Mash-1轉(zhuǎn)染對(duì)胚胎干細(xì)胞在小鼠脊髓損傷部位向神經(jīng)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用①

徐樂(lè)勤，李曉鋒，施杞，王擁軍，周重建

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Mash-1轉(zhuǎn)染對(duì)胚胎干細(xì)胞在小鼠脊髓損傷部位向神經(jīng)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用①

徐樂(lè)勤1,2，李曉鋒2，施杞2，王擁軍2，周重建2

[摘要]目的觀察過(guò)表達(dá)Mash-1基因的胚胎干細(xì)胞在脊髓損傷部位向神經(jīng)細(xì)胞分化的情況及其對(duì)脊髓神經(jīng)損傷的修復(fù)作用。方法采用鼠干細(xì)胞病毒將Mash-1基因轉(zhuǎn)染CE3小鼠胚胎干細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。4周齡雄性SPF級(jí)昆明小鼠鉗夾法建立急性脊髓損傷模型。造模后3 d向脊髓損傷部位注射生理鹽水(模型組, n=12)、CE3胚胎干細(xì)胞(CE3組, n=12)、轉(zhuǎn)染Mash-1基因的CE3小鼠胚胎干細(xì)胞(CE3-Mash-1組, n=12)。術(shù)后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d檢測(cè)小鼠后肢功能評(píng)分。術(shù)后14 d、28 d分別處死小鼠，HE染色觀察脊髓剩余面積；CE3組、CE3-Mash-1組行Oct3/4、nestin、β-tubulinⅢ、神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)免疫熒光染色，觀察移植細(xì)胞的分化。結(jié)果與模型組比較，移植CE3和CE3-Mash-1細(xì)胞的小鼠運(yùn)動(dòng)功能均提高(F>84.471, P<0.05)，脊髓剩余面積增加(F>49.990, P<0.05)。與移植CE3細(xì)胞相比，移植CE3-Mash-1細(xì)胞在損傷的脊髓部位Oct3/4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著減少(t=5.439, P< 0.001)，而nestin (t=-7.536, P<0.001)和β-tubulinⅢ(t=-9.941, P<0.001)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著增加，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(t= 1.701, P=0.120)。結(jié)論過(guò)表達(dá)Mash-1基因可促進(jìn)CE3細(xì)胞在脊髓損傷部位分化成神經(jīng)元，促進(jìn)小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。

[關(guān)鍵詞]脊髓損傷；胚胎干細(xì)胞；基因轉(zhuǎn)染；Mash-1；神經(jīng)分化；小鼠

作者單位：1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)B門中醫(yī)院，福建廈門市361009；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海市200032。作者簡(jiǎn)介：徐樂(lè)勤(1981-)，男，漢族，福建漳州市人，博士，主治醫(yī)師，主要研究方向：中醫(yī)藥促進(jìn)脊髓神經(jīng)損傷修復(fù)。通訊作者：周重建(1953-)，男，漢族，上海市人，博士，教授，主要研究方向：中醫(yī)藥促進(jìn)脊髓神經(jīng)損傷修復(fù)。E-mail: zhouchongjian@hotmail.com。

[本文著錄格式]徐樂(lè)勤，李曉鋒，施杞，等. Mash-1轉(zhuǎn)染對(duì)胚胎干細(xì)胞在小鼠脊髓損傷部位向神經(jīng)細(xì)胞分化的促進(jìn)作用[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐, 2016, 22(1): 46-52.

CITED AS: Xu LQ, Li XF, Shi Q, et al. Effects of transfection of Mash-1gene on neural differentiation of embryonic stem cell in spinal cord injury mice [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016, 22(1): 46-52.

脊髓損傷是一種高致殘率的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，不僅給患者帶來(lái)極大痛苦，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。臨床采用的手術(shù)、藥物和物理康復(fù)等手段都不能完全解決患者的截癱問(wèn)題[1]。

細(xì)胞移植是神經(jīng)再生領(lǐng)域研究最多的治療方法。當(dāng)前可用于移植的細(xì)胞種類有誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞等[2-4]。由于胚胎干細(xì)胞具有無(wú)限增殖和多向分化的能力，具有較大的治療潛能；但其移植后的定向分化、成瘤危險(xiǎn)以及存活數(shù)量少仍然是亟待解決的問(wèn)題[2]?；蚬こ碳夹g(shù)的應(yīng)用可促進(jìn)細(xì)胞的定向分化。Mash-1基因在哺乳動(dòng)物的神經(jīng)發(fā)生過(guò)程中起關(guān)鍵作用[5]。過(guò)表達(dá)Mash-1基因能使小鼠畸胎瘤P19細(xì)胞和胚胎前體皮層細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化[6]。我們前期體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，過(guò)表達(dá)Mash-1基因可促進(jìn)CE3小鼠胚胎干細(xì)胞在體外分化成神經(jīng)細(xì)胞。

本研究進(jìn)一步觀察過(guò)表達(dá)Mash-1基因胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)的分化情況，以其對(duì)脊髓損傷的修復(fù)作用。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物

昆明小鼠，雄性，SPF級(jí)，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，許可證號(hào)SCXK(滬)2007-0005。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.2試劑

DMEM、L-gul、β-mercaptoethanol、胰酶：GIBCO公司。FBS：BIOCHROM公司。LIF細(xì)胞因子：CHEMICON公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光素酶：TAKARA公司。Oct3/4、nestin、β-tubulinⅢ和神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,gFAP)一抗：ABCAM公司。紅色熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗：KPL公司。293T細(xì)胞由上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所提供。CE3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。

1.3過(guò)表達(dá)Mash-1基因CE3穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建及細(xì)胞培養(yǎng)

待293T細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%左右時(shí)，使用脂質(zhì)體2000將鼠干細(xì)胞病毒(murine stem cell virus, MSCV)空載體質(zhì)?；騇SCV-Mash-1轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h和48 h各取病毒上清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

CE3細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入之前收集的病毒上清，4 h后換胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)完全培養(yǎng)液培養(yǎng)；次日同法再感染1次。于末次感染后72 h，采用含潮霉素100 μg/ml的ESC完全培養(yǎng)液篩選陽(yáng)性細(xì)胞。抽提感染MSCV-Mash-1和MSCV空載體的CE3細(xì)胞以及未經(jīng)感染的CE3細(xì)胞的RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)鑒定3種細(xì)胞Mash-1基因表達(dá)情況。

將CE3和CE3-Mash-1細(xì)胞培養(yǎng)于0.2%明膠包被過(guò)的培養(yǎng)皿中，采用ESC完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，每天換液1次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，0.125%胰酶消化，1∶6傳代。

1.4急性脊髓損傷模型建立及分組

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，以氯胺酮0.05 ml/10g腹腔注射麻醉。小鼠俯臥固定，背部備皮，碘伏常規(guī)消毒，背正中切口，分離棘突兩側(cè)椎旁肌，暴露棘突和椎板，以第13肋骨為標(biāo)記，確定T13椎體位置。切斷棘上和棘間韌帶，用彎眼科剪從兩側(cè)椎板根部剪斷椎板，暴露T13節(jié)段脊髓。Dumont 5號(hào)鑷前后方向夾持脊髓15 s。無(wú)菌紗布輕輕壓迫止血，縫合封閉皮下筋膜和皮膚，關(guān)閉切口[7]。次日將造模后的動(dòng)物分為模型組、CE3組、CE3-Mash-1組，每組12只。另12只為假手術(shù)組，僅暴露脊髓，不予損傷。術(shù)后每天腹腔注射青霉素50,000 U/kg，共3 d；擠壓膀胱輔助排尿至自身排尿反射恢復(fù)。

1.5移植細(xì)胞的制備和注射

常規(guī)培養(yǎng)和擴(kuò)增CE3、CE3-Mash-1細(xì)胞。移植前0.125%胰酶消化，終止后吹打成單個(gè)細(xì)胞懸液，離心，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)洗2次，計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)確定細(xì)胞總數(shù)；生理鹽水重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/μl，冰上保存。

造模后3 d，小鼠以氯胺酮0.05 ml/10g腹腔注射麻醉，俯臥固定，碘伏常規(guī)消毒，拆除背部縫線，直接暴露損傷節(jié)段。用10 μl微量進(jìn)樣器抽取細(xì)胞懸液2 μl，注射到損傷部位中心：垂直進(jìn)針，深1.5 mm，緩慢注射，注射后留針2 min。

CE3組和CE3-Mash-1組分別注射CE3、CE3-Mash-1細(xì)胞懸液，假手術(shù)組和模型組分別注射等量生理鹽水。

1.6功能評(píng)定

各組分別于術(shù)后1 d、7 d、14 d、21 d、28 d行小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能量表(Basso Mouse Scale, BMS)評(píng)分[8]。BMS通過(guò)觀察小鼠后肢主動(dòng)彎曲、著地，行走時(shí)軀干的平衡以及尾巴的活動(dòng)情況，分為10個(gè)等級(jí)，0分為關(guān)節(jié)沒(méi)有任何活動(dòng)，9分為各關(guān)節(jié)活動(dòng)均正常。

1.7取材與染色

分別于造模后14 d和28 d，每組取6只小鼠，10%水合氯醛1 ml腹腔注射處死。咬骨鉗咬除椎板，暴露脊髓。切除損傷部位上下各0.5 cm脊髓段。脊髓標(biāo)本4%多聚甲醛中固定16 h后，棄去多聚甲醛，清水沖洗，置15%蔗糖溶液中脫水24 h，25%蔗糖溶液再脫水24 h。去除蔗糖溶液，-80℃冰箱保存。

冰箱保存的脊髓組織置于切片機(jī)冰凍變硬，Oct膠包埋，切片，片厚5 μm。防脫載玻片粘取組織，室溫通風(fēng)晾干1 d，-20℃冰箱保存。

1.7.1HE染色

冰箱中取出切片，室溫10 min；置于清水中5 min，蘇木素2 min，清水沖洗；0.04%鹽酸酒精分化5 s，清水沖洗；2%氨水返藍(lán)10 min，清水沖洗；伊紅2 min，清水沖洗；85%乙醇2 min，95%乙醇2 min，100%乙醇2min；二甲苯Ⅰ2 min，二甲苯Ⅱ2 min，二甲苯Ⅲ2 min；中性樹膠封片；60℃烤箱過(guò)夜；相差顯微鏡觀察。IPP 6.0軟件橫切面下測(cè)量面積。

1.7.2免疫熒光染色

冰箱中取出切片，PBS浸泡5 min，置于濕盒中，紙巾擦除周圍水分，蛋白酶K消化10 min修復(fù)抗原，PBS洗2 min，共3次；0.5% PBST通透20 min，PBS洗2 min，共3次；5% BSA封閉20 min；14 d標(biāo)本加Oct 3/4、nestin，28 d標(biāo)本加β- tubulinⅢ、GFAP一抗(均1∶500)，4℃過(guò)夜。37℃恒溫箱孵育1 h，PBS洗5 min，共3次；加紅色熒光標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃避光孵育1 h，PBS洗5min，共3次，加入DAPI 1 μg/ml室溫避光孵育10 min，PBS洗2 min，共3次，熒光顯微鏡觀察。陰性對(duì)照用PBS代替一抗。計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1功能評(píng)定

脊髓損傷小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯受損，爬行時(shí)出現(xiàn)拖拽后肢現(xiàn)象。術(shù)后1 d，各損傷小鼠評(píng)分值為0，假手術(shù)組功能無(wú)明顯下降。

術(shù)后7 d、14 d、21 d、28 d，即注射后4 d、11 d、18 d、25 d，模型組、CE3組、CE3-Mash-1組評(píng)分均有提高，其中CE3組和CE3-Mash-1組評(píng)分高于模型組(P<0.05)，CE3組與CE3-Mash-1組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；術(shù)后28 d，模型組BMS評(píng)分無(wú)明顯改善，而CE3組和CE3- Mash- 1組評(píng)分改善，CE3-Mash-1組評(píng)分最高。見表1。

2.2HE染色

損傷14 d和28 d時(shí)，模型組脊髓剩余面積明顯減少。CE3組和CE3-Mash-1組脊髓剩余均明顯大于模型組(P<0.01)；假手術(shù)組、CE3組和CE3-Mash-1組間脊髓剩余面積無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見圖1、表2。

表1　各組BMS評(píng)分比較

圖1　各組脊髓橫切面(HE染色, bar=500 μm)

表2　各組脊髓橫切面剩余面積(105μm2)

2.3免疫熒光染色

CE3組和CE3-Mash-1組損傷部位均可觀察到移植細(xì)胞。術(shù)后14 d，CE3組Oct3/4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于CE3-Mash-1組(P<0.01)，nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯少于CE3-Mash-1組(P<0.01)。見圖2、表3。術(shù)后28 d，CE3-Mash-1組β-tubulinⅢ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于CE3 組(P<0.01)。GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)兩組間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見圖3、表3。

表3　CE3組和CE3-Mash-1組表面蛋白標(biāo)記的表達(dá)(%)

圖2　CE3組和CE3-Mash-1組Oct3/4和nestin表達(dá)(免疫熒光染色, bar=50 μm)

圖3　CE3組和CE3-Mash-1組β-tubulinⅢ和GFAP表達(dá)(免疫熒光染色, bar=50 μm)

3　討論

脊髓損傷的主要造模方法有重物打擊、半側(cè)脊髓切斷、鉗夾損傷、牽拉損傷、光化學(xué)損傷、缺血損傷等[9]。鉗夾法能較好保持硬脊膜的完整性，該方法造成的神經(jīng)功能改變與臨床上挫傷型脊髓損傷的病理改變非常相似。該方法由Rivlin報(bào)道[10]；Fehlings等[11]和李剛等[12-13]驗(yàn)證了該方法的可重復(fù)性，認(rèn)為該方法復(fù)制的脊髓損傷能較好模擬臨床上的脊髓損傷。該模型引起脊髓損傷程度主要取決于夾持力量的大小和夾持時(shí)間的長(zhǎng)短。此類動(dòng)物模型多為閉合性損傷，方便進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定和脊髓病理檢測(cè)。2008年P(guān)lemel等提出小鼠鉗夾脊髓模型[7]。該模型采用不同間隙Dumont 5號(hào)鑷夾持脊髓15 s造成不同程度脊髓損傷，被廣泛應(yīng)用于脊髓損傷治療和機(jī)理的研究中[14-16]。該方法復(fù)制的脊髓損傷模型死亡率25%左右，是一種成功率相對(duì)較高、造模簡(jiǎn)便的急性脊髓損傷模型，動(dòng)物間損傷程度差異小、一致性強(qiáng)、可重復(fù)性好。

本研究采用間隙為0.25 mm的Dumont 5號(hào)鑷，造模后小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能明顯障礙，脊髓病理染色顯示脊髓橫切面剩余面積減少，損傷局部組織結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞排列紊亂。

細(xì)胞移植后，移植的細(xì)胞可分化成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞，建立新的神經(jīng)連接，保護(hù)或形成新的髓鞘，從而改善神經(jīng)功能。McDonald等將小鼠的ESC誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)前體細(xì)胞后注射到22只損傷9 d的成年大鼠脊髓損傷部位，經(jīng)過(guò)數(shù)周觀察，發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞在大鼠受損脊髓部位進(jìn)一步分化，形成少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元；移植的細(xì)胞從注射部位向兩端遷移8 mm；步態(tài)分析儀分析發(fā)現(xiàn)，移植組比對(duì)照組(移植成年大鼠大腦皮質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞)的后肢功能有更好恢復(fù)[17]。另有報(bào)道，移植ESC來(lái)源的前體細(xì)胞可減少膠質(zhì)瘢痕形成[18]，促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后脫髓鞘的神經(jīng)纖維髓鞘再生[19-20]，產(chǎn)生新的郎飛結(jié)，減少脊髓損傷面積的丟失[21]，使傳導(dǎo)通路部分或全部恢復(fù)，促進(jìn)動(dòng)物前后肢的運(yùn)動(dòng)功能[22-23]。

Oct3/4是ESC細(xì)胞全能性標(biāo)記蛋白之一，陽(yáng)性表示移植的CE3細(xì)胞處于未分化狀態(tài)；nestin是神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記蛋白，β-tubulinⅢ是神經(jīng)元標(biāo)記蛋白，GFAP則為膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白。

本研究顯示，移植轉(zhuǎn)染Mash-1基因的CE3細(xì)胞，在脊髓損傷部位能更多分化成nestin陽(yáng)性的神經(jīng)干細(xì)胞和β-tubulinⅢ陽(yáng)性的神經(jīng)元，而表達(dá)Oct3/4細(xì)胞數(shù)明顯減少，表明Mash-1基因修飾可促進(jìn)CE3細(xì)胞在損傷脊髓部位分化成神經(jīng)元。運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯示，術(shù)后14 d，CE3組、CE3-Mash-1組后肢功能評(píng)分優(yōu)于模型組，但兩組間無(wú)顯著性差異。CE3組21 d時(shí)1只小鼠功能評(píng)分惡化，并持續(xù)到28 d。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，我們對(duì)這只小鼠進(jìn)行病理檢查，移植細(xì)胞在損傷的局部聚集成團(tuán)。

Bottai等直接移植未分化的ESC到損傷的脊髓部位，形成不對(duì)稱的克隆[24]；Howard等將ESC進(jìn)行抗凋亡基因Bcl-2修飾后移植到大鼠的脊髓損傷部位，6周后在移植部位發(fā)現(xiàn)未分化的細(xì)胞團(tuán)塊[25]。提示直接移植未經(jīng)合理修飾或未分化的ESC存在形成腫瘤的危險(xiǎn)。移植經(jīng)過(guò)Mash-1基因修飾的CE3細(xì)胞不但可以促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)，也未發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞在體內(nèi)形成團(tuán)塊。

綜上所述，Mash-1基因轉(zhuǎn)染小鼠CE3胚胎干細(xì)胞，可促進(jìn)CE3細(xì)胞在脊髓損傷部位分化成神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)脊髓損傷后小鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)，可避免形成腫瘤的危險(xiǎn)。

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Effects of Transfection of Mash-1gene on Neural Differentiation of Embryonic Stem Cell in Spinal Cord Injury Mice

XU Le-qin1,2, LI Xiao-feng2, SHI Qi2, WANG Yong-jun2, ZHOU Chong-jian2
1. Xiamen Hospital of Traditional Chinese Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Xiamen, Fujian 361009, China; 2. Institute of Spine, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
Correspondence to ZHOU Chong-jian. E-mail: zhouchongjian@hotmail.com

Abstract:Objective To investigate the effects of overexpression of Mash-1gene on functional recovery and neural differentiation of embryonic stem cells in spinal cord injury mice. Methods CE3 cell line with overexpression of Mash-1gene wasgenerated with murine stem cell virus. Spinal cord injury model was established with forceps compression in 4-week-old KM mice. Normal saline (modelgroup, n= 12), CE3 cells with or without overexpression Mash-1gene (CE3-Mash-1 and CE3groups, n=12 respectively) were transplanted into the areas of injury 3 days after injury. They were assessed with the Basso Mouse Scale (BMS) 1, 7, 14, 21, and 28 days after injury. 6 mice from eachgroup were sacrificed 14 and 28 days after injury respectively. The spinal cord area remained were observed with HE stained, and the expression of Oct3/4, nestin,β-tubulin III andglial fibrillary acidic protein (GFAP) were detected with immunofluorescence in the injured spinal cord in the CE3 and CE3-Mash-1groups. Results The score of BMS significantly improved in CE3 and CE3-Mash-1groups compared with that of the modelgroup (F>84.471, P<0.05), with the more area of spinal cord remained (F>49.990, P<0.05). There were less Oct3/4 positive cells in the CE3-Mash-1group than CE3group (t=5.439, P<0.001), with more nestin (t=-7.536, P<0.001) and β-tubulin III (t=-9.941, P<0.001) positive cells. However, there was no significant difference ingFAP positive cells between CE3-Mash-1 and CE3groups (t=1.701, P>0.05). Conclusion Overexpression of Mash-1gene promotes CE3 cells to differentiate into neurons in spinal cord injury mice, and improve the motor function recovery.

Key words:spinal cord injury; embryonic stem cell;gene transfection; Mash-1; neural differentiation; mice

(收稿日期：2015-10-11修回日期：2015-11-12)

[中圖分類號(hào)]book=47,ebook=52 R651.2

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1006-9771(2016)01-0046-07

基金項(xiàng)目：1.上海市教委創(chuàng)新基金項(xiàng)目(No.08-YZ56)；2.國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(No.30973760)；3.上海市科委非政府國(guó)際合作項(xiàng)目(No.10410702800)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2016.01.009