用蛋白質(zhì)指紋技術(shù)預(yù)測局部晚期胰腺癌伽瑪?shù)吨委煰熜У难芯繄蟾?

張永亮耿麗袁慧欣石磊楊曦裴毅

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用蛋白質(zhì)指紋技術(shù)預(yù)測局部晚期胰腺癌伽瑪?shù)吨委煰熜У难芯繄蟾?

張永亮①耿麗①袁慧欣①石磊①楊曦①裴毅②

【摘要】目的：使用蛋白質(zhì)指紋技術(shù)（SELDI）預(yù)測伽瑪?shù)吨委熅植客砥谝认侔┲委熜Ч呐R床應(yīng)用價值。方法：選擇2010年2月-2014年10月本院35例行伽瑪?shù)兑认侔┗颊?，于治療前抽血保存?80 ℃低溫冰箱，伽瑪?shù)吨委熀?個月，按WHO實體間質(zhì)譜技術(shù)（SELDE-TOF-MS），通過分析血清特異性蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖，尋找差異蛋白指紋。結(jié)果：有效組與無效組中共檢測出56個蛋白質(zhì)峰，其中豐度（M/Z）為3337、9234、11 650的蛋白質(zhì)組指紋兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中無效組上調(diào)的峰M/Z 為3337、11 650，下調(diào)的峰M/Z為9234。結(jié)論：使用SELDI可以預(yù)測伽瑪?shù)吨委熅植恳认侔┑呐R床療效，為臨床治療提供指導(dǎo)。

【關(guān)鍵詞】蛋白質(zhì)指紋技術(shù)； 胰腺癌； 伽瑪?shù)?/p>

①武警山西總隊醫(yī)院 山西 太原 030006

②山西大醫(yī)院

First-author’s address：The Armed Police Corps Hospital General Department in Shanxi， Taiyuan 030006， China

胰腺癌是我國常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病率近年來在我國逐年上升。隨著胰腺癌的影像學(xué)診斷技術(shù)及生物學(xué)檢測技術(shù)不斷提高，胰腺癌的診斷有了一定的進展，但該疾病的早期診斷問題依然存在且尚未得到圓滿解決[1]，大部分診斷時已為晚期，失去手術(shù)治療機會，預(yù)后極差，75%患者常在診斷后年內(nèi)死亡[2]。5年生存率為5%以下，明顯低于其他惡性腫瘤[3-4]?，F(xiàn)階段，全世界針對晚期胰腺癌的治療無有效治療手段，我國也結(jié)合自身國情，不斷探索新的、有效的治療途徑。近年來，伴隨著計算機、電子技術(shù)、分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，立體定向放射治療技術(shù)應(yīng)用而生，γ刀即γ射線立體定向放射外科（治療）在我國得到長足發(fā)展。因γ刀較常規(guī)放療明顯的優(yōu)勢是對瘤體部位可給予較高的照射劑量，但對周圍正常組織影響小，在治療局部晚期胰腺癌取得很好的短期治療效果，且大多數(shù)患者均能耐受。體定向放射治療逐漸被認為是治療不能手術(shù)切除胰腺癌的主要手段之一[5-6]。但在臨床中也發(fā)現(xiàn)，部分患者在治療后效果差，而往往在腫瘤明顯增大后才發(fā)現(xiàn)進展，最佳的治療價值已經(jīng)失去。針對這一問題，筆者利用蛋白質(zhì)-飛行時間質(zhì)譜（Surface-enhance laser desorption ionization，SELDI）技術(shù)對胰腺癌伽瑪?shù)吨委熀蟑熜нM行前瞻性研究，結(jié)果匯報如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年2月-2014年10月在本科住院治療的胰腺癌患者35例，其中男21例，女14例；年齡36～80歲，中位年齡54歲；入院前都進行腫瘤標志物（CA19-9、CEA等）檢測、超聲及CT等檢查。其中15例病理診斷為腺癌，3例病理診斷為黏液腺癌；有5例侵犯至膽管，有4例侵犯至臨近大血管者，有4例腫瘤直接侵及至十二指腸，有6例侵犯至胰腺周圍組織；腫瘤平均直徑>5 cm者10例，平均直徑<5 cm者25例。入組標準：（1）化驗血細胞分析大致正常；（2）經(jīng)組織病理學(xué)或細胞學(xué)診斷為胰腺癌，同時排除發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移者，根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）腫瘤分期標準，診斷為局部晚期胰腺癌者；（3）治療前行超聲、CT斷層掃描、磁共振或PET-CT等影像學(xué)檢查，經(jīng)臨床診斷為胰腺癌；（4）患者拒絕行手術(shù)治療或因內(nèi)科疾病本能行手術(shù)治療或患者經(jīng)外科會診，不適合行手術(shù)治療；（5）心、腦、肺、腎等器等明顯功能在障礙；（6）患者治療前KPS評分為60～100分；（7）能夠耐受固定體位30 min以上；（8）預(yù)計生存期在3個月以上。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 所有伽瑪?shù)吨委熁颊咴谥委熐埃科鸩煽崭轨o脈血約3 mL（非抗凝管），靜置，離心處理后，分離出血清，放置于-80 ℃低溫冰箱。

1.2.2 主要儀器、軟件及試劑 立體定向伽瑪射線全身放射治療系統(tǒng)（SGS-Ⅰ型，深圳海博公司）。能量吸收分子EMA，HFPF緩沖鹽（Sigma公司），MATLAB 7.0.1軟件，Biomarker Wizar、CM10型蛋白質(zhì)芯片及其分析軟件ProteinChip 3.2.0（Ciphergen公司），PBS-Ⅱc表面增強飛行時間質(zhì)譜儀（SELDITOF-MS），CHAPS緩沖鹽（Sigma公司）。PBSⅡc型蛋白質(zhì)芯片飛行時間質(zhì)譜儀（Ciphergen公司），LDZ5-2型低速自動平衡離心機（北京醫(yī)用離心機廠），MDF-382型-80 ℃冰箱（SANYO公司），振蕩器（MS1 Minishaker），PB20型pH測量儀（SARTORIUS公司），ER-182A型電子天平（A&D公司），2、10、20、100、200、1000 μL微量加樣槍（Gilson公司），Tips P20，P200，P1000 （AXYGEN公司），50 mL離心管（CORNING公司），0.5 mL，1.5 mL微形離心管（AXYGEN公司），Biomarker Patterns Software（Biorad公司），SPSS 16.0（SPSS公司），三氟乙酸（TFA）（Sigma公司），乙腈（CAN），HPLC級（Sigma公司），無水醋酸鈉（NaAc）（Sigma公司），3-[3-（膽酰氨丙基）二甲銨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）（Sigma公司），Tris堿（Sigm公司），氯化氫（HCL）（Sigma），水，HPLC級（Sigma公司），尿素（urea）（Sigma公司），SPA （Sigma公司），氯化鈉（NaCl）（Sigma公司），氫氧化鈉（NaOH）（Sigma公司），二硫基蘇糖醇（DTT）（Sigma公司），羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）（Sigma公司）。

1.2.3 試驗方法 （1）血清標本的處理：首先通過冰浴解凍血清標本，離心2 min（10 000 r/min）后，抽取血清樣品5 μL，其中加入10 μL 9M尿素，振蕩30 min后，加入180 L緩沖液稀釋（100 mmol/L NaOAc pH 4.0），于4 ℃恒溫下，按10 000 r/min離心2 min，取出上清液待用。（2）WCX2芯片處理：小心地取出WCX2的芯片，在其背后標記時間、芯片種類以及操作者姓名等資料；打開生物芯片處理器（Bioprocessor）將芯片放入，在組裝生物芯片處理器時，要避開加樣孔，把標有”A”的一頭的芯片靠外端放置，同時注意密封；每孔分別加入200 μL結(jié)合緩沖液（50 mM NaAC，pH 4.0），置于振蕩器上（MS1 Minishaker），按400～600 r/min，震蕩5 min，后甩掉緩沖液。按上述操作重復(fù)1次。操作過程中要注意保持芯片上每個點的表面濕潤，加緩沖液后如發(fā)現(xiàn)芯片表面有氣泡，用取液器吹去，槍頭避免接觸芯片上各點的表面；在芯片處理器每孔中分別加入100 μL處理好的樣品，4 ℃下，置振蕩器中（MS1 Minishaker）按400～600 r/min，震蕩1 h。甩出樣品后，將樣品甩入預(yù)裝消毒劑的容器中；每孔分別加入200 μL的結(jié)合緩沖液（50 mM NaAc），置于振蕩器中（MS1 Minishaker），400～600 r/min，室溫震蕩5 min，甩去孔中的液體（注意不要甩的太干），重新加入結(jié)合緩沖液200 μL，繼續(xù)上述操作1次。每孔分別加入200 μL HPLC水，立即甩出；拆開芯片處理器，取出芯片，待干后，在每個加樣孔中分別加如SPA 0.5 μL，再次待干后，重復(fù)加SPA 0.5 μL一次；用CM10 蛋白芯片閱讀儀讀芯片（SPA為50%乙腈和0.5%三氟乙酸的飽和溶液）。（3）收集數(shù)據(jù)：設(shè)定檢樣激光強度為195，檢測靈敏度為8，收集數(shù)據(jù)質(zhì)荷比（M/Z）范圍為1～2 KD，收集位置為20～80，平均每點收集20次，總點數(shù)收集為140次。為控制誤差低于0.1%，在收集實驗數(shù)據(jù)之前，使用蛋白芯片（All-inone）對儀器進行校正。通過質(zhì)量控制蛋白質(zhì)芯片進行重復(fù)性檢測。

1.3 伽瑪?shù)吨委煼椒?（1）CT定位，定位前患者空腹6 h，定位前30 min，將濃度76%的20 mL復(fù)方泛影葡胺稀釋為300～400 mL后服下，更好地顯示胃、十二指腸和小腸的位置；（2）取伽瑪?shù)抖ㄎ回搲捍?，其上固定有三維坐標的立體定向體架，患者雙手舉置于額頭前，將負壓袋置于定位床中，進行體位固定，固定胸腹部，體表標記重復(fù)擺位點；（3）采用CT模擬定位技術(shù)，平靜呼吸下行腹部CT增強掃描（建立外周血靜脈通道，用碘海醇300 mg置入注射器進行高壓泵注射），掃描范圍通常取膈頂至4腰椎椎體水平，層厚為3～5 mm，層間距5 mm，通常包括腫瘤范圍、局部淋巴引流區(qū)、肝臟、腎臟、胃、十二指腸以及部分腸道等，通過計算機獲得定位影像資料；（4）CT圖像通過網(wǎng)絡(luò)傳輸?shù)劫が數(shù)吨委熡媱澫到y(tǒng)（treatment plan system， TPS），醫(yī)生在增強CT圖像上勾畫靶區(qū)，通過圖像處理后，輸出治療文件；（5）根據(jù)患者的狀況、腫瘤靶區(qū)（grosstarget volume， GTV）、臨床靶體積（clinical target volume，CTV）、計劃靶體積（planning target volume， PTV）以及治療目的來調(diào)整射線劑量具體分布及放射治療方案。PTV應(yīng)覆蓋100%CTV，將等劑量曲線設(shè)定為60%，靶區(qū)相鄰的十二指腸射線受量控制在15%～30%，超過5 cm的腫瘤單次周邊照射劑量控制在2.5～3.5 Gy，不超過5 cm的腫瘤單次周邊照射劑量控制在3.0～4.0 Gy；（6）分次劑量為300～400 cGy，次/周，治療次數(shù)為8～12次，放射總劑量為3500～4500 cGy。

1.4 分析方法

1.4.1 療效評價標準 評估近期療效參照世界衛(wèi)生組織實體瘤通用評價方法作為評價標準，共分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）以及進展（PD）。通常以CR、PR為有效。完全緩解為腫瘤完全消退至少4周以上，無新的病灶出現(xiàn)；部分緩解為腫瘤消退≥50%，至少維持4周且無新的病灶出現(xiàn)；穩(wěn)定為腫瘤消退<50%或增大<25%；病變進展0為腫瘤增大≥25%或出現(xiàn)新的病灶。療效于伽瑪?shù)吨委熀?個月評定。

1.4.2 分組方法 根據(jù)WHO實體腫瘤療效評價標準將伽瑪?shù)吨委熀?個月的患者分成治療有效組（CR+PR）和治療無效組（SD+PD）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 使用Biomarker Wizard 3.1軟件統(tǒng)一進行分析，通過比較有效組和無效組血清蛋白質(zhì)指紋圖譜數(shù)據(jù)，尋找兩組表達差異性的蛋白質(zhì)峰，通過此軟件進行分析、計算，進行比較二組中相同質(zhì)荷比的蛋白質(zhì)含量（豐度）的P值，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

通過比較有效組和無效組血清特異性蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖，共檢測出56個蛋白質(zhì)峰，經(jīng)過Biomarker Wizard 3.1軟件分析，其中M/Z為3337、9234、11 650的蛋白質(zhì)組指紋（豐度）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中無效組上調(diào)的峰M/Z為3337、11 650，下調(diào)的峰M/Z為9234。見表1。用SELDI技術(shù)描述35例患者的蛋白質(zhì)組指紋見圖1。

表1 有效組與無效組指紋豐度（M/Z）比較

圖1 35例患者的蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖注：橫坐標為M/Z（相對分子量），縱坐標為蛋白質(zhì)的相對豐度，為質(zhì)譜圖

3 討論

近年來，我國胰腺癌的治療水平有了長足的進步，但其整體療效仍不令人滿意，尤其對晚期胰腺癌無有效治療手段。目前正尋找更加有效治療手段及新路徑。伽瑪?shù)吨委熞蚱渚雀?，照射范圍小，正常組織受照劑量低等優(yōu)點，通常為副作用相對小、近期療效較好，且能快速緩解癥狀，在胰腺癌的放射治療中獨樹一幟，是治療胰腺癌可行手段[7-9]。有臨床研究證實，對早期局限期病灶，其治療效果可與手術(shù)相當[10]，但筆者在臨床中也發(fā)現(xiàn)，也有部分患者經(jīng)伽瑪?shù)吨委熀?，效果差，如果尋找一種監(jiān)測手段，能夠提前預(yù)知伽瑪?shù)吨委煹寞熜?，就能有選擇性應(yīng)用該方案進行胰腺癌的治療，提高治療效果，使患者受益。

伽瑪?shù)蹲饔脵C理是通過伽瑪?shù)渡渚€照射，使病變組織細胞的RNA或DNA鏈斷裂，破壞某些輔酶或生物酶，影響線粒體能量系統(tǒng)，進而發(fā)生病灶組織壞死、液化、吸收，取得治療目的[11]。既往研究也證實，細胞受到電離輻射后，通過對DNA損傷，最終的導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，其中包括直接及間接作用。腫瘤細胞抵抗射線殺傷的主要機制之一為DNA損傷修復(fù)（DNA DamageRepair， DDR），如果細胞的DDR系統(tǒng)受到了損害影響，其放射敏感性會明顯增加，目前研究也證實，通過監(jiān)測DNA損傷指標γ-H2AX蛋白表達水平及DNA損傷修復(fù)指p-ATM、Ku80、Rad51等蛋白的表達水平的變化，可以直接了解射線的照射效果[12-13]。目前對放療耐受的機理研究相對少，筆者推測與各種細胞因子及多種未知蛋白質(zhì)參與的多種通路有關(guān)，且與惡性腫瘤的多變異特性和異質(zhì)體特性也有明顯關(guān)系。

SELDI-TOF-MS技術(shù)，簡稱為SELDI技術(shù)，即表面增強激光解析離子飛行時間（time of flight）質(zhì)譜技術(shù)，是近年來發(fā)展起來的新的生物檢測技術(shù)，該技術(shù)利用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)進行研究，成為研究蛋白質(zhì)的有效平臺。由于該技術(shù)可以同時檢測大量未知蛋白質(zhì)的，通過檢測軟件進行分析可得出特異性蛋白的質(zhì)荷比。然后直接對其進行定性、定量分析，可以使指紋圖準確描述和量化[14]。因而，通過該技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)一些特異性蛋白，應(yīng)用疾病早期診斷及治療療效監(jiān)測，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于人體尿液、血清等體液的測定[15]，本研究工作以此為理論指導(dǎo)，通過檢測伽瑪?shù)吨委煹囊认侔┗颊哐?，描述其蛋白質(zhì)組指紋，利用Biomarker Wizard軟件分析伽瑪?shù)吨委熀笥行ЫM和無效組之間有顯著差異的蛋白指紋。

通過利用蛋白質(zhì)芯片的大規(guī)模的檢測，可以從胰腺癌治療患者的血清中找到微量差異蛋白質(zhì)的變化，利用這一組蛋白質(zhì)組成的血清蛋白質(zhì)譜圖的特征變化，為尋找性提供了有效的線索。既往應(yīng)用蛋白指紋技術(shù)通過對肺癌、胃癌、腸癌等對化療耐藥性研究，取得很好預(yù)測效果，裴毅等[16-17]界定了SELDI指紋中M/Z8693的豐度與療效預(yù)測有關(guān)并得出的SELDI指紋M/Z8693，豐度15%的肺腺癌患者為服用吉非替尼治療優(yōu)勢人群，在隨后的研究中也得到進一步證實，目前已應(yīng)用于臨床。本研究共選擇35例患者，其中伽瑪?shù)吨委熡行д?3例，無效者12例，在捕獲的56個蛋白質(zhì)中，大部分無差異，其中僅有3個差異蛋白質(zhì)峰。本研究檢測到M/Z為3337、9234、11 650的蛋白質(zhì)組指紋（豐度）在有效組和無效組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明這3種蛋白質(zhì)對胰腺癌治療效果有著更加重要的意義，同時提示在胰腺癌治療患者中發(fā)生3種蛋白質(zhì)的特征性改變。本研究證實無效組上調(diào)的峰M/Z為3337、11 650，下調(diào)的峰M/Z為9234，在下一步臨床工作中，以此研究作為平臺進行大樣本臨床驗證工作，進一步確定其預(yù)測療效的指標，更好有針對性地進行有效治療。

參考文獻

[1]趙玉沛.胰腺癌的診治現(xiàn)狀與展望[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2013，22（10）：35-36.

[2] Anderson M A， Zolotarevsky E， Cooper K L， et al. Alcohol and tobacco lower the age of presentation in sporadic pancreatic cancer in a dose-dependent manner： a multi center study[J]. Am J Gastroenterol，2012，107（11）：1730-1739.

[3] Jemal A， Siegel R， Xu J， et al. Cancer statistics，2010[J]. CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.

[4]趙玉沛.胰腺癌診斷與治療的現(xiàn)狀與未來[J].中華肝膽外科雜志，2009，15（5）：321-323.

[5] Rajappa P， Margetis K， Wernicke G， et al. Stereotactic radiosurgery plays a critical role in enhancing long-rerm surciwal in a patient with pancreatic cancer metastatic to the brain[J]. Anticancer Res，2013，33（9）：3899-3903.

[6] Trakul N， Koong A C， Chang D T. Stereotactic body radiotherapy in theatment of pancreatic cancer[J]. Semin Radiat Oncol，2014，24（2）：140-147.

[7] Xia T， Li H， Sun Q， et al. Promising clinical outcome of stereotactic body radiation therapy for patients with inoperable Stage Ⅰ/Ⅱ non-small-cell lung cancer[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys，2006，66（1）：117-125.

[8] Pawlieki T， Cotrutz C C. Prostate cancer therapy with stereotaetic body radiationtherapy[J]. Front Radiat Ther Oncol，2007，40 （40）：395-406.

[9]虞曉林，羅衛(wèi)華，李昌林，等.體部伽瑪?shù)吨委熤型砥谝认侔?56例臨床療效觀察[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2011，19（7）：1379-1380.

[10]常冬姝，李晶，夏廷毅.胰腺癌放療劑量模式改變的研究進展[N].中國醫(yī)學(xué)論壇報，2012-09-20.

[11]孫守歧，李宏斌.體部伽瑪?shù)吨委熢砼c臨床應(yīng)用[M].成都：四川大學(xué)出版社，2001：15.

[12]王煥，楊越波，李田，等.ABT737通過延遲官頸癌細胞放射后DNA損傷修復(fù)及誘導(dǎo)凋亡而增敏放療[J].中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），2013，34（1）：83-88.

[13]趙晶，韓蘇夏.吉西他濱對放射相關(guān)DNA損傷修復(fù)的影響[J].西部醫(yī)學(xué)，2014，26（9）：1109-1112.

[14] Xie L， Ma X J， Wei S Q， et al. A report on the study of the estimation of the therapeutic effect in treatment of lung cancer with gefitinib by SELDI[J]. Progress in Modern Biomedicine，2008，8（10）：1498-1500.

[15] Liang Y， Fang M J， Liu C B， et al. Serum proteomic patterns for gastric lesions as revealed by SELDI mass spectrometry[J]. Experimental and Molecular Pathology，2O06，81（2）：176-180.

[16]裴毅，胡守喜，利娜，等.蛋白質(zhì)組指紋作為吉非替尼治療肺癌適應(yīng)癥篩選標準的初步驗證報告[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2009，9（7）：1288-1290.

[17]孫書香，胡守喜，裴毅.吉非替尼治療NSCLC優(yōu)勢人群篩選與蛋白質(zhì)指紋的相關(guān)研究[J].腫瘤研究與臨床，2009，21 （7）：212-213.

Using Protein Fingerprint Technology to Predict the Curative Effect of Gamma K nife Cure Locally Advanced Pancreatic Cancer Therapy Research Report/

ZHANG Yong-liang， GENG Li， YUAN Hui-xin，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（01）：004-008

【Abstract】Objective： Using protein fingerprint technology （SELDI） to predict the efficacy of gamma knife treatment of locally advanced pancreatic cancer research the clinical application value. Method： The 35 patients with pancreatic cancer were selected from February 2010 to October 2014， during the gamma knife treatment from blood stored prior to treatment to -80℃ low temperature refrigerator. Two months after gamma knife treatment，according to the WHO evaluate curative effect of therapeutic effect evaluation standard of solid tumors， and effective and ineffective group enhances the weak cationic CM10 chip combination show， serum specificity protein mass spectra，techniques were compared， using the time of flight mass spectrometry （SELDE-TOF-MS）. Result： In 56 protein peak detect， M/Z 3337， 9234， 11 650， proteomic fingerprint （abundance） which were significantly different between effective and ineffective group （P<0.05）. Compared with the effective group， invalid group raised its peak M/Z 3337， 11 650， its peak of 9234 M/Z. Conclusion： Using SELDI technology can predict the clinical curative effect of gamma knife treatment of ancreatic cancer.

【Key words】The protein fingerprint technology； Pancreatic cancer； Gamma knife

收稿日期：（2015-09-02） （本文編輯：王宇）

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.01.002

通信作者：裴毅

*基金項目：山西省自然基金在研項目（2012011043-3）