高良姜多糖對酪氨酸酶抑制作用的研究

楊達城， 何曾華， 屈 義， 袁小誼， 劉 海， 諶素華， 鐘賽意*

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學實驗教學部現(xiàn)代生化中心，廣東湛江 524088)

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高良姜多糖對酪氨酸酶抑制作用的研究

楊達城1， 何曾華1， 屈 義1， 袁小誼1， 劉 海2， 諶素華1， 鐘賽意1*

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江 524088；2.廣東海洋大學實驗教學部現(xiàn)代生化中心，廣東湛江 524088)

摘要[目的]研究高良姜多糖對酪氨酸酶活性的抑制作用。[方法]以新鮮的高良姜和馬鈴薯為原料，通過比色法、色差儀法、Photoshop圖像灰度值分析等測定高良姜多糖對馬鈴薯酪氨酸酶活性的抑制率，以及對馬鈴薯勻漿褐變度和反應體系顏色值變化的影響。[結果]試驗得出，高良姜多糖對酪氨酸酶的活力有顯著的抑制作用，其IC50為0.315 mg/mL，能顯著降低反應體系的褐變度。[結論] 高良姜多糖具有較強的酪氨酸酶抑制活性，可望用于美白護膚、果汁護色、鮮切果蔬保鮮等領域,值得進一步研究。

關鍵詞高良姜多糖；酪氨酸酶；抑制作用；褐變

Inhibitory Effect of Polysaccharides fromAlpiniaofficinarumHance on Tyrosinase Activity

YANG Da-cheng，HE Zeng-hua，QU Yi，ZHONG Sai-yi*et al (College of Food Science and Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088)

Abstract[Objective]To investigate the effect of polysaccharides fromAlpiniaofficinarumHance on the inhibition of tyrosinase activity.[Method] With freshA.officinarumand potato as raw materials，colorimetry，color-difference meter and image gray value analysis with Photoshop were employed to investigate the effect of polysaccharides on the inhibition of tyrosinase activity in potato，browning of potato homogenates，and color values changes of the reaction system.[Result] The results showed that polysaccharides could significantly inhibit the tyrosinase activity，with anIC50of 0.315 mg/mL，and reduce the browning degree of reaction system.[Conclusion] The polysaccharide fromA.officinarumhas strong inhibitory effect on tyrosinase activity，which is expected to be used in whitening skin，juice color protection，fresh cut fruits，vegetables preservation areas，and is worth further studying.

Key wordsAlpiniaofficinarumHance polysaccharide; Tyrosinase; Inhibitory effect; Browning

酪氨酸酶(EC 1.14.18.1)是一種活性中心具有雙銅離子的氧化還原酶，廣泛存在于微生物、動物和植物中，參與黑色素合成的前兩步反應，是黑色素合成的限速酶，由酪氨酸酶催化酪氨酸氧化形成黑色素的反應是引起皮膚色素沉積、蔬菜水果褐變的關鍵酶[1]。因此，酪氨酸酶抑制劑被作為具有美白作用的添加劑加入到化妝品中或者用于食品保鮮。近幾年來，從天然產物中尋找酪氨酸酶抑制劑引起越來越多國內外學者的關注[2-4]，尋找一種有效的來自天然產物的酪氨酸酶抑制劑在食品工業(yè)方面具有實際的應用價值。

高良姜，又名徐聞良姜，藥學名AlpiniaofficinarumHance，是一種熱帶、亞熱帶多年生長的姜科植物，具有較高的藥用和食用價值，是十大南藥之一。前人研究顯示，高良姜化學成分復雜，藥理活性強，有較強的抗?jié)?、抗腹瀉、利膽、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓形成等作用，是一種尚未充分開發(fā)利用的保健和藥用資源，具有較高的學術研究價值和實際開發(fā)利用價值。湛江徐聞縣是高良姜的原產地，是我國高良姜的最主要生產基地。然而，由于目前高良姜的用途單一，基本僅以干品作為藥材使用，銷量有限。近年來，由于收購價格不穩(wěn)定，高良姜的種植面積逐步萎縮，這一寶貴的南藥資源沒有得到應有的開發(fā)和利用。

高良姜多糖在抑制酪氨酸酶作用方面研究較少，且用于抑制馬鈴薯褐變的研究尚未見報道。筆者以清水處理為對照，探究隨著時間變化，不同含量高良姜多糖對馬鈴薯樣品色澤的影響及其相關生理變化。擬以0.6 mg/mL抗壞血酸為陽性對照，對比高良姜多糖與抗壞血酸對馬鈴薯褐變抑制作用的差異，旨在為高良姜多糖在抑制酪氨酸酶方面的應用提供理論依據(jù)，為高良姜多糖的進一步研究開發(fā)與利用以及新型高效酪氨酸酶抑制劑的開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料及主要試劑。供試原料：新鮮高良姜，采自湛江徐聞縣龍?zhí)伶?zhèn)高良姜基地；新鮮馬鈴薯，購于湛江湖光市場。主要試劑：抗壞血酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鄰苯二酚，分析純，廣東光華科技股份有限公司; 聚乙烯吡咯烷酮(K30)，分析純，上海展云化工有限公司。

1.1.2主要儀器設備。DC-P3自動色差儀，北京市興光測色儀器有限公司；UV-2800AH型紫外可見光分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；KDC-160HR高速冷凍離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；NP 200A型電子太平，上海精科天平；YKKY雪花制冰機，北京長流科學儀器公司。

1.2方法

1.2.1高良姜多糖的制備。新鮮高良姜莖塊清洗干凈后，在40 ℃烘箱中干燥至恒重，粉碎，稱取200 g高良姜粉，加入4倍量體積95%乙醇，回流提取3 h，離心得提取液，其殘渣再用相同體積和濃度的乙醇重復提取一次，合并提取液，經4 000 r/min 離心 15 min后收集沉淀，依次用無水乙醇、丙酮、石油醚進行多次抽洗。殘渣風干后以料液比1∶20 g/mL、80 ℃熱水浸提2 h，取上清液濃縮，加 95%乙醇醇析，沉淀物用蒸餾水復溶后再加95%乙醇醇析，反復3次，將沉淀依次用無水乙醇、無水乙醚、丙酮洗滌，得高良姜粗多糖。繼續(xù)采用Sevage法除蛋白。用少量雙蒸水溶解粗多糖，混勻后按4∶1的比例加入氯仿-正丁醇(5∶1) 混合液，振搖20 min，離心去除蛋白，重復2~3 次。上清液用3倍體積的乙醇沉淀，即得脫蛋白的高良姜多糖。將多糖溶解后加入適量的30%H2O2，在50 ℃下保溫脫色20 min，加入 3倍體積的相應濃度的乙醇，離心后取沉淀用 95%乙醇、無水乙醇各淋洗 1 次，丙酮、乙醚各淋洗 2 次后，真空干燥得高良姜水溶性多糖。

1.2.2酪氨酸酶的提取。參照文獻[5-7]的方法，略做修改。取10 g馬鈴薯肉，向研缽加入30 mL pH 6.8的0.2 mol/L磷酸緩沖液(內含0.4 gPVP和0.1%triton X-100),研磨，分2次各加10 mL磷酸緩沖液洗研缽并轉移至離心管，冰浴10 min，在4 ℃，8 000 r/min條件下離心15 min，上清液備用，即為酪氨酸酶粗酶液。

1.2.3褐變度的測定。參照文獻[8-11]的方法，略做修改。將馬鈴薯肉勻漿，按照2∶3(m/V)的比例分別與濃度為0.2、0.6、1.0 mg/mL的高良姜多糖于試管中混勻，在40 ℃恒溫水浴120 min后，在25 ℃、8 000 r/min的條件下離心15 min，將上清液倒入試管，拍照，然后用分光光度計在410 nm波長下測定各個上清液的吸光值，以吸光值大小表示褐變度。以蒸餾水為對照組，以0.6 mg/mL的抗壞血酸作為陽性對照。

1.2.4高良姜多糖對酪氨酸酶的抑制作用。參考文獻[12]的方法并略做修改。灰度值是指物體表面顏色的深度，它能反映色素的含量?；叶戎涤。旧?，黑色素的含量愈多，灰度值與黑色素的含量呈反比，即灰度值越小，說明褐變程度越大。在培養(yǎng)皿中加入10 mL粗酶液，同時迅速加入底物鄰苯二酚2 mL和1 mL濃度分別為0.6、0.8和1.0 mg/mL的高良姜多糖，以0.6 mg/mL抗壞血酸作陽性對照，用Photoshop圖像處理軟件測定其灰度值，以劃“X”的方式取5個點，計算其平均值，即為最終灰度值。

1.2.5高良姜多糖對酪氨酸酶的抑制率的測定。參照周盈利等的方法[13-14]，在3.5 mL反應液中加入2.9 mL 10 mmol/L鄰苯二酚(用緩沖液配制)和0.5 mL不同濃度的高良姜多糖，以蒸餾水為對照組。加入0.1 mL酶液，迅速搖勻，倒入比色皿，5 min時，于410 nm波長處測定吸光度，并按下式計算酶活抑制率：

抑制率=(OD1-OD2)/OD1×100%

式中，OD1為未加抑制劑的吸光值；OD2為加抑制劑的吸光值。

采用寇氏改良法計算半數(shù)抑制率IC50值：

lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]

式中，Xm為lg最大劑量；I為lg(最大劑量/相臨劑量)；P為陽性反應率之和；Pm為最大陽性反應率；Pn為最小陽性反應率。

1.2.6色澤的測定。使用DC-P3自動色差儀測定色澤，結果以L*、a*、b*值表示。HunterL*值表示顏色深淺，L*值越大，表示顏色越淺，越有光澤；反之，L*值越小，表示顏色越深。Huntera*值表示紅綠程度，a*值為“+”時表示紅的程度，a*值越大，表示紅色越深；Hunterb*值表示黃藍的程度，b*為“+”時，表示黃的程度，b*值越大，表示黃色越深。

在100 mL燒杯中加入2 mL底物鄰苯二酚和1 mL濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL抗壞血酸，然后加入10 mL酪氨酸酶液迅速混勻，加入比色杯中5 min后測定并記錄反應體系的HunterL*、a*、b*值。

2結果與分析

注：陽性對照為0.6 mg/mL的抗壞血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.圖1　不同濃度高良姜多糖處理對馬鈴薯勻漿褐變(左)及褐變度(右)的影響Fig.1　Effects of different concentrations of A.officinarum polysaccharide on potato homogenates browning(left) and browning degree(right)

2.1高良姜多糖對馬鈴薯勻漿褐變度的影響馬鈴薯勻漿在40 ℃恒溫水浴2 h后發(fā)生明顯褐變，經不同濃度的高良姜多糖處理可以顯著抑制其褐變的發(fā)生(圖1左)，采用圖像處理軟件測定其灰度值(圖1右)，可以看出0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖處理均能顯著降低馬鈴薯勻漿的褐變度，且隨多糖濃度增加褐變抑制作用愈明顯。2.2高良姜多糖對酪氨酸酶促褐變的抑制作用灰度值越小，物系變色程度越深，即是褐變程度越大。由圖2(上)可見，高良姜多糖對酪氨酸酶引起的底物褐變具有顯著的抑制作用。試驗前加入了底物鄰苯二酚，加快了反應速度，采用Photoshop圖像處理軟件對培養(yǎng)皿內酪氨酸酶反應體系的灰度值進行定量分析。由圖2(下)可知，對照組灰度值最低，以0.6、0.8、1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗壞血酸處理后，酪氨酸酶的褐變程度明顯低于對照組；而高濃度(0.8、1.0 mg/mL)的高良姜多糖處理后，灰度值高于0.6 mg/mL的高良姜多糖處理。這些結果表明，高良姜多糖對酪氨酸酶有抑制作用。在10 mL酪氨酸酶和2 mL鄰苯二酚的條件下0.6 mg/mL的高良姜多糖抗褐變的能力相當于0.6 mg/mL的抗壞血酸作用的95.6%。

注：陽性對照為0.6 mg/mL抗壞血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.圖2　不同濃度高良姜多糖處理對酪氨酸酶褐變的灰度值的影響Fig.2　Effects of different concentrations of A.officinarum polysaccharide on the gray value of tyrosinase browning

2.3高良姜多糖對酪氨酸酶抑制率的影響從圖3可知，隨著高良姜多糖濃度的升高，高良姜多糖對酪氨酸酶的抑制率呈現(xiàn)上升趨勢。以0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗壞血酸處理后，對酪氨酸酶的抑制率明顯高于對照組。在2.9 mL 10 mmol/L鄰苯二酚和0.5 mL不同濃度的高良姜多糖以及0.1 mL酶液的反應體系中，0.6 mg/mL的高良姜多糖對酪氨酸酶的抑制率相當于0.6 mg/mL抗壞血酸作用的62%。采用改良寇式法求出高良姜多糖對酪氨酸酶的半數(shù)抑制濃度IC50為0.315 mg/mL。

注：陽性對照為0.6 mg/mL抗壞血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid. 圖3　不同濃度高良姜多糖對酪氨酸酶的抑制率Fig.3　Inhibition ratio of different concentrations of A.officinarum polysaccharide on tyrosinase

2.4高良姜多糖對酪氨酸酶反應體系HunterL*值的影響由圖4可知，隨著高良姜多糖濃度的升高，不同濃度高良姜多糖處理酪氨酸酶后HunterL*值呈現(xiàn)上升趨勢。對照組HunterL*值最低，以0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗壞血酸處理后，HunterL*值高于對照組，且呈濃度依賴關系。在10 mL酪氨酸酶、2 mL鄰苯二酚的反應體系下，0.2 mg/mL的高良姜多糖相當于0.6 mg/mL的抗壞血酸作用的122%。說明高良姜多糖含量增高對酪氨酸酶體系的亮度具有顯著作用。

注：陽性對照為0.6 mg/mL抗壞血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.圖4　不同濃度高良姜多糖處理對酪氨酸酶反應體系Hunter L*值的影響Fig.4　 Effects of different concentrations of A.officinarum polysaccharide on Hunter L* value of tyrosinase reaction system

2.5高良姜多糖對酪氨酸酶Huntera*值的影響由圖5可知，隨著高良姜多糖濃度的升高，不同濃度高良姜多糖處理酪氨酸酶后Huntera*值呈現(xiàn)下降趨勢，呈濃度依賴關系。對照組Huntera*值最高，以0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗壞血酸處理后，Huntera*值低于對照組。在10 mL酪氨酸酶、2 mL鄰苯二酚的反應體系中，0.6 mg/mL的高良姜多糖的作用相當于0.6 mg/mL抗壞血酸作用的45%，說明高良姜多糖處理顯著降低了酪氨酸酶反應體系的紅度值。

注：陽性對照為0.6 mg/mL抗壞血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.圖5　高良姜多糖處理對酪氨酸酶反應體系Hunter a*值的影響Fig.5　 Effects of A.officinarum polysaccharide on Hunter a* value of tyrosinase reaction system

2.6高良姜多糖處理對酪氨酸酶反應體系Hunterb*值的影響由圖6可知，隨著高良姜多糖濃度的升高，不同濃度高良姜多糖處理酪氨酸酶后Hunterb*值呈現(xiàn)下降趨勢。對照組Hunterb*值最高，以0.2~1.0 mg/mL的高良姜多糖和0.6 mg/mL的抗壞血酸處理后，Hunterb*值低于對照組。而1.0 mg/mL高良姜多糖處理后，Hunterb*值低于0.2 mg/mL高良姜多糖處理。在10 mL酪氨酸酶、2 mL鄰苯二酚的反應體系中，0.6 mg/mL的高良姜多糖作用相當于同濃度抗壞血酸作用的96%，說明高良姜多糖處理顯著降低了酪氨酸酶反應體系的藍度值。

注：陽性對照為0.6 mg/mL抗壞血酸。Note：The positive control is 0.6 mg/mL ascorbic acid.圖6　高良姜多糖處理對酪氨酸酶反應體系Hunter b*值的影響Fig.6　Effects of A.officinarum polysaccharide on Hunter b* value of tyrosinase reaction system

3結論

該試驗初步研究了高良姜多糖對酪氨酸酶活性的抑制作用，結果顯示，不同濃度的高良姜多糖能顯著降低馬鈴薯勻漿的褐變度、降低酪氨酸酶-鄰苯二酚反應體系的顏色值，對酪氨酸酶活性具有顯著的抑制作用，且存在量效關系，其半數(shù)抑制濃度IC50值為0.315 mg/mL。在Hunter值的探討中，高良姜多糖抑制了HunterL*的下降和a*、b*值升高，表明高良姜多糖對保持酪氨酸酶反應體系的明亮度，防止色澤加深有較好的效果。對于酪氨酸酶抑制劑在食品和化妝品中的應用，抑制劑的安全性是首要考慮的因素。高良姜多糖是一種天然提取物，作為食品本身其安全性得到可靠保障。因此，高良姜多糖在食品工業(yè)上有很大的應用前景。該研究提示，高良姜多糖可用于美白護膚、果汁護色、鮮切果蔬保鮮等領域，值得進一步研究。

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收稿日期2015-12-30

作者簡介楊達城(1992- )，男，廣東惠州人，本科生，專業(yè)：食品科學與工程。*通訊作者，副教授，博士，從事食品功能因子及功效評價方面的研究。

基金項目廣東省公益研究與能力建設專項資金(2015A020209166)；廣東省大學生科技創(chuàng)新培育專項資金(pdjh2015b0254)。

中圖分類號S 59

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)03-081-04