脊髓背角大麻素受體2介導(dǎo)CP55940對(duì)CCI大鼠的鎮(zhèn)痛作用

孫　濤，楊舒蕾，龍景東，曾俊偉,2，陳遠(yuǎn)壽，田　虹，劉曉紅,2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，貴州 遵義　563099；2.貴州省麻醉與器官功能保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義　563099)

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

脊髓背角大麻素受體2介導(dǎo)CP55940對(duì)CCI大鼠的鎮(zhèn)痛作用

孫濤1，楊舒蕾1，龍景東1，曾俊偉1,2，陳遠(yuǎn)壽1，田虹1，劉曉紅1,2

(1.遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 生理學(xué)教研室，貴州 遵義563099；2.貴州省麻醉與器官功能保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察脊髓背角大麻素受體2(CB2R)是否參與大麻素類藥物CP55940對(duì)慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷(CCI)所致神經(jīng)病理性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，并初步探討其機(jī)制。方法 成年SD大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、CCI組(鞘內(nèi)注射DMSO生理鹽水)、CP55940+CCI組(鞘內(nèi)注射0.05 mg/kg CP55940)、AM630+CP55940+CCI組(鞘內(nèi)注射10-8mol/L AM630，20 min后再給予0.05 mg/kg CP55940)。各組大鼠均于鞘內(nèi)置管5 d后行CCI術(shù)，術(shù)后連續(xù)14 d鞘內(nèi)注射給藥，每天1次；于CCI術(shù)前1 d，術(shù)后第1、3、5、7、10、14 天鞘內(nèi)給藥1 h后測(cè)定熱縮足潛伏期(TWL)。分別于CCI術(shù)后第7天和第14天處死大鼠，取術(shù)側(cè)L4~L6脊髓背角，采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)脊髓背角CB2R及絲裂原活化蛋白激酶家族中p38(p38 MAPK)表達(dá)情況。結(jié)果 大鼠CCI術(shù)后即形成穩(wěn)定的熱痛敏，TWL明顯縮短；鞘內(nèi)給予非選擇性CB受體激動(dòng)劑CP55940(0.05 mg/kg)可明顯延長(zhǎng)CCI大鼠TWL(P<0.05)；選擇性CB2受體拮抗劑AM630(10-8mol/L)可部分阻斷CP55940的鎮(zhèn)痛效果(P<0.05)。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CCI術(shù)可導(dǎo)致術(shù)側(cè)脊髓背角CB2R、p38表達(dá)增加(P<0.01)；鞘內(nèi)給予CP55940可誘導(dǎo)CCI所致的CB2R表達(dá)進(jìn)一步增加(P<0.01)，但明顯降低CCI所致的p38表達(dá)增加(P<0.01)；預(yù)先鞘內(nèi)注射CB2R拮抗劑AM630可阻斷CP55940對(duì)CB2R及p38表達(dá)的影響(P<0.01)。結(jié)論 鞘內(nèi)給予大麻素類藥物CP55940對(duì)CCI所致的神經(jīng)痛具有良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，CB2R通過可能抑制脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞p38的活性參與了CP55940的鎮(zhèn)痛作用。

[關(guān)鍵詞]神經(jīng)病理性疼痛；CB2受體；脊髓背角；大麻素；P38絲裂原活化蛋白激酶

大麻用于鎮(zhèn)痛的記載可追溯到數(shù)百年前，近年研究逐漸認(rèn)識(shí)到在哺乳動(dòng)物體內(nèi)存在內(nèi)源性大麻素遞質(zhì)系統(tǒng)，中樞和周圍神經(jīng)組織廣泛表達(dá)的CB1受體(Cannabinoid receptor 1, CB1R)和CB2受體(Cannabinoid receptor 2, CB2R)介導(dǎo)了大麻類物質(zhì)的作用[1-3]。研究表明，在炎性痛、癌痛或神經(jīng)病理性疼痛模型，局部或全身應(yīng)用CB2R激動(dòng)劑均能顯著減輕熱痛敏或機(jī)械痛敏，這充分說明CB2R參與了大麻素類藥物的鎮(zhèn)痛作用[4-6]。

脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活參與了中樞痛覺過敏的形成，是病理性疼痛發(fā)生和持續(xù)的關(guān)鍵因素[7-8]。大麻素CB2受體選擇性表達(dá)于脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞[9]，但脊髓背角CB2R是否介導(dǎo)大麻素鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其相關(guān)的機(jī)制，目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過制備慢性坐骨神經(jīng)縮窄性損傷(chronic constriction injury, CCI)模型，鞘內(nèi)給予非選擇性大麻素受體激動(dòng)劑CP55940以及特異性CB2受體拮抗劑AM630，觀察CB2R是否介導(dǎo)CP55940的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，并初步探討其鎮(zhèn)痛機(jī)制。

1材料與方法

1.1主要試劑和器材CP55940、AM630(Sigma，美國)；PE-10導(dǎo)管(美國健康醫(yī)療儀器國際公司)；BME-410C型自動(dòng)熱痛刺激儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所)；兔抗CB2多克隆抗體(SC-25494)、兔抗p38α多克隆抗體(SC-535)購自美國Santa公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組體重200～250 g雄性SD大鼠42只由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào)SCXK[渝]2007-0005)，分為4組：①對(duì)照組(假手術(shù)組，n=6)；②CCI 組(鞘內(nèi)注射DMSO生理鹽水，n=12)；③ CP55940+CCI組(鞘內(nèi)注射0.05 mg/kg，n=12)；④AM630+CP55940+CCI組(鞘內(nèi)先注射10-8mol/L AM630，20 min后再給予0.05 mg/kg CP55940，n=12)。對(duì)照組大鼠僅游離右側(cè)坐骨神經(jīng)，未做其他處理。其余各組大鼠在鞘內(nèi)置管5 d后行CCI術(shù)，術(shù)后分別鞘內(nèi)注射DMSO生理鹽水、CP55940和AM630。 CP55940和AM630用DMSO原液溶解，隨后用生理鹽水稀釋至10-8mol/L，對(duì)照組鞘內(nèi)注射DMSO生理鹽水。

1.2.2鞘內(nèi)置管及CCI模型制作參照龍景東等[10]的方法。

1.2.3熱痛閾測(cè)定參照龍景東等[10]的方法。

1.2.4免疫印跡技術(shù)檢測(cè)脊髓背角CB2R、p38蛋白表達(dá)參照田虹等[11]的方法，CCI術(shù)后第7、14天處死大鼠(CCI術(shù)后第7天每組6只，第14天每組6只)，取CCI大鼠右側(cè)L4～L6的脊髓背角，提取各組大鼠脊髓背角總蛋白，行SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜用6%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入兔抗CB2R多克隆抗體(1∶250)、兔抗p38α多克隆抗體(1∶250)，同時(shí)加入小鼠抗β-actin單抗(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜。PBS洗膜后，加入抗兔HRP-IgG(1∶2 500)和抗鼠HRP-IgG(1∶2 500)，室溫放置1 h。加入化學(xué)發(fā)光顯色試劑，X射線曝光顯影，掃描分析軟件(Labworks TM Analysis Software，美國)分析數(shù)據(jù)，蛋白表達(dá)水平用每個(gè)條帶的積分光密度(IOD)值與其相對(duì)應(yīng)β-actin IOD值之比表示(β- actin為內(nèi)參照)。

2結(jié)果

2.1鞘內(nèi)注射CP55940及AM630對(duì)CCI大鼠熱痛敏的影響

2.1.1CP55940對(duì)CCI大鼠熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL)的影響與對(duì)照組相比，神經(jīng)痛模型大鼠CCI術(shù)后第1天，術(shù)側(cè)下肢即對(duì)熱刺激敏感，TWL明顯降低(P<0.05)，到術(shù)后14 d，熱痛敏仍持續(xù)存在。鞘內(nèi)給予非選擇性大麻素受體激動(dòng)劑CP55940(0.05 mg/kg)可明顯升高CCI術(shù)所致的TWL降低(P<0.05，見圖1)，對(duì)神經(jīng)痛大鼠熱痛敏有良好的治療作用。而鞘內(nèi)給予DMSO生理鹽水對(duì)神經(jīng)痛熱痛敏無明顯改善。

2.1.2CB2R拮抗劑AM630介導(dǎo)CP55940的鎮(zhèn)痛作用AM630為特異性CB2R拮抗劑，預(yù)先鞘內(nèi)給予AM630(10-8mol/L，20 min)可顯著抑制CP55940的效應(yīng)(P<0.05，見圖1)，但不能完全阻斷其作用。

*：P<0.05，與control相比；#：P<0.05，與CCI相比；+：P<0.05，與CP55940+CCI相比。 圖1　鞘內(nèi)注射CP55940、AM630對(duì)CCI大鼠TWL的影響

2.2脊髓背角CB2受體表達(dá)變化對(duì)照組大鼠脊髓背角CB2R蛋白呈微量表達(dá)；與對(duì)照組相比，CCI模型大鼠在術(shù)后7、14 d CB2R蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.01)，尤其以14 d更為明顯；鞘內(nèi)給予非選擇性大麻素受體激動(dòng)劑CP55940(0.05 mg/kg)可誘導(dǎo)CCI大鼠CB2R表達(dá)進(jìn)一步增高(P<0.01)；而CB2R拮抗劑AM630可明顯降低CP55940誘導(dǎo)的CCI大鼠CB2R表達(dá)增高(P<0.01，見圖2)。

A：CB2R蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果；B：CB2R蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析；**：P<0.01，與control相比；##：P<0.01，與CCI組相比；++：P<0.01，與CP55940+CCI相比。　　圖2　鞘內(nèi)注射CP55940、AM630對(duì)CCI大鼠脊髓背角CB2R表達(dá)的影響

2.3脊髓背角p38表達(dá)的變化對(duì)照組大鼠脊髓背角p38呈微量表達(dá)；與對(duì)照組相比，CCI大鼠術(shù)側(cè)L4~L6節(jié)段的脊髓背角p38蛋白在術(shù)后第7、14天表達(dá)明顯增加(P<0.01)；鞘內(nèi)注射CP55940可明顯降低CCI所致的脊髓背角p38表達(dá)增加；CP55940降低脊髓背角p38表達(dá)的效應(yīng)可被選擇性CB2R拮抗劑AM630阻斷(P<0.01，見圖3)。

A：p38蛋白免疫印跡檢測(cè)結(jié)果；B：p38蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)分析；**：P<0.01，與control相比；##：P<0.01，與CCI組相比；++：P<0.01，與CP55940+CCI相比。　　圖3　鞘內(nèi)注射CP55940、AM630對(duì)CCI大鼠脊髓背角p38表達(dá)的影響

3討論

脊髓背角是機(jī)體調(diào)制或整合傷害性信息的重要位點(diǎn)。大麻素CB2受體選擇性表達(dá)于脊髓背角的星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞[9]，但脊髓背角CB2R是否介導(dǎo)大麻素的鎮(zhèn)痛作用及其相關(guān)機(jī)制，目前尚不清楚。既往研究顯示，在各種炎性痛、癌痛和神經(jīng)痛模型中，局部或全身應(yīng)用大麻素受體激動(dòng)劑均可產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛效果[12]。本實(shí)驗(yàn)鞘內(nèi)注射非選擇性大麻素受體激動(dòng)劑CP55940明顯延長(zhǎng)了CCI大鼠的熱縮足反射潛伏期，表明鞘內(nèi)給予CP55940對(duì)慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎所致的神經(jīng)痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用。而預(yù)先鞘內(nèi)給予CB2R特異性拮抗劑AM630可明顯抑制CP55940的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，說明CB2R介導(dǎo)了CP55940的鎮(zhèn)痛作用。CB1R、CB2R均表達(dá)于脊髓背角，其中CB1R主要表達(dá)于背角淺層抑制性中間神經(jīng)元[13]，CB2R表達(dá)于膠質(zhì)細(xì)胞[6]。本課題組以往的研究顯示，CB1R拮抗劑AM251可顯著抑制、但又不能完全阻斷鞘內(nèi)注射CP55940對(duì)CCI大鼠的鎮(zhèn)痛效應(yīng)[10]。由此可見，鞘內(nèi)注射CP55940對(duì)CCI大鼠的鎮(zhèn)痛作用可能由脊髓背角CB1R、CB2R共同介導(dǎo)。

本研究免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示，鞘內(nèi)給予CP55940可誘導(dǎo)CCI大鼠CB2R表達(dá)明顯增高，而CB2R拮抗劑AM630可顯著降低CP55940誘導(dǎo)的CB2R表達(dá)增高。這說明脊髓背角CB2受體表達(dá)變化與大麻素類藥物鎮(zhèn)痛效應(yīng)密切相關(guān)，CB2R表達(dá)上調(diào)介導(dǎo)了大麻素類藥物的鎮(zhèn)痛效應(yīng)；而CB2受體拮抗劑AM630通過抑制CB2R的表達(dá)，顯著減弱CP55940的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

既往研究表明，絲裂原活化蛋白激酶家族中的p38在神經(jīng)病理性疼痛的產(chǎn)生和維持中發(fā)揮重要作用，p38的激活可產(chǎn)生大量的炎癥因子，包括致炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1等， 這些炎癥因子繼而促進(jìn)病理性疼痛的產(chǎn)生與維持[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，CCI術(shù)可導(dǎo)致神經(jīng)損傷大鼠術(shù)側(cè)脊髓背角p38蛋白表達(dá)增加，而鞘內(nèi)給予CP55940可顯著降低CCI所致的p38表達(dá)升高，CP55940降低脊髓背角p38表達(dá)的效應(yīng)可被選擇性CB2R拮抗劑AM630阻斷。這說明CP55940降低CCI大鼠脊髓背角p38表達(dá)的效應(yīng)是由CB2R介導(dǎo)，CP55940的鎮(zhèn)痛效應(yīng)可能與其激活脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞CB2R，繼而抑制膠質(zhì)細(xì)胞p38活性密切相關(guān)。Landry等[6]的研究也顯示L-5脊神經(jīng)切斷所致的脊髓背角MKP-1 和MKP-3(MAPK磷酸酶，為p38MAPK的主要調(diào)節(jié)因子)表達(dá)的降低可被CB2R激動(dòng)劑JWH015逆轉(zhuǎn)，從而抑制神經(jīng)損傷大鼠p38MAPK的磷酸化。

Ji等[16]和Tsuda等[17]報(bào)道在外周神經(jīng)損傷引起的病理性疼痛模型中，脊髓背角p38的磷酸化僅局限于小膠質(zhì)細(xì)胞，而在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞p38不被激活，并且鞘內(nèi)給予p38抑制劑可減輕神經(jīng)痛癥狀。本實(shí)驗(yàn)CCI所致的p38表達(dá)增加究竟發(fā)生于小膠質(zhì)細(xì)胞抑或星形膠質(zhì)細(xì)胞，有待于進(jìn)一步證實(shí)。

本研究結(jié)果顯示，脊髓背角CB2R在外周神經(jīng)損傷所致的病理性疼痛中發(fā)揮重要作用，CB2受體可能通過抑制脊髓背角膠質(zhì)細(xì)胞的p38活性參與了大麻素類藥物的鎮(zhèn)痛作用。

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[收稿2015-11-19;修回2015-12-30]

(編輯：王靜)

CB2receptors in dorsal spinal horn are involved in analgesia of CP55940 on neuropathic rats with chronic constriction injury

SunTao1,YangShulei1,LongJingdong1,ZengJunwei1,2,ChenYuanshou1,TianHong1,LiuXiaohong1,2

(1.Department of Physiology,School of Basic Medical Sciences，Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China；2.Key Lab of Anesthesia and Organ Protection of Guizhou, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective The aim of this study is to examine whether CB2receptor is involved in analgesia of cannabinoids on neuropathic rats with chronic constriction injury (CCI) of the sciatic nerve. Methods Healthy adult SD rats were randomly divided into control group, CCI group (intrathecal DMSO saline), CP55940+CCI group (CP55940 0.05 mg/kg) and AM630+CP55940+CCI group (AM630 10-8mol/l; CP55940 0.05 mg/kg). SD rats in all groups were intrathecally cathetered at 5 d before CCI operation. All rats were tested for heat hyperalgesia of the plantar surface of the hindpaw 1 day before surgery and 1, 3, 5, 7, 10 and 14 d after surgery. AM630, CP55940 and DMSO saline were intrathecally administered once a day for 14 consecutive days after CCI operation. The values of thermal withdrawal latency (TWL) were examined at 1h after intrathecal injection. The expression of CB2receptors and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) were detected by western blot assay. Results TWL in CCI group were significantly lower than those in sham group on post-operative day (P<0.05). Intrathecal administration of CP55940 (cannabinoid receptor agonist, 0.05 mg/kg) markedly suppressed the decrease in TWL after nerve injury (P<0.05). Intrathecal administration of AM630 (CB2receptor antagonist, 10-8mol/l) markedly suppressed the analgesic effect of CP55940. The immunoblotting assay showed that the expression of CB2receptor and p38 were markedly enhanced in the ipsilateral dorsal horn on days 7 (P<0.01) and 14(P<0.01) after nerve injury. Intrathecal administration of CP55940 further enhanced the expression of CB2receptor after CCI (P<0.01), but markedly suppressed the increased expression of p38 after CCI (P<0.01). Intrathecal administration of AM630 blocked the effect of CP55940 on expression of CB2receptors (P<0.01) and p38 (P<0.01). Conclusion These data indicate that intrathecal administration of cannabinoid receptor agonist CP55940 provides postoperative analgesia effectively on neuropathic rats. CB2receptor activation and the following inhibition of p38 are involved in analgetic effect of CP55940.

[Key words]neuropathic pain；CB2receptor; spinal cord；Cannabinoids；p38 mitogen-activated protein kinases

[中圖法分類號(hào)]R329.27; R338.1; R977.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1000-2715(2016)01-0006-04

[通信作者]劉曉紅，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：痛覺的神經(jīng)化學(xué)機(jī)制，E-mail:lxh680718@aliyun.com。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：31360253)；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：黔科合J[2008]2314)。