眼組織與死亡時間推斷

郭　煒金洪年張鈺勤鄭吉龍

（1.廣東省潮州市公安局刑警支隊(duì)，廣東 潮州521000；2.廣東省公安廳刑事技術(shù)中心，廣東 廣州510050；3.中國刑警學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，遼寧 沈陽110035）

眼組織與死亡時間推斷

郭煒1金洪年2張鈺勤1鄭吉龍3

（1.廣東省潮州市公安局刑警支隊(duì)，廣東 潮州521000；2.廣東省公安廳刑事技術(shù)中心，廣東 廣州510050；3.中國刑警學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，遼寧 沈陽110035）

眼組織用于推斷死亡時間一直是國內(nèi)外法醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)之一。從肉眼宏觀到鏡下微觀，從細(xì)胞水平到分子水平，不斷有新的研究成果和報(bào)告出現(xiàn)。大量研究結(jié)果表明隨著死后經(jīng)過時間的延長，眼角膜、視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)以及玻璃體液內(nèi)的離子、酶等成分均出現(xiàn)時間依賴性的變化，并與死亡時間高度相關(guān)，可用于死亡時間推斷。

法醫(yī)病理學(xué)死亡時間眼組織

死亡時間（postmortem interval，PMI）在法醫(yī)學(xué)上是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時距死亡發(fā)生時的時間間隔。PMI的推斷一直是法醫(yī)病理學(xué)的重要且復(fù)雜的研究課題之一。法醫(yī)工作者推斷PMI的傳統(tǒng)方法主要根據(jù)尸體現(xiàn)象，再結(jié)合各自的主觀經(jīng)驗(yàn)，但是由于受到眾多因素的影響，包括個體自身因素和外界環(huán)境因素，存在一定的局限性。眼組織由于受到眼眶及周圍外膜的包裹及保護(hù)，受外界環(huán)境的影響較小，因此20世紀(jì)60年代，針對眼組織的研究成為法醫(yī)學(xué)者用于推斷PMI的對象。

脊椎動物的眼組織由纖維膜、血管膜、視網(wǎng)膜及其內(nèi)容物等構(gòu)成。眼球在構(gòu)造分眼球壁和內(nèi)容物兩部分。眼球壁由外向內(nèi)順次為纖維膜（角膜、鞏膜）、血管膜（虹膜、睫狀體、脈絡(luò)膜）和視網(wǎng)膜3層。眼內(nèi)容物包括晶狀體、眼房水和玻璃體。眾多研究結(jié)果證實(shí)，眼角膜、視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及玻璃體液內(nèi)的離子、酶類成分等在死后的一定時間內(nèi)均出現(xiàn)規(guī)律性的變化，與PMI具有高度相關(guān)性，可用于PMI的推斷。

1　眼角膜與PMI推斷

長期以來，角膜混濁是法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中用于推斷早期PMI的指標(biāo)，角膜混濁程度和死后角膜形態(tài)學(xué)的改變存在一定的規(guī)律性［1］。法醫(yī)學(xué)者根據(jù)個體死后角膜的混濁度（Turbidity of cornea，TC）來大致推斷死亡時間，由于一定程度上帶有主觀性，誤差多在12h左右［2，3］。加入角膜形態(tài)學(xué)變化與PMI的關(guān)系文獻(xiàn)研究結(jié)果。

1.1角膜厚度與PMI的關(guān)系

角膜正常厚度和透明度依靠角膜內(nèi)皮細(xì)胞膜對水的主動轉(zhuǎn)運(yùn)功能和把房水與角膜基質(zhì)隔開的機(jī)械性屏障作用來維持［4］。個體死亡以后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞的死亡引起水分進(jìn)入到角膜基質(zhì)層并進(jìn)一步與粘多糖發(fā)生水合作用，導(dǎo)致角膜的厚度增加、透明度下降，在一定時間范圍內(nèi)，死后經(jīng)過時間越長，厚度越大且越混濁［5-7］。Petit等和孟祥志等應(yīng)用解剖學(xué)方法和光學(xué)顯微鏡方法發(fā)現(xiàn)角膜厚度隨PMI的延長而增加，兩者呈線性關(guān)系。李曉娜等用角膜切片并結(jié)合圖像分析軟件發(fā)現(xiàn)角膜基質(zhì)層厚度和全角膜厚度與死亡時間之間呈較好的線性關(guān)系，證實(shí)應(yīng)用角膜結(jié)構(gòu)厚度圖像分析推斷PMI具有一定可行性和客觀性。

1.2角膜內(nèi)皮細(xì)胞與PMI的關(guān)系

角膜內(nèi)皮細(xì)胞位于角膜五層組織結(jié)構(gòu)中的最內(nèi)層，為單層排列，六邊形結(jié)構(gòu)，受外界環(huán)境因素影響較小，而且細(xì)胞密度無性別、種族差異［8］。

1.2.1角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性率與PMI的關(guān)系

研究證實(shí)，個體死亡后，角膜內(nèi)皮細(xì)胞隨著死亡時間的延長逐漸死亡。應(yīng)用茜素紅—曲利苯蘭聯(lián)合染色染，在光學(xué)顯微鏡下可清晰地識別角膜內(nèi)皮活細(xì)胞和失活細(xì)胞，從而反映角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性的指標(biāo)之一。

宋國林等在1995年對已知PMI的500只非正常死亡者的眼角膜，行茜素紅-曲利苯蘭聯(lián)合染色，觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性（單位面積內(nèi)的活性內(nèi)皮細(xì)胞所占細(xì)胞總數(shù)的比例，英文全稱ECLR），發(fā)現(xiàn)ECLR隨著PMI的延長而呈降低趨勢，兩者之間存在著明顯的負(fù)相關(guān)。1999年徐長苗等研究溫度對尸體ECLR的影響，他發(fā)現(xiàn)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的存活率與溫度呈負(fù)相關(guān)。兩者肯定了茜素紅-曲利苯蘭聯(lián)合染色法檢測角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性率以推斷法醫(yī)學(xué)PMI的可行性并首次應(yīng)用該方法進(jìn)行量化。

1.2.2角膜內(nèi)皮細(xì)胞核DNA與PMI的關(guān)系

角膜本身無血管，細(xì)胞排列有規(guī)律，具有組織細(xì)胞單一、自溶速度慢等特點(diǎn)。2003年，劉承泉等首次應(yīng)用DNA技術(shù)檢測死后72h內(nèi)兔角膜上皮細(xì)胞核和內(nèi)皮細(xì)胞核DNA降解速率與PMI的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩者具有顯著的相關(guān)性，該方法具有測量精度高，速度快等特點(diǎn)，但其靈敏度和易觀察性不高，且只能對死后細(xì)胞DNA降解作定量分析。鄭吉龍等應(yīng)用單細(xì)胞凝膠電泳（SCGE）技術(shù)結(jié)合熒光顯微鏡和專業(yè)的計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)，證明了不同死后間隔時間所發(fā)生的不同程度的角膜內(nèi)皮細(xì)胞DNA降解，其降解發(fā)生率與死后間隔時間呈良好的線性關(guān)系。

1.2.3其他

另外，利用死后角膜水通道蛋白1 （AQP1）含量變化和角膜基質(zhì)中膠原纖維的分子直徑變化進(jìn)行推斷PMI也在不斷進(jìn)行中，其結(jié)果的有效性和可靠性有待進(jìn)一步證實(shí)［9，10］。

2　視網(wǎng)膜與PMI推斷

視網(wǎng)膜位于眼組織的最內(nèi)層，受外界環(huán)境因素的影響小。陳曉瑞等應(yīng)用復(fù)合熒光RTPCR技術(shù)，檢測死后不同時間大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞β-actin、Pgk1和Rp14等結(jié)構(gòu)性蛋白mRNA水平，發(fā)現(xiàn)死后28h內(nèi)，大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞mRNA的含量隨PMI的延長而下降，與PMI具有顯著相關(guān)性。盡管mRNA的檢測解決了檢材含量低、敏感性不高、形態(tài)不易觀察等問題，但只能對死后細(xì)胞mRNA降解作定量分析。彭新等采用改良Feulgen-Vans染色和圖像分析技術(shù)檢測大鼠死后28h內(nèi)視網(wǎng)膜細(xì)胞核DNA含量變化，發(fā)現(xiàn)大鼠死后視網(wǎng)膜細(xì)胞核DNA含量隨著PMI的延長而呈規(guī)律性降解，并與PMI具有良好的相關(guān)性。該法間接驗(yàn)證了死后細(xì)胞核DNA變化的機(jī)制。

3　玻璃體液與PMI推斷

玻璃體液具有受外界污染小和自溶慢的特點(diǎn)，因此玻璃體液內(nèi)的組織化學(xué)成分變化相對穩(wěn)定，優(yōu)于血液和腦脊液等體液，一直是根據(jù)尸體化學(xué)變化推斷PMI的較理想人體檢材。目前，應(yīng)用玻璃體液進(jìn)行PMI推斷的研究主要集中在氨、尿素氮、肌酐、葡萄糖、無機(jī)鹽離子（尤其是鉀離子）、次黃嘌呤和酶類等物質(zhì)。死亡后不同時間眼玻璃體液化學(xué)成分的變化有助于推斷PMI。

3.1玻璃體液中化學(xué)成分與PMI的關(guān)系

早在1978年，Van den Oever對150例死后玻璃體液標(biāo)本用不同的方法測定氨的含量，結(jié)果表明猝死尸體的玻璃體液中的氨濃度隨著PMI的延長而有規(guī)律地升高，且與死因和環(huán)境溫度有關(guān)。大量的研究PMI和環(huán)境溫度對玻璃體液的肌酐和尿素氮變化的影響，表明在4℃下，死后48h內(nèi)玻璃體液中的肌酐和尿素氮緩慢上升，肌酐和尿素氮水平與PMI具有一定的相關(guān)性，肯定了玻璃體液中肌酐水平在推斷PMI的可行性，并建議結(jié)合其他參數(shù)以準(zhǔn)確推斷PMI。陶濤等還發(fā)現(xiàn)玻璃體液內(nèi)葡萄糖濃度在死后迅速下降，在死后24h左右為零，與PMI之間具有很好的相關(guān)性，但需排除引起血糖升高因素如糖尿病、寒冷天氣、劇烈運(yùn)動、含糖飲食等因素的影響。

3.2玻璃體液中無機(jī)鹽離子與PMI的關(guān)系

人體死亡以后，玻璃體液鉀離子濃度增高，其機(jī)制與睫狀體主動輸送鉀離子進(jìn)入眼后房和玻璃體內(nèi)有關(guān)。半個世紀(jì)以來，法醫(yī)病理學(xué)者們應(yīng)用不同的檢測方法和實(shí)驗(yàn)對象，檢測玻璃體內(nèi)鉀離子濃度，證實(shí)鉀離子的變化與PMI的關(guān)系并建立回歸方程［11-13］。龔志強(qiáng)等應(yīng)用電感耦合等離子質(zhì)譜（ICP-MS），系統(tǒng)地研究了家兔死后96h內(nèi)眼玻璃體液21種元素含量變化與PMI的相關(guān)性，實(shí)驗(yàn)得出鉀、鎂、磷、鍶和鋇與PMI之間存在正相關(guān)，鈉、鐵、鈣和銅存在負(fù)相關(guān)性，鋁、銻、鎳和鋅則與PMI之間相關(guān)性很弱，進(jìn)一步確認(rèn)了玻璃體液微量元素在PMI推斷上的應(yīng)用價值。

3.3玻璃體液中次黃嘌呤與PMI的關(guān)系

次黃嘌呤是在缺氧的狀態(tài)下形成的，死后或死前機(jī)體缺氧均可升高。Rognum等報(bào)道稱玻璃體液次黃嘌呤（Hx）濃度在死后隨著PMI的延長而呈線性升高，其濃度變化受溫度影響，其適用于在生前無缺氧的尸檢案例，尤其是死后24h內(nèi)。之后，Munoz等進(jìn)一步修正了死亡原因?qū)x濃度的影響，得到更為精確的線性回歸方程。

3.4玻璃體液中酶類與PMI的關(guān)系

2004年，李興彪等研究了死后玻璃體液中淀粉酶水平的變化，認(rèn)為家兔死后72h內(nèi)玻璃體液中淀粉酶水平與PMI之間存在顯著相關(guān)。王偉平等用光度法檢測家兔死后0～54h玻璃體液膽堿酯酶（CHE）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）的活性變化與PMI和死后溫度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)兩種酶的活性改變在一定時間內(nèi)各自出現(xiàn)一個平臺期，平臺期后兩種酶的活性迅速下降，與PMI呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。劉承泉等證明玻璃體液中羥丁酸脫氫酶（HBDH）、乳酸脫氫酶（LDH）活性變化，隨著PMI的延長而逐漸下降。

3.5其他

除了檢測玻璃體液中的酶活性和離子濃度外，龔志強(qiáng)等證明家兔眼玻璃體液消光度在死后0～72h內(nèi)與PMI呈線性正相關(guān)，可用于推斷早期PMI。2008年，周睿卿等首次研究玻璃體液電導(dǎo)率的變化，發(fā)現(xiàn)30℃和20℃下家兔死后玻璃體液電導(dǎo)率隨著PMI的延長而持續(xù)升高，兩者存在著顯著的正相關(guān)。

4　存在問題和展望

盡管目前應(yīng)用眼組織變化推斷死亡時間的方法和研究內(nèi)容比較多，研究主要應(yīng)用動物實(shí)驗(yàn)且集中在短期內(nèi)的變化規(guī)律，因此，下一步應(yīng)使用尸體標(biāo)本進(jìn)行研究，并綜合考慮個體自身因素和環(huán)境外部因素的影響，使用實(shí)驗(yàn)證明的穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)手段，利用眼組織更客觀、真實(shí)地推斷PMI。眼組織有望成為一種用于法醫(yī)學(xué)PMI推斷的普遍適用的方法。

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