光機理已于1973年被解明*O. Shimomura, F. H. Johnson, Chemical Nature of Light Emitter in Bioluminescence of Aequorin, Tetrahedron Letters, vol. 14, no. 31(1973), pp. 2963-2966.，這樣多管水母的發(fā)光機理問題于1974年被解決之后，弄清GFP分子的發(fā)光機理便成為當務之急。遺憾的是，下村等人多年積攢起來的多管水母GFP被約翰遜帶去參加學術會議時丟失了*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。而當時的生物技術還不甚發(fā)達，做一次GFP結構分析實驗需要上百毫克的GFP。所以，此后數年下村不得不仍舊帶著家人去星期五港灣大量捕撈多管水母。由于多管水母中的GFP含量遠低于水母素，故直到1979年下村才攢足100毫克GFP*下村修：「イクオリンとGFPの発見」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。是年，下村他們把手中的多管水母GFP全部酶解成肽段，然后逐一檢查這些肽段的光反應情況。結果發(fā)現，這些肽段均不發(fā)光，像GFP一樣吸收光的也只有一段*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。對純化后只有0.1毫克的這片肽段展開深入研究后，下村驚奇地發(fā)現其吸收光譜峰值和自己20年前在名古屋大學研究海螢熒光素時合成的化合物的吸收光譜峰值非常接近*O. Shimomura, Discovery of Green Fluorescent Protein, GFP, Nobel Lecture, 2008-12-08, [2010-02-12]， http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2008/Shimomura-lecture.html.。于是他很快就推測出多管水母GFP發(fā)光基團的化學結構，并在《歐洲生物化學學會聯盟通訊》上公開了這一研究成果*O. Shimomura, Structure of the Chromophore of Aequorea Green Fluorescent Protein, FEBS Letters, vol. 104, no. 2(1979), pp. 220-222.。

1979年用聯想類比法推出多管水母GFP發(fā)光基團結構后不久，下村獲知剛從佐治亞大學轉到羅格斯大學任教的威廉·瓦德(William Ward)也在星期五港灣大量捕撈多管水母，并已重點展開對GFP的研究。經過一番考量，對基因工程興趣不是很濃的下村決定專注于當時被認為有著廣泛應用前景的水母素的研究，不再參與GFP的研究開發(fā)競爭*下村修：「イクオリンとGFPの発見」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。

二、綠色熒光蛋白基因的分離與復制

1981年，下村修轉到位于馬薩諸塞州伍茲霍爾(Woods Hole)的海洋生物學實驗室就任資深科學家，同時兼任波士頓大學藥學院教授。六年后，在佐治亞大學跟隨密爾頓·考彌爾(Milton J. Cormier,1948—)教授進行多年水母素克隆研究的道格拉斯·普拉舍(Douglas Prasher,1951—)也來到海洋生物學實驗室。在這里，普拉舍成功地從多管水母的DNA中分離出GFP基因，并對其進行復制與測序，為GFP在異源生物體中的表達奠定了重要的基礎。

普拉舍1979年在俄亥俄大學取得生物化學博士學位后，到佐治亞大學跟隨細菌遺傳學家悉尼·庫斯納(Sidney Kushner)教授做了一期博士后研究。在此期間，普拉舍結識了該校的生物化學系創(chuàng)始人考彌爾*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。考彌爾1958年調入佐治亞大學后，便開始迷上一種大量生活在佐治亞的淺水海灣里、受刺激后能發(fā)出綠光的群體無脊椎動物——海腎(Renillareniformis)。在考彌爾的指導下，1977年，一名研究生成功地分離出海腎熒光素酶；緊隨其后，一名博士后又提取到海腎GFP*M. J. Cormier, Nobel Prize Spotlights Basic Research, UGA Research Magazine, spring 2009, [2011-07-18], http://researchmagazine.uga.edu/aa/spring2009/spotlight.php.。1979年，考彌爾和其指導的博士后瓦德聯名發(fā)表的有關海腎GFP特性的那篇著名論文就是在此研究基礎上形成的*W. W. Ward, M. J. Cormier, An Energy Transfer Protein in Coelenterate Bioluminescence, Characterization of the Renilla Green-fluorescent protein, The Journal of Biological Chemistry, vol. 254, no. 3(1979), pp.781-788.。當時的研究表明，海腎與多管水母的發(fā)光機理非常相似，但也存在不少差別。為加深對動物發(fā)光現象的理解，考彌爾決定做一些有關海腎與多管水母發(fā)光機理的比較研究。是故，進入20世紀80年代后，考彌爾把多管水母也列作自己的重點研究對象。由于對生物發(fā)光研究產生了濃厚興趣，故完成一期博士后研究后，普拉舍就轉至考彌爾門下，開始從事水母素的克隆研究*M. J. Cormier, Nobel Prize Spotlights Basic Research, UGA Research Magazine, spring 2009, [2011-07-18], http://researchmagazine.uga.edu/aa/spring2009/spotlight.php.。

如眾所知，20世紀70年代初，重組DNA研究在美國取得重大突破。之后，基因技術獲得快速發(fā)展，以致進入20世紀80年代后發(fā)達國家的不少實驗室陸續(xù)掌握了使用微生物大量表達外源蛋白質這項前沿技術?？紡洜枌嶒炇沂瞧渲械囊幻?。在考彌爾的指導下，普拉舍和實驗室技術員麥坎(Richard O. McCann)合作，于20世紀80年代初就確定了水母素基因在多管水母DNA中的位置。此后，他們再接再厲，又成功地實現了脫輔基水母素(apoaequorin)基因在大腸桿菌中的表達。脫輔基水母素在有氧環(huán)境下用腔腸素(coelenterazine)進行處理后可轉化為能夠發(fā)光的水母素，這意味著此后科學家們無需再去美國西北海岸捕撈多管水母就可以大量制取水母素*下村修：「イクオリンとGFPの発見」，『バイオサイエンス最前線』1998年第22期。。1985年2月，普拉舍等人公開發(fā)表了這一研究成果*D. Prasher, R. O. McCann, M. J. Cormier, Cloning and Expression of the cDNA Coding for Aequorin, a Bioluminescent Calcium-binding Protein, Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 126, no. 3(1985), pp.1259-1268.。遵照考彌爾的建議，普拉舍隨后又啟動了多管水母GFP基因的分離與復制研究*M. J. Cormier, Nobel Prize Spotlights Basic Research, UGA Research Magazine, spring 2009, [2016-06-16], http://researchmagazine.uga.edu/aa/spring2009/spotlight.php.。因瓦德等人此前已對多管水母GFP的組成結構與生化特性展開了一系列探索，故普拉舍以此為基礎很快獲得一個多管水母GFP基因片段的拷貝*M. J. Cormier, Nobel Prize Spotlights Basic Research, UGA Research Magazine, spring 2009, [2016-06-16], http://researchmagazine.uga.edu/aa/spring2009/spotlight.php; D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward, F. G. Prendergast, M. J. Cormier, Primary Structure of the Aequorea Victoria Green-fluorescent Protein, Gene, vol. 111, no. 2(1992), pp. 229-233.。后因普拉舍轉赴伍茲霍爾就任新職，故此項研究被暫時擱置。

1988年，也即在獲聘擔任海洋生物學實驗室助理研究員的第二年，普拉舍獲得美國癌癥協(xié)會提供的為期三年、金額超過20萬美元的研究資助，于是他按照資助協(xié)議在伍茲霍爾重新啟動GFP基因的分離與復制研究。毋庸贅言，此項研究是同考彌爾等人合作進行的。盡管此前已獲得一個多管水母GFP基因片段的拷貝，但它只含有168個氨基酸，而多管水母的GFP是由238個氨基酸組成的，這意味著分離出來的GFP基因片段少了30%的密碼子。為獲取完整的GFP基因，普拉舍再次遠赴星期五港灣捕撈了一批多管水母，并用液氮對其進行速凍處理。返回伍茲霍爾后，普拉舍將從多管水母中提取的DNA酶切成140萬個片段。普拉舍原以為這些DNA片段中含有GFP基因的怎么也有成百上千個，可是逐個檢測后發(fā)現，只有一個片段含有GFP基因。幸運的是，費盡千辛萬苦分離出來的GFP基因是一個完整的GFP基因*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。之后，普拉舍使用細菌的質粒作載體對GFP基因進行大量復制，并確定了多管水母GFP的基因序列。1991年3月，他把這項研究成果整理成文，投給《基因》雜志。次年2月《基因》正式刊發(fā)了這篇論文*D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward, F. G. Prendergast, M. J. Cormier, Primary Structure of the Aequorea Victoria Green-fluorescent Protein, Gene, vol. 111, no. 2(1992), pp. 229-233.。不過，普拉舍并沒有實現GFP基因在異源生物體中的表達。

實際上，早在1987年，普拉舍就產生用多管水母GFP做示蹤分子來研究細胞內蛋白質活動情況的想法*M. Zimmer, Douglas Prasher, [2011-07-18], http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/prasher.html.。這主要是因為：(1)細胞中的蛋白質太小，用最先進的電子顯微鏡也無法觀察。如果能把多管水母GFP和目的蛋白質連在一起，無異于在目的蛋白質上裝了一個燈泡，人們可以通過觀察GFP的熒光來了解目的蛋白質的活動情況。(2)下村修多年前就已揭示多管水母GFP是一種非常小的蛋白質，將小蛋白質連接到比較大的目的蛋白質上一般不會對目的蛋白質的功能產生影響。不過，普拉舍以為，多管水母GFP發(fā)光基團的形成有可能需要體內輔助因子或外源反應底物提供幫助*D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward, F. G. Prendergast, M. J. Cormier, Primary Structure of the Aequorea Victoria Green-fluorescent Protein, Gene, vol. 111, no. 2(1992), pp. 229-233; M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。因為當時的研究表明，即使是在有氧環(huán)境下，從生物體中提取的發(fā)光物質，如水母素、熒光素等都不可能單獨發(fā)光。這意味著除非多管水母GFP是一個例外，否則人們很難實現其在異源生物細胞中的表達，也即不太可能在其他生物體中觀察到多管水母GFP發(fā)出的熒光。

由于對GFP基因在其他生物體中的表達缺乏信心，故普拉舍在美國癌癥協(xié)會資助的科研經費告罄前都沒有將其用GFP做示蹤分子的想法完全付諸實施。當他下決心啟動GFP基因表達研究，并向美國國立衛(wèi)生研究院等機構申請有關資助時，卻遭到拒絕，以致他不無遺憾地將揭開GFP革命序幕的機會拱手讓給了別人*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。不過，用細菌的質粒大量復制GFP基因技術的掌握，使普拉舍等人得以更方便地對GFP發(fā)光基團的結構展開深入研究，以致1991年普拉舍和瓦德等人用實驗驗證了下村修1979年提出的有關GFP發(fā)光基團化學結構的主要推測，同時提出不少有關GFP發(fā)光基團分子結構與發(fā)光機理的新見解。這些研究成果于1993年公開發(fā)表在《生物化學》雜志上*C. W. Cody, D. C. Prasher, W. M. Westler, F. G. Prendergast, W. W. Ward, Chemical Structure of the Hexapeptide Chromophore of the Aequorea Green-fluorescent Protein, Biochemistry, vol. 32, no. 5(1993), pp. 1212-1218.。

申請多管水母GFP基因表達研究資助遭拒后，普拉舍接受美國海軍研究辦公室的資助，開始開發(fā)與水銀之類的重金屬相遇后旋即發(fā)光的水母素變種*M. Zimmer， Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。此后，普拉舍因未能通過海洋生物學實驗室的終身職位評審而不得不先后轉至美國農業(yè)部所屬的奧的斯植物保護中心、植物遺傳資源與生物技術實驗室，美國宇航局旗下的AZ技術公司等機構從事與GFP無甚關聯的研究*Wikipedia, Douglas Prasher, [2011-07-18], http://en.wikipedia.org/wiki/Douglas_Prasher; M. Herper, Biotech’s Glowing Breakthrough Wins Nobel Prize, Forbes, 2008-10-08,[2011-07-18], http://www.forbes.com/2008/10/08/nobel-chalfie-shimomura-tsien-biz-healthcare-cx_mh_1008gfp.html.。不斷拋棄先前的研究積累，展開全新的研究，要做出一番業(yè)績談何容易！加上時運不佳，以致普拉舍后來落魄時不得不跑到豐田汽車專賣店當起了班車駕駛員*A. Gouveia, Shuttle Driver Reflects on Nobel Snub, Cape Cod Times， 2008-10-11, [2011-07-18], http://www.capecodonline.com/apps/pbcs.dll/article?AID=/20081011/NEWS/810110328.。

三、綠色熒光蛋白基因的表達

普拉舍放棄開展多管水母GFP基因在異源生物細胞中的表達研究時，應哥倫比亞大學從事線蟲觸覺神經研究的馬丁·查爾菲教授的請求，將含有多管水母GFP基因的質粒提供給了查爾菲。此后，查爾菲和他的研究生合作，成功實現多管水母GFP基因在大腸桿菌和線蟲中的表達，從而揭開GFP革命的序幕。

查爾菲于1977年在哈佛大學獲生理學博士學位后，決定接受學友羅伯特·霍維茨(H. Robert Horvitz,1947—)的建議，赴英國劍橋大學跟隨悉尼·布倫納(Sydney Brenner,1927—)教授從事博士后研究*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。布倫納于20世紀60年代初期和DNA雙螺旋結構發(fā)現者之一克里克(Francis Crick, 1916—2004)合作解釋了蛋白質翻譯的三元碼問題之后，開始另辟蹊徑專注于秀麗隱桿線蟲研究。他用這種身長僅一兩個毫米的透明線蟲作模式生物，和其學生合作開展一系列發(fā)育生物學研究。因在揭示器官發(fā)育和細胞程序化凋亡的遺傳調控機理方面做出創(chuàng)造性的貢獻，他和兩名學生——霍維茨、蘇爾斯頓(John E.Sulston, 1942—)一起被授予2002年度諾貝爾生理學或醫(yī)學獎*饒毅：《三位有趣的生物學家：2002年諾貝爾獎獲得者》，[2011-07-18]， http://www.bioon.com/VIP/successway/sciroad/200310/1870.html。。在跟隨布倫納研究線蟲期間，查爾菲對這種體細胞總數不到1000，壽命不超過4天，但在生理上與人體有著眾多相似之處的線蟲產生了濃厚的興趣，以致1982年到哥倫比亞大學就任教職后一直把線蟲作為主要研究對象。

20世紀80年代中期，查爾菲在研究線蟲細胞中的基因和基因啟動子的作用機理時，只能使用具有糖解作用的β-半乳糖苷酶基因作標記，即將其連接在目的基因或基因啟動子后面。采用這種方法存在一個問題，那就是最終必須把線蟲殺死，否則無法深入了解線蟲細胞內的基因或基因啟動子的活動情況*生化學若い研究者の會：『光るクラゲがノーベル賞をとった理由』，東京：日本評論社，2009年。。1988年初，在哥倫比亞大學舉辦的一個以發(fā)光生物為主題的討論班上，查爾菲獲悉人們已從多管水母身上提取到一種叫做GFP的熒光物質。他當即意識到可以嘗試使用這種熒光物質的基因作報告基因，以解決自己在研究線蟲細胞過程中遇到的諸多難題。經過數日的調查，查爾菲了解到普拉舍正在從事多管水母GFP基因的分離與復制研究。于是他與普拉舍取得聯系，并提出希望合作開展多管水母GFP基因在線蟲中的表達研究*宮脇敦史：「2008年ノーベル化學賞――GFPの発見,発現,開発の歴史」，『パリテイ』2008年第23卷第12期。。當時，普拉舍只解讀完一個不完整的多管水母GFP基因的堿基對，故談不上和查爾菲開展相關合作研究。1992年初，普拉舍解讀完多管水母GFP基因的全部堿基對后打電話通知查爾菲時，不巧查爾菲正在猶他大學度婚假，因此雙方沒能聯系上。普拉舍當時誤以為查爾菲已經離職*M. Herper, Biotech’s Glowing Breakthrough Wins Nobel Prize, Forbes, 2008-10-08, [2011-07-18], http://www.forbes.com/2008/10/08/nobel-chalfie-shimomura-tsien-biz-healthcare-cx_mh_1008gfp.html.。

1992年9月，一直沒有收到普拉舍分離多管水母GFP基因取得成功消息的查爾菲與研究生奧伊斯基興(Ghia Euskirchen)討論制定了一份有關使用GFP基因研究透明線蟲的計劃。他們在進行文獻檢索時發(fā)現，普拉舍和考彌爾等半年前在《基因》雜志上合作發(fā)表了一篇有關多管水母GFP一級結構的論文*宮脇敦史:「GFPをめぐる半世紀の歴史」，『科學』2009年第79卷第1期。。在這篇文章中，普拉舍等人報告了他們從事多管水母GFP基因分離、復制與測序研究所取得的進展，不過在文章的末尾，他們把自己復制出的GFP稱作脫輔基GFP*D. C. Prasher, V. K. Eckenrode, W. W. Ward, F. G. Prendergast, M. J. Cormier, Primary Structure of the Aequorea Victoria Green-fluorescent Protein, Gene, vol. 111, no. 2(1992), pp. 229-233.。言下之意是這種蛋白質不含發(fā)光基團，尚不能發(fā)光。盡管如此，查爾菲還是滿懷希望地聯系上普拉舍，并獲得普拉舍提供的含有多管水母GFP基因的質粒*M. Herper, Biotech’s Glowing Breakthrough Wins Nobel Prize, Forbes, 2008-10-08, [2011-07-18], http://www.forbes.com/2008/10/08/nobel-chalfie-shimomura-tsien-biz-healthcare-cx_mh_1008gfp.html.。

收到含有多管水母GFP基因的質粒之后，查爾菲便指示奧伊斯基興使用剛剛興起的聚合酶鏈式反應(PCR)技術擴增GFP基因，然后再用大腸桿菌做GFP基因表達實驗。在查爾菲看來，無論這項實驗成功與否，它對研究生來講都是一次很好的鍛煉。經過一個月的努力，奧伊斯基興終于在顯微鏡中觀察到大腸桿菌體內發(fā)出的綠光*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。這意味著多管水母GFP無需任何輔助因子和反應底物，就可以自行形成發(fā)光基團。這項研究使查爾菲深受鼓舞。

查爾菲此前從未接觸過多管水母GFP基因，而且其實驗室里并未配備與熒光蛋白研究有關的專用儀器設備。在這種情況下，向美國國家科學基金會等機構申請GFP基因表達研究資助很難通過同行評審，即使僥幸通過，那也是半年后的事。深諳科技界競爭規(guī)則的查爾菲沒有緣木求魚，他果斷地決定先用自主經費啟動多管水母GFP基因在更為復雜的生物體——線蟲中的表達研究*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。當克服重重困難把多管水母GFP基因插入線蟲目的基因及其啟動子之間后，他們在線蟲的神經細胞內觀察到多管水母GFP發(fā)出的熒光，并確認多管水母GFP對線蟲神經細胞無毒副作用。1994年2月，美國《科學》雜志刊發(fā)了這一里程碑性的研究成果，并在封面上刊登了查爾菲提供的帶有多個綠色熒光點的線蟲配圖*M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen, W. W. Ward, D. C. Prasher, Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression, Science, vol. 263, no. 5148(1994), pp. 802-805.。

其實，當時不只是查爾菲團隊在從事多管水母GFP基因的表達研究。不過，其他團隊大都未能在異源生物體上觀察到GFP發(fā)出的熒光。很多從事生物發(fā)光研究的學者研究受挫后都以為GFP和此前發(fā)現的所有發(fā)光物質一樣需要特定的輔助因子或反應底物參與作用才能發(fā)光，因此都沒有去深究GFP基因未能在異源生物體中獲得表達是否是因剪切GFP基因時出了問題*宮脇敦史：「2008年ノーベル化學賞――GFPの発見,発現,開発の歴史」，『パリテイ』2008年第23卷第12期。。換言之，從事生物發(fā)光研究的學者主要是從化學方面，而非從生物方面尋找敗因。查爾菲是從事發(fā)育生物學研究的，他對生物發(fā)光研究界流行的生物體內的發(fā)光物質獨自不能發(fā)光的觀點認識有限，因此他果敢地向被生物發(fā)光研究學者認為不可能的事發(fā)起了挑戰(zhàn)*W. W. Ward, Fluorescent Proteins: Who’s Got’Em and Why? Bioluminescence and Chemiluminescence: Progress & Current Applications, eds. by P. E. Stanley, L. J. Kricka, Singapore: World Scientific, 2002, pp. 123-126.。查爾菲團隊研究后發(fā)現，很多團隊之所以在異源生物體中觀察不到多管水母GFP發(fā)出的熒光，主要是因為他們基于普拉舍的研究，用限制性剪切酶剪切GFP基因時未將多余的堿基切除，以致多管水母GFP基因未能在細胞中獲得表達*M. Chalfie, Y. Tu, G. Euskirchen, W. W. Ward, D. C. Prasher, Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression, Science, vol. 263, no. 5148(1994), pp. 802-805.。

不過，1994年3月，《歐洲生物學化學會聯盟通訊》刊發(fā)了一篇與多管水母GFP基因表達有關的論文，它是由當時正在加州大學圣地亞哥分校斯克里普斯海洋學研究所訪問研究的日本窒素肥料株式會社的井上敏(Satoshi Inouye)與該所的研究員、日裔學者辻(Frederick I. Tsuji)合作完成的*S. Inouye, F. I. Tsuji, Aequorea Green Fluorescent Protein: Expression of the Gene and Fluorescence Characteristics of the Recombinant Protein, FEBS letters, vol. 341, no. 2-3(1994), pp. 277-280.。這是第二個在異源生物細胞中表達多管水母GFP基因取得成功的團隊。1984年，他們倆還與日本九州大學的幾位學者一起獨立地克隆出水母素基因，但論文的發(fā)表日期比普拉舍和考彌爾的相關論文也晚了一個月*S. Inouye, M. Noguchi, Y. Sakaki, Y. Takagi, T. Miyata, S. Iwanaga, T. Miyata, F. I. Tsuji, Cloning and Sequence Analysis of cDNA for the Luminescent Protein Aequorin, PNAS, vol. 82, no. 10(1985), pp. 3154-3158.。

盡管美國《科學》雜志1994年2月刊發(fā)的查爾菲等人的論文正文不足兩頁，但它標志著科學家們已打開了用GFP對活細胞進行示蹤研究的大門。十年后，查爾菲也因此而榮幸地當選美國國家科學院院士。

四、綠色熒光蛋白突變體的開發(fā)

普拉舍退出GFP克隆研究前，還將其獲得的含有多管水母GFP基因的質粒無償地提供給加州大學圣地亞哥分校的錢永健。此后，錢永健對多管水母GFP的結構與功能展開了一系列卓有成效的研究，并進而開發(fā)出一批發(fā)光效率更高、性能更加穩(wěn)定、顏色更為豐富的新型熒光蛋白，為科學家們提供了一個將不同的蛋白質或細胞“染上”不同的顏色，借以跟蹤研究其活動過程的工具箱。

出生于美國紐約的錢永健乃錢學森的堂侄。錢永健在哈佛大學獲得化學與物理學專業(yè)的學士學位后，轉赴英國劍橋大學留學。在劍橋大學，他一開始迷上分子生物學，后來轉向海洋學，最后又轉向生理學，并于1977年獲博士學位。之后，他留在英國從事一段時間的博士后研究。1981年，錢永健返回美國就任加州大學伯克利分校教職，1989年轉任加州大學圣地亞哥分校藥理學教授以及化學與生物化學教授。

早在劍橋大學從事博士后研究期間，錢永健就發(fā)明一種可檢測細胞內鈣離子濃度的染料。當時，測量細胞內鈣離子濃度的方法還相當原始，即便使用下村修發(fā)現的水母素，也需要將其注射到細胞內，這樣很容易對研究用細胞造成傷害。為此，錢永健發(fā)明了一種有機染料，這種染料分子無需注射即可穿透細胞壁。1981年獲得加州大學伯克利分校的教職后，錢永健又對自己發(fā)明的鈣染料進行改進，使其使用更方便，適用性更廣*郭曉強：《生命內部世界變得五顏六色——綠色熒光蛋白質改進者錢永健簡介》，《化學教育》2009年第4期。。

1989年轉到圣地亞哥分校后，錢永健的關注點由細胞內的鈣離子轉向細胞內的環(huán)腺苷酸(cAMP)。環(huán)腺苷酸被稱作細胞內的第二信使，它通過激活蛋白激酶來實現對細胞功能的調節(jié)。根據這一性質，錢永健團隊開發(fā)了一種熒光染料*S. R. Adams, A. T. Harootunian, Y. J. Buechler, S. S. Taylor, R. Y. Tsien, Fluorescence Ratio Imaging of Cyclic AMP in Single Cells, Nature, vol. 349, no. 6311(1991), pp. 694-697.。將蛋白激酶染上這種熒光染料后，再將其注入細胞內，這樣人們便可以通過觀察蛋白激酶被激活的程度來了解環(huán)腺苷酸的活動情況。顯然，使用這種方法甚為不便。因此，1992年4至5月間錢永健看到普拉舍和瓦德等人在《基因》雜志上發(fā)表的那篇文章后，頓覺眼前一亮，他仿佛看到了用多管水母GFP取代化學熒光染料開展熒光標記研究的曙光*李名揚：《為生命上色：諾貝爾化學獎得主──錢永健》，《科學人》2010年第3期。。

錢永健聯系上普拉舍后，得到可以免費獲取多管水母GFP基因的答復。與長期從事線蟲觸覺神經研究的查爾菲不同，主要從事化學熒光染料開發(fā)的錢永健并不擅長基因重組操作，而且其團隊中當時并無這方面的專才，因此其團隊并沒有馬上開展GFP表達研究，以致率先實現多管水母GFP基因在異源生物細胞中的表達之功被查爾菲團隊搶走。1992年9月，一位受過分子遺傳學訓練，名叫海姆(Roger Heim)的瑞士籍博士后研究人員加盟錢永健實驗室。以此為契機，錢永健啟動了對GFP的研究*李名揚：《為生命上色：諾貝爾化學獎得主──錢永健》，《科學人》2010年第3期。。其團隊在研究過程中發(fā)現，多管水母GFP在有氧情況下才會發(fā)光，于是他們推斷，氧分子是其發(fā)光的唯一輔助物。由于氧氣無處不在，故他們進一步推斷多管水母GFP基因可以在任何有機生物的細胞中獲得表達。

因野生型多管水母GFP有兩個激發(fā)峰，光穩(wěn)定性不好，而且熒光強度弱，需要紫外線照射的時間長，故錢永健決定優(yōu)先從解決野生型多管水母GFP的諸多不足處入手，以促進GFP標記技術的應用與普及。這樣，對多管水母GFP結構進行解析與改造自然而然成為錢永健團隊的研究重點。當錢永健團隊正在為如何下手才能快速有效地改良多管水母GFP發(fā)光性質而苦惱時，傳來了凱利·穆利斯(Kary Mullis 1944—)因發(fā)明PCR技術、邁克爾·史密斯(Michael Smith 1932—2000)因發(fā)明對DNA特定位置實行定點突變的方法而獲1993年諾貝爾化學獎的消息。穆利斯雖然在1984年就完成PCR技術的發(fā)明，但這項技術直到其同事于1988年從溫泉中分離出一株嗜熱桿菌之后才獲得推廣應用。PCR技術的推廣應用又為史密斯于1978年初次提出、1985年進一步完善的基因定點突變方法的普及奠定了基礎*隋廣超、張庭芳：《基因工程技術的重大突破──1993年諾貝爾化學獎》，《大學化學》1994年第9卷第3期。。不難看出，1993年諾貝爾化學獎實際上獎勵的是剛剛興起的兩項分子生物學技術。受這兩項新興技術的影響，錢永健團隊決定采用隨機誘變的方式來改組GFP基因，進而篩選出激發(fā)峰和熒光強度等都得到優(yōu)化的GFP衍生物。

錢永健團隊先后制作6000種突變點不盡相同的多管水母GFP基因模型，并從其表達物中發(fā)現若干激發(fā)峰由紫外區(qū)移至藍光區(qū)、綠色熒光強度明顯增大的多管水母GFP變種，以及一種發(fā)藍色熒光和一種發(fā)青色熒光的多管水母GFP突變體。進一步的研究表明，藍色熒光蛋白是因多管水母GFP中的第66位氨基酸——酪氨酸被轉換成組氨酸造成的；如果第66位的酪氨酸被色氨酸取代后則發(fā)青色的熒光。1994年12月，錢永健團隊公開發(fā)表了這些研究成果*R. Heim, D. C. Prasher, R. Y. Tsien, Wavelength Mutations and Post-translational Autooxidation of Green Fluorescent Protein, PNAS, vol. 91, no. 26(1994), pp. 12501-12504.。翌年2月，該團隊又在英國的《自然》雜志上發(fā)文重點介紹一種單點突變后形成的增強型GFP——S65T。這種熒光蛋白與野生型多管水母GFP相比，光穩(wěn)定性和熒光強度獲得大幅度的改善，激發(fā)峰的波長也提高到更方便使用的488納米*R. Heim, A. B. Cubitt, R. Y. Tsien, Improved Green Fluorescence, Nature, vol. 373, no. 6516(1995), pp. 663-664.。

多管水母GFP的發(fā)光性質是由其結構決定的。盡管普拉舍等人已經測出組成多管水母GFP的238個氨基酸的排序，并且闡明其發(fā)光基團的一級化學結構，但是人們對多管水母GFP的晶體結構，也即三維結構仍知之不詳。這顯然不利于使用定點突變的方法改進GFP的發(fā)光性能。為此，錢永健和俄勒岡州立大學的詹姆斯·雷明頓(S. James Remington)等人合作，使用X射線晶體衍射分析法于1996年解析出多管水母GFP的S65T突變體的晶體結構*M. Orm?, A. Cubitt, K. Kallio, L. Gross, R. Tsien, S. Remington, Crystal Structure of the Aequorea Victoria Green Fluorescent Protein, Science, vol. 273, no. 5280(1996), pp. 1392-1395.。同年，萊斯大學的喬治·飛利浦(George Phillips)團隊也使用相同方法，獨立解析出野生型多管水母GFP的晶體結構*F. Yang, L. C. Moss, G. N. Jr. Phillips, The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein, Nature Biotechnology, vol. 14, no. 10(1996), pp. 1246-1251.。結果表明，多管水母GFP是一個由11條β-折疊繞成的圓筒狀結構，一條α螺旋的肽鏈沿圓筒中軸線分布。由第65至67位的三個氨基酸(絲氨酸-酪氨酸-甘氨酸)組成的發(fā)光基團嵌在α螺旋上，幾乎被包埋在圓筒的中心。

弄清多管水母GFP的三維結構后，人們便不難理解為何將第66位的氨基酸——酪氨酸轉換成組氨酸或色氨酸后，所獲得的突變體便會發(fā)出藍色或青色的熒光，因為GFP發(fā)光基團的分子結構已經被改變了。那么，使用定點突變的方法改變多管水母GFP發(fā)光基團周圍的氨基酸結構，是否能制造出科研所需的新的GFP衍生物？順著這條思路，錢永健團隊利用與雷明頓合作所取得的有關多管水母GFP晶體結構數據，通過使用計算機輔助設計，最終獲得一種新的GFP衍生物——黃色熒光蛋白。黃色熒光蛋白是錢永健團隊采用定點突變方法將位于多管水母GFP發(fā)光基團正下方的第203位氨基酸——蘇氨酸換成酪氨酸制成的*F. Yang, L. C. Moss, G. N. Jr. Phillips, The Molecular Structure of Green Fluorescent Protein, Nature Biotechnology, vol. 14, no. 10(1996), pp. 1246-1251.。

藍色、青色、黃色熒光蛋白的獲得，不僅為同時追蹤多種蛋白質分子在細胞內的活動情況提供了方便，而且還為依據熒光共振能量轉移理論研究不同蛋白質之間的相互作用提供了一個有效工具。但是，在查爾菲用多管水母GFP作示蹤分子取得成功后的最初幾年里，無論錢永健等人如何努力，都無法基于多管水母GFP分子結構改造出應用范圍更廣的紅色熒光蛋白。在各種可見熒光中，紅光的穿透性最強，如果有了紅色熒光蛋白，人們便可以更方便地觀察非透明動物的細胞，乃至細胞內的蛋白質活動情況。而紅色熒光蛋白的發(fā)現乃錢永健團隊于1996年“設計”出黃色熒光蛋白三年后之事。

五、綠色熒光蛋白類似物的篩選與改進

1999年，俄羅斯科學院舍米亞金和奧夫欽尼科夫(Shemyakin-Ovchinnikov)生物有機化學研究所(前身為天然化學產物研究所)的謝爾蓋·盧科亞諾夫(Sergey Lukyanov,1963—)團隊，從珊瑚蟲中發(fā)現了六種特性與多管水母GFP相似的蛋白質，即GFP類似物(GFP-like proteins,縮寫為GFPs)。其中的四種發(fā)綠色熒光，一種發(fā)黃色熒光，一種發(fā)紅色熒光。在此之前，沒有一個人嘗試從珊瑚蟲中尋找多管水母GFP類似物，因為珊瑚蟲并非發(fā)光生物。紅色熒光蛋白的發(fā)現標志著熒光蛋白標記技術的發(fā)展又躍上一個新臺階。

錢永健團隊在全力開發(fā)多管水母GFP突變體時，另外一些團隊則在設法找尋多管水母GFP類似物。如前所述，早在20世紀70年代，瓦德和考彌爾就從發(fā)光海腎中提取到多管水母GFP類似物。之后，人們又從其他發(fā)光生物中提取到數種多管水母GFP類似物*M. Chalfie, Green Fluorescent Protein, Photochemistry and Photobiology, vol. 62, no. 4(1995), pp. 651-656.。這些GFP類似物與多管水母GFP一樣，擔負著第二級發(fā)射器的使命，也即負責接收體內發(fā)光蛋白質生產出的頻率較高的光能，然后把它轉換成頻率較低、波長更長的光能并將其發(fā)射出去*M. V. Mata, Y. A. Labas, J. Ugalde, Evolution of Function and Color in GFP-like Proteins, Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols, Second Edition, eds. by M. Chalfie, S. R. Kain, New Jersey:John Wiley & Sons Inc., 2006, pp. 139-162.。由于現有的GFP類似物和多管水母GFP一樣都是從發(fā)光生物中提取出來的，而且其發(fā)光機理與多管水母GFP也很相似，所以那些試圖尋找新型GFP類似物的團隊大多以發(fā)光生物為研究重點。盡管他們的篩選研究并非毫無收獲，但是歷經千辛萬苦尋獲的幾種GFP類似物都沒有太大的應用價值。篩選研究之所以收效甚微，主要是因為這些團隊被多管水母GFP及其類似物都是從發(fā)光生物中提取出來的表象迷惑了。此外，由于像多管水母這樣的發(fā)光生物是無色透明的，所以都以為多管水母GFP及其類似物的存在與生物本身的顏色無關，關鍵是生物要能夠發(fā)光*M. V. Mata, K. A. Lukyanov, S. A. Lukyanov, Family of the Green Fluorecent Protein: Journey to the End of the Rainbow, Bioessays, vol. 24, no. 10(2002), pp. 953-959.。

和其他團隊一樣，盧科亞諾夫團隊一開始也打算從發(fā)光生物入手，以期能夠從中篩選出具有較高應用價值的新型GFP類似物，尤其是紅色熒光蛋白。盧科亞諾夫1985年畢業(yè)于莫斯科大學胚胎學系，1994年在俄羅斯科學院生物有機化學研究所獲博士學位后，留在該所再生基因實驗室擔任資深科學家，主要從事選擇性抑制PCR技術的改良研究和蠑螈、渦蟲再生基因的克隆與測序研究。后者主要是在該所博士生米哈伊爾·馬茲(Mikhail Matz)的協(xié)助下展開的*Laboratory of Molecular Technologies, Sergey A. Lukyanov, [2011-09-25], http://www.ibch.ru/lgr/cv/cv_luk.htm.。由于GFP類似物的篩選研究與其先前從事的研究相近，故盧科亞諾夫決定抓住機遇及時啟動自身擁有一定競爭優(yōu)勢的GFP類似物篩選研究。

但是，盧科亞諾夫和馬茲的GFP類似物篩選研究計劃遭到俄羅斯科學院生態(tài)與進化研究所主要從事生物發(fā)光系統(tǒng)進化研究的專家優(yōu)里·拉巴斯(Yulii A. Labas,1933—2008)的質疑。拉巴斯向前來聽取意見的盧科亞諾夫和馬茲指出：被他們列作篩選對象的發(fā)光生物大都和多管水母沒有近緣關系，且大都出現得比較晚。雖然發(fā)光生物體內都含有發(fā)光蛋白質，但是多數發(fā)光生物體內未必有GFP類似物。GFP類似物是熒光蛋白，它和光能的生產無關。因此，不發(fā)光的生物體內未必沒有GFP類似物。一些珊瑚蟲自身并不發(fā)光，但卻能發(fā)出綠色的熒光。為什么不發(fā)揮想象力，試一試這類自身并不發(fā)光的熒光生物？*M. V. Mata, K. A. Lukyanov, S. A. Lukyanov, Family of the Green Fluorecent Protein: Journey to the End of the Rainbow, Bioessays, vol. 24, no. 10(2002), pp. 953-959.拉巴斯的建議對盧科亞諾夫和馬茲的觸動很大。之后，二人便開始將那些顏色鮮明并能發(fā)出熒光的珊瑚類物種確定為優(yōu)先篩選對象。

篩選研究過程中，若采用下村修當年所使用的方法，即先將熒光蛋白設法從生物體中分離出來，然后再進行純化、分析，那么篩選研究將會非常耗時，而且好不容易提取到的蛋白質未必就是想要的GFP類似物。因此，盧科亞諾夫團隊只能另辟蹊徑。在生物化學領域積累了豐富研究經驗的盧科亞諾夫經過一番分析后意識到，如果珊瑚中確實有GFP類似物，那么它的大小應該和多管水母GFP差不多，而且一些重要部位的結構，譬如發(fā)光基團和β-折疊拐點處的氨基酸排序應該和多管水母GFP相同。這意味著可以嘗試采用普拉舍當年分離、復制多管水母GFP基因時所使用的技術，來解決從珊瑚中提取GFP類似物之難題*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。研究技術路線確定之后，接下來就是付諸行動了。

當時俄羅斯尚未從蘇聯解體后的混亂中恢復過來，和西方同行相比科研經費談不上充裕的盧科亞諾夫團隊一開始并沒有跑到遠離莫斯科的熱帶海洋去采集熒光珊瑚。他們用來研究的第一批熒光珊瑚是從莫斯科市內的水族館商店廉價買來的。幾個月后，他們從一種被稱為?？臒晒馍汉髦姓业搅薌FP基因，并成功地對該基因進行了克隆*K. A. Lukyanov, D. M. Chudakov, A. F. Fradkov, Y. A. Labas, M. V. Mata, S. A. Lukyanov, Discovery and Properties of GFP-like Proteins from Nonbioluminescent Anthozoa, Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols, Second Edition, pp. 121-138.。這項成就的取得證明拉巴斯的推測是正確的，盧科亞諾夫確定的研究技術路線是可行的。此后，盧科亞諾夫團隊士氣大增，他們遠赴印度洋、西太平洋采集了多種色澤鮮明的珊瑚蟲。在莫斯科的實驗室里將這些珊瑚蟲中與顏色有關的DNA分離出來，并進行擴增之后，他們找出了重要部位的氨基酸排序與多管水母GFP相同的六種蛋白質。進一步研究表明，這六種蛋白質的熒光性質與多管水母GFP有著驚人的相似之處，且能在青蛙和哺乳類動物細胞中獲得高效表達。其中，一種發(fā)紅色熒光，一種發(fā)黃色熒光，剩下的四種則發(fā)綠色熒光。1999年10月，《自然—生物技術》雜志刊發(fā)了這一研究成果*M. V. Matz, A. F. Fradkov, Y. A. Labas, A. P. Savitsky, A. G. Zaraisky, M. L. Markelov, S. A. Lukyanov, Fluorescent Proteins from Nonbioluminescent Anthozoa Species, Nature Biotechnology, vol. 17, no. 10(1999), pp. 969-973.。

2000年，已擔任生物有機化學研究所分子技術實驗室(前身為再生基因實驗室)主任的盧科亞諾夫，率領團隊使用錯配PCR技術篩選發(fā)光速度更快、亮度更高的紅色熒光蛋白突變體時意外地發(fā)現，有一種突變體，它一開始發(fā)出的熒光呈綠色，之后在24小時內逐漸轉變?yōu)辄S色、橘黃色和紅色。利用這一特性，他們開發(fā)出一種熒光鐘，借以了解基因啟動子的活性隨時間變化的情況*A. Terskikh, A. Fradkov, G. Ermakova, A. Zaraisky, P. Tan, A. V. Kajava, X. N. Zhao, S. Lukyanov, M. Matz, S. Kim, I. Weissman, P. Siebert, “Fluorescent Timer”: Protein that Changes Color with Time, Science, vol. 290, no. 5496(2000), pp. 1585-1588.。而且，有人據此推測GFP是紅色熒光蛋白受損后固化下來的產物。后來人們發(fā)現，紅色熒光蛋白中的第83位氨基酸被替換之后，它就只能發(fā)綠色熒光*M. Zimmer, Glowing Genes: A Revolution in Biotechnology.。這項研究為上述推測提供了一個再好不過的注腳。此外，2000年，盧科亞諾夫團隊還從非熒光生物溝迎風?？?Anemoniasulcata)中提取到紫色的GFP類似物*K. A. Lukyanov, A. F. Fradkov, N. G. Gurskaya, M. V. Matz, Y. A. Labas, A. P. Savitsky, M. L. Markelov, A. G. Zaraisky, X. Zhao, Y. Fang, W. Tan, S. A. Lukyanov, Natural Animal Coloration Can Be Determined by a Nonfluorescent Green Fluorescent Protein Homolog, The Journal of Biological Chemistry, vol. 275, no. 34(2000), pp. 25879-25882.。這樣，與彩虹兩側同色的GFP類似物都被盧科亞諾夫團隊找到了。

由于波長較長的紅色熒光蛋白的應用前景非常廣，所以它引起人們的高度關注。2000年10月，馬茲就和雷明頓團隊合作完全解析清楚了它的晶體結構*D. Yarbrough, R. M. Wachter, K. Kallio, M. V. Matz, S. J. Remington, Refined Crystal Structure of DsRed, a Red Fluorescent Protein from Coral, at 2.0-? Resolution, PNAS, vol. 98, no. 2(2001), pp. 462-467.。與此同時，美國的另一個團隊也獨立地解明了紅色熒光蛋白的晶體結構，而且還搶先一個月發(fā)表了成果*M. A. Wall, M. Socolich, R. Ranganathan, The Structural Basis for Red Fluorescence in the Tetrameric GFP Homolog DsRed, Nature Structural Biology， vol. 7, no. 12(2000), pp. 1133-1138.。雖然紅色熒光蛋白的晶體結構與多管水母GFP的晶體結構極其相似，但它通常都以四聚體形態(tài)出現。這樣，用其標記目的蛋白質時，很容易引起目的蛋白質性質的變化。2002年，錢永健團隊成功地開發(fā)出單體形態(tài)的紅色熒光蛋白突變體*R. E. Campbell, O. Tour, A. E. Palmer, P. A. Steinbach, G. S. Baird, D. A. Zacharias, R. Y. Tsien, A Monomeric Red Fluorescent Protein, PNAS, vol. 99, no. 12(2002), pp. 7877-7882.。此后，紅色熒光蛋白就和多管水母GFP一樣，可以很方便地用于標記研究。由于紅色熒光蛋白基因是從生活在熱帶海洋中的珊瑚蟲里提取的，所以它在室溫下的表達速度比從生活在北太平洋的多管水母中提取的多管水母GFP基因更快。

六、結論

通過上述考察，我們可以得出如下結論：

1.1962年，在普林斯頓大學做博士后研究的下村修在開展多管水母發(fā)光物質研究時，首次發(fā)現“綠色蛋白質”。

2.1969年，哈佛大學的伍迪·哈斯廷和詹姆斯·莫林在研究腔腸動物發(fā)光蛋白質特性時，再次“發(fā)現”了多管水母“綠色蛋白質”，并將其命名為“Green Fluorescent Protein”，即綠色熒光蛋白。

3.1979年，下村修在研究多管水母綠色熒光蛋白分子的發(fā)光機理過程中，受海螢研究的啟發(fā)，推測出多管水母綠色熒光蛋白分子發(fā)光基團的化學結構。

4．1991年，道格拉斯·普拉舍在美國伍茲霍爾海洋生物學實驗室工作期間，用實驗驗證了下村修推測出的結構。同年，他還成功地分離出多管水母綠色熒光蛋白基因，并使用細菌的質粒作載體對其進行復制，確定了多管水母綠色熒光蛋白的基因序列。

5.1993年，在美國哥倫比亞大學執(zhí)教的馬丁·查爾菲使用普拉舍提供的含有多管水母綠色熒光蛋白基因的質粒，做綠色熒光蛋白基因表達實驗時取得成功，先后從大腸桿菌的體內和線蟲的神經細胞內觀察到多管水母綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光，實現綠色熒光蛋白在異體內的表達。

6.1994年，加州大學圣地亞哥分校的錢永健基于普拉舍等人的研究，采用剛剛興起的隨機誘變方法改組綠色熒光蛋白基因時，獲得一種光穩(wěn)定性和熒光強度都好于野生型的多管水母綠色熒光蛋白S65T突變體，以及一種發(fā)藍色熒光和一種發(fā)青色熒光的多管水母綠色熒光蛋白突變體。

7.1996年，錢永健和俄勒岡州立大學的詹姆斯·雷明頓等人合作，解析出多管水母綠色熒光蛋白S65T突變體的晶體結構。同年，萊斯大學的喬治·飛利浦團隊也完整地解析出野生型多管水母綠色熒光蛋白的晶體結構。

8．1996年，錢永健團隊利用與雷明頓合作所取得的有關綠色熒光蛋白晶體結構數據，通過使用計算機輔助設計，成功地開發(fā)出一種新的綠色熒光蛋白衍生物——黃色熒光蛋白。綠色、藍色、青色、黃色熒光蛋白的獲得，為同時追蹤多種蛋白質分子在細胞內的活動情況提供了方便。

9．1999年，俄羅斯的盧科亞諾夫團隊在篩選具有較高應用價值的新型綠色熒光蛋白類似物，尤其是紅色熒光蛋白的過程中，從珊瑚蟲中發(fā)現四種發(fā)綠色熒光、一種發(fā)黃色熒光和一種發(fā)紅色熒光的綠色熒光蛋白類似物。第二年，該團隊又從非熒光生物溝迎風?？刑崛〉阶仙木G色熒光蛋白類似物。

10. 2002年，錢永健團隊成功地開發(fā)出單體形態(tài)的紅色熒光蛋白突變體，解決了紅色熒光蛋白通常以四聚體形態(tài)出現，用其標記目的蛋白質時容易引起蛋白質性質變化的難題。更適合作為標識的紅色熒光蛋白的問世，標志著熒光蛋白標記法的應用與普及步入一個新時代。

很明顯，自下村修1962年發(fā)現多管水母綠色熒光蛋白，到查爾菲1993年實現多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達，整整經歷了31年。在這31年里，盡管下村修推測出多管水母綠色熒光蛋白分子發(fā)光基團的化學結構，普拉舍成功地對多管水母綠色熒光蛋白基因進行分離與復制，并確定其基因序列，從而深化人們對多管水母綠色熒光蛋白結構與性質的認識，使人們無須大量捕撈野生多管水母就可以批量制備多管水母綠色熒光蛋白，但是，在此期間，人們始終未能為多管水母綠色熒光蛋白找到應用之途，科學發(fā)現始終未能轉化為技術發(fā)明。

多管水母綠色熒光蛋白的研究由基礎研究階段邁入應用研究階段的標志，是查爾菲成功地實現了多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達。查爾菲1993年進行活細胞示蹤實驗時，能夠從大腸桿菌的體內和線蟲的神經細胞內觀察到多管水母綠色熒光蛋白發(fā)出的熒光，無疑與下村修、普拉舍等人開展的基礎研究有關。沒有眾多科學家的前期研究積累，便不會有查爾菲的重大研究突破。查爾菲實現多管水母綠色熒光蛋白在異源生物體中的表達，既是一項科學發(fā)現，也是一項技術發(fā)明。說其是科學發(fā)現，是因為查爾菲用實驗證明多管水母綠色熒光蛋白無需任何輔助因子和反應底物，就可以自行形成發(fā)光基團。說其是技術發(fā)明，是因為查爾菲用實驗證明可以使用多管水母綠色熒光蛋白來進行生物分子示蹤。這種新方法的發(fā)明，為生物學的大發(fā)展提供了一種全新的工具，開啟了使用生物熒光材料進行生物分子示蹤研究的先河。

盡管查爾菲首創(chuàng)了使用多管水母綠色熒光蛋白進行生物分子示蹤研究的新方法，但多管水母綠色熒光蛋白并非理想的生物熒光標記材料，而且只有綠色熒光蛋白時，人們無法同時進行多細胞跟蹤研究。這樣一來，如何進一步改進綠色熒光蛋白示蹤效果，研制更多顏色的熒光蛋白，就成為擺在科學家面前的一項重要課題。針對這一需求，錢永健團隊自1994年起使用剛剛興起的隨機誘變方法，開發(fā)出多種不同顏色的多管水母綠色熒光蛋白突變體。但是，這些突變體的熒光激發(fā)波長都小于綠色熒光蛋白。因此，在多管水母綠色熒光蛋白的晶體結構被完全解明之后，錢永健1996年又通過改造多管水母綠色熒光蛋白的分子結構，“設計”出一種熒光激發(fā)波長更長的黃色熒光蛋白。錢永健在1994—1996年的三年里所開展的綠色熒光蛋白改良研究，可以說是在應用方向已經相當明確的情況下開展的一種旨在滿足分子生物學發(fā)展需求的技術開發(fā)活動。

由于在可見光中，紅色熒光蛋白的熒光激發(fā)波長最長，所以更適合作示蹤材料。問題是如何開發(fā)這種能夠更好滿足生物研究需求的紅色熒光蛋白。經過不斷探索，俄羅斯科學家盧科亞諾夫最終獨辟蹊徑，于1999年從非發(fā)光生物——珊瑚蟲中分離出紅色熒光蛋白基因。但是，使用從珊瑚中分離出的紅色熒光蛋白基因制備的紅色熒光蛋白通常都以四聚體形態(tài)出現，仍然不適合做生物熒光標記材料。因此，研制單體形態(tài)的紅色熒光蛋白成為當務之急。最終成功解決這一難題的仍然是錢永健，時間是2002年。此后，科學家們便可以很方便地將不同的蛋白質或細胞“染上”不同的顏色，借以跟蹤研究其活動過程。

要而言之，盡管很多科學家都參與了多管水母綠色熒光蛋白的研究開發(fā)競爭，而且很多參與者都做出了原創(chuàng)性的貢獻，但是做出具有里程碑意義的開創(chuàng)性貢獻的只有兩人，一是下村修，二是查爾菲。不過，如果沒有錢永健的研究貢獻，使用生物熒光標記材料進行蛋白質或細胞示蹤研究便不可能快速地獲得廣泛普及，分子生物學也就不可能獲得像今日這樣突飛猛進的發(fā)展。因此，瑞典皇家科學院決定將2008年的諾貝爾化學獎授予對多管水母綠色熒光蛋白的發(fā)現、表達和開發(fā)做出杰出貢獻的三位科學家下村修、馬丁·查爾菲和錢永健，乃理所應當。

責任編校：余沉

DOI：10.13796/j.cnki.1001-5019.2016.04.002

中圖分類號：G31

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5019(2016)04-0008-14

基金項目：北京市科技計劃項目(Z151100002615005)

作者簡介：周程，北京大學哲學系暨科學與社會研究中心教授，博士生導師(北京100871)。