PHB合成方法及改性的研究進(jìn)展*

劉俊梅，王　慶，王　丹，楊盼盼，丁　偉，樸春紅，王玉華，于寒松

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林　長春　130118；2 吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林　吉林　132013)

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PHB合成方法及改性的研究進(jìn)展*

劉俊梅1，王慶1，王丹2，楊盼盼1，丁偉1，樸春紅1，王玉華1，于寒松1

(1 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林長春130118；2 吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林吉林132013)

聚-β-羥基丁酸酯(PHB)是一種由細(xì)菌胞內(nèi)合成，作為碳源和能源存儲的積累物，可用于合成可降解塑料。并且PHB具有良好的物理可塑性和生物相容性，在現(xiàn)實應(yīng)用中比較廣泛。但由于PHB的生產(chǎn)成本高和過程復(fù)雜，并沒有普遍進(jìn)入到人們的生活中。近年來關(guān)于PHB的合成方法的研究較多，本研究綜述了近年的PHB合成方法：微生物合成法、基因工程法、活性污泥法和化學(xué)合成法的研究進(jìn)展。

PHB；可降解塑料；合成方法

PHA(聚羥基脂肪酸酯)是一種主要由細(xì)菌胞內(nèi)合成，作為碳源和能源存儲的積累物，與傳統(tǒng)的聚乙烯、聚丙烯等化工材料有相似的物理學(xué)特性，而且PHA具有生物相容性以及具有結(jié)構(gòu)多樣性，可以完全降解成水和二氧化碳[1]。

而PHB是至今為止PHA家族中研究最多、最徹底的典型成員。早在1926年，法國人Lemoigne從巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)中發(fā)現(xiàn)PHB，具有良好的物理可塑性和生物相容性，在食品、醫(yī)藥、環(huán)保、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[2]。目前，雖然對微生物發(fā)酵生產(chǎn)PHB的產(chǎn)量提高上已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，但生產(chǎn)PHB的成本依然成為這個產(chǎn)業(yè)的瓶頸。所以人們也在不斷采用新的技術(shù)手段，嘗試多種合成PHB的方法。

1　PHB的合成方法

1.1微生物發(fā)酵法

目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多種類的原核微生物都能產(chǎn)生PHB，包括光能、化能自養(yǎng)和異養(yǎng)菌共計65個屬以上的300多種不同的微生物。如：產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)、固氮菌屬(Azotobacer)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium)、嗜鹽桿菌屬(Halobacterium)和甲基桿菌屬(Methylobacterium)等[3]。PHB的合成現(xiàn)象在自然界中較為普遍，在碳過量、氮限量的控制發(fā)酵條件下，PHB在胞內(nèi)可大量積累。盡管產(chǎn)PHB的微生物種類繁多，但合成PHB的代謝途徑主要有三步法合成途徑和五步法合成途徑：

1.1.1三步合成途徑

第一步由相關(guān)碳源代謝產(chǎn)生的兩個乙酰輔酶A，由基因phbA編碼的β-酮基硫解酶(PhbA)催化后產(chǎn)生一個乙酰乙酰輔酶A。第二步由基因phbB編碼NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶(PhaB)，使乙酰乙酰輔酶A還原為(R)-3-羥基丁酰輔酶A(3HB-CoA)。最后由基因phbC編碼的PHB聚合酶(PhbC)將3HB-CoA單體聚合成PHB，同時釋放游離的輔酶A。這一途徑是目前研究最多，并且研究較透徹，在多種細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)了這條途徑。

1.1.2五步合成途徑

五步合成途徑的第二步反應(yīng)與三步合成途徑不同，由NADH依賴型還原酶將乙酰乙酰輔酶A還原成(s)-3-羥基丁酰輔酶A，再由兩個烯酯酰輔酶A水合酶的催化下，分別經(jīng)過脫水和水合的過程，轉(zhuǎn)變成其異構(gòu)體(R)-3-羥基丁酞輔酶A，然后在PHB聚合酶的作用下聚合成PHB。

其中真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌具有生長速度快、PHB積累量大、生產(chǎn)技術(shù)較為成熟等優(yōu)點，己經(jīng)用于工業(yè)化小規(guī)模生產(chǎn)。吳桂芳發(fā)現(xiàn)在限氮培養(yǎng)的條件下有利于PHB的積累，但對細(xì)胞生長有一定的抑制作用[4]。張偉等[5]從工廠污水中分離到的北京紅簍菌(Rcs.pekingensis strain 3-p)能夠以乙酸、琥珀酸和丁酸等為碳源合成PHB。戴君等[6]通過丁醇富集篩選，從土壤樣品中篩選到一株假單胞菌SCH17，通過對碳源和氮源的優(yōu)化，得到最佳積累PHB的碳源是果糖，氮源是蛋白胨。在該培養(yǎng)基中僅需發(fā)酵14 h，菌體干重和PHB含量分別達(dá)到3.52 g/L和2.69 g/L，PHB含量高達(dá)細(xì)胞干重的76%。在2013年，董靜[7]在富含沼氣地區(qū)的土壤中培養(yǎng)篩選獲得的甲烷氧化混合菌，采用充盈-饑餓模式的好氧動態(tài)供料方法，并確立了高產(chǎn)PHB的充盈-饑餓運行條件，在氧氣充足的條件下充盈培養(yǎng)5 d，饑餓培養(yǎng)15 d，PHB含量可以達(dá)細(xì)胞干重的35.5%。發(fā)酵法生產(chǎn)PHB在發(fā)酵工藝和分離純化過程中存在因難，產(chǎn)量低，并且成本主要是價格昂貴的培養(yǎng)基。在2014年，Xuerong Han等[8]從淀粉豐富的綠藻中分理處一株產(chǎn)PHB的菌株UMI-21，在以淀粉為碳源時并通過10 L發(fā)酵罐合成PHB可達(dá)細(xì)胞干質(zhì)量的45.5%，發(fā)現(xiàn)這個值比在培養(yǎng)燒瓶中要高。工業(yè)上微生物生產(chǎn)PHB的一個主要問題是價格昂貴的培養(yǎng)基，淀粉是一種相對便宜的底物，表明菌株UMI-21在以淀粉為碳源時具有大規(guī)模生產(chǎn)的PHB可能性。

1.2基因工程法

1.2.1轉(zhuǎn)基因工程菌法

目前利用重組大腸桿菌合成PHB的方法較成熟，而且大腸桿菌可利用廉價原料和廢棄物來大量產(chǎn)生PHB，從而降低生產(chǎn)成本倍受到人們的關(guān)注[9]。并且，大腸桿菌缺少降解PHB的關(guān)鍵梅，所以合成的PHB不會被大腸桿菌所降解。大腸桿菌的細(xì)胞壁易于破碎，有利于PHB的提取純化。早在1987年，Dennis成功地從A .eutrophus中克隆到合成PHB的基因，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，該重組菌株可以直接利用各種碳源作為底物，進(jìn)一步降低了成本[10]。在2011年，陳泉[11]利用Red同源重組技術(shù)敲除了大腸桿菌PTS系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶基因-ptsG基因。并成功構(gòu)建了大腸桿菌DH5aΔptsG/pBHR68，能夠同時利用多種糖的混合物高效生產(chǎn)PHB。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)也加快了對PHB菌種的代謝研究，產(chǎn)PHB的重組大腸桿菌由于PHB的積累也發(fā)生了一定的生理變化。許多變化由于不與PHB合成途徑直接相關(guān)，而不是非常明顯。通過對PHB合成和降解中整個代謝過程的進(jìn)一步了解可以讓我們能設(shè)計更好的基因工程菌，并能開發(fā)出更有效的發(fā)酵方法。

1.2.2轉(zhuǎn)基因植物合成PHB

農(nóng)作物不僅可以作為食物來源，還可以用來制造大量的化合物，而且它們的價格與同類的石化產(chǎn)品相比較低。淀粉和油脂是目前從植物中提取日用化產(chǎn)品的很好的例子。近年來，分子生物學(xué)和植物轉(zhuǎn)化方面的一些項目使植物生產(chǎn)PHB成為可能。目前，已作為PHB合成酶相關(guān)基因表達(dá)受體生產(chǎn)PHB的植物有擬南芥、甘蔗葉子、棉花和藍(lán)細(xì)菌等。John[12]等將phbB及phbC基因與棉花纖維特異啟動子串聯(lián)，然后用粒子轟擊法導(dǎo)入棉花植物中。結(jié)果表明棉纖維中合成的PHB與細(xì)菌合成的PHB相似。在2002年，我國吳桂芳[13]在研究藍(lán)細(xì)菌及其基因重組菌產(chǎn)PHB時，采用缺少氮源的條件下激活PHB合成酶基因表達(dá)，外加碳源激活PHB合成酶的催化活性，利用葡萄糖及乙酸鈉對細(xì)胞分階段培養(yǎng)，得出PHB的產(chǎn)量明顯提高。但構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)PHB的過程中，在基因組中插入的強啟動子和多個PHB合成相關(guān)基因后，會產(chǎn)生基因沉默現(xiàn)象，大大降低了PHB的合成效率。在2011年，Ken’ichiro Matsumoto等[14]優(yōu)化了PHB合成相關(guān)基因(PhbB和PhbC)的密碼子，以改善其在植物中的mRNA的翻譯效率。結(jié)果表明在轉(zhuǎn)化體內(nèi)PHB的含量平均為0.2 mg/g干細(xì)胞重，比攜有野生型基因(PhbB和PhbC)所產(chǎn)的PHB的0.09 mg/g干細(xì)胞重高。但已有結(jié)果表明PHB積累會抑制植物生長，植物到生長后期PHB的積累能力會明顯下降，目前轉(zhuǎn)基因合成PHB依然沒有大規(guī)模應(yīng)用[15]。

1.3活性污泥法

活性污泥包含多種混合的微生物群落，在污泥中，微生物對食物的競爭是非常激烈的，并且生長環(huán)境也很惡劣，其中的PHA的積累通常是被微生物作為一種抗逆機制存在的。與PHA合成相關(guān)的研究比較多的一個活性污泥處理過程是高效生物除磷處理過程(EBPR)。近年來新興的活性污泥法合成PHB技術(shù)不僅能有效去除污水中氮、磷等污染物，并且能夠回收污泥中PHB[16]。早在20世紀(jì)80年代，人們就開始認(rèn)識到PHB是EBPR活性污泥處理過程中的一個很重要的代謝物。研究學(xué)者們發(fā)現(xiàn)活性污泥中的好氧菌如：黃桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、貝氏硫菌和動膠菌屬等，都能在蘇丹黑染色后在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)PHB顆粒[17]。黃曉鈺等[18-19]利用工廠的污泥好氧發(fā)酵生產(chǎn)PHB，分兩階段培養(yǎng)污泥，第一階段提供適合的條件，篩選出適合污泥生長的培養(yǎng)基。第二階段篩選發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)PHB，PHB的累積量達(dá)污泥濃度(MLSS)的4.86%。在2009年，德吉央宗[20]采用乙酸鈉為碳源，通過好氧動態(tài)供料法在序批式活性污泥法(SBR)反應(yīng)器中對活性污泥進(jìn)行馴化，結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)，隨著溶解氧濃度的提高、碳源濃度升高，PHB合成量也逐漸增加。在缺氮條件下，PHB的最大積累量達(dá)1598 mg/L，占質(zhì)量分?jǐn)?shù)的65.2%。而營養(yǎng)平衡時的最大累積量僅為 784.6 mg/L，占質(zhì)量分?jǐn)?shù)的 45.4%。在2013年，Laetitia Cavaille等[21]以乙酸作為底物，在好氧分批補料的條件下研究廢物活化污泥(WAS)產(chǎn)PHB的特點。發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)來源不同的活性污泥中磷元素濃度，的可以誘導(dǎo)活性污泥中PHB的積累。目前，由于活性污泥環(huán)境中成分復(fù)雜，從而導(dǎo)致下游的分離成本高，這也限制了用活性污泥的方法生產(chǎn)PHB。也正是因為活性污泥環(huán)境的復(fù)雜，微生物種類的繁多，我們可以在活性污泥中獲得許多PHA合成的相關(guān)基因，具有獲得許多新型PHA的潛力。

1.4化學(xué)合成法

用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)PHB，其復(fù)雜的工藝流程和嚴(yán)格的條件，決定了其生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量低，萃取和純化操作難度大，嚴(yán)重阻礙了其工業(yè)化應(yīng)用。因此，化學(xué)法合成PHB作為開發(fā)生產(chǎn)PHB的另一途徑?；瘜W(xué)法合成PHB目前主要存在三種方法：一種是以β-丁內(nèi)酯為單體制備PHB，一種以3-羥基丁酸為單體制備PHB，另一種是以β-羥基丁酸乙酯為單體聚合PHB。早在1993年，Hori等[22]采用錫烷絡(luò)合物作為催化劑，利用β-丁內(nèi)酯可制得PHB，其性質(zhì)與生物發(fā)酵制得的產(chǎn)品類似。Seebach等[23]提出了以3-羥基丁酸為原料，在用本體聚合制備PHB。在2005年，我國王佳寧等[24]采用3-羥基丁酸乙酯本體聚合制備PHB，以鈦酸四丁酯為催化劑，在一定壓力下，反應(yīng)時間為30 h，聚合物的聚合度可達(dá)到75.3。采用化學(xué)法合成PHB，雖然可以提高PHB的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。但是化學(xué)法合成PHB，使用的原料一般都比較昂貴，而且大部分有毒性，化學(xué)反應(yīng)條件嚴(yán)茍，伴隨的副反應(yīng)較多，反應(yīng)回收率較低，反應(yīng)的產(chǎn)物分離困，還會對環(huán)境造成二次污染，這些都是阻礙化學(xué)合成PHB要面臨的問題。

2　展　望

目前石油化工類高分子塑料已經(jīng)成為人類不可缺少材料，其主要原因是這類材料具有成本低，結(jié)構(gòu)多樣，應(yīng)用廣泛等特點。但其負(fù)面效應(yīng)也隨之而來，由于化工類塑料在自然界中很難降解，形成了白色垃圾嚴(yán)重污染了我們的生存環(huán)境。因此，人們急需尋找一種能代替石油化工類塑料的可降解材料。而PHB是至今為止PHA家族中研究最徹底的典型成員，PHB具有良好的生物相容性和生物降解性。對于PHB合成的研究將會加快生物可降解塑料的研究和開發(fā)，并具有非常廣闊的前景。

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Research Progress on Synthesis and Modification of PHB*

LIU Jun-mei1, WANG Qing1, WANG Dan2, YANG Pan-pan1, DING Wei1,PIAOChun-hong1,WANGYu-hua1,YUHan-song1

(1 College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118;2 Jilin Medical College, Jilin Jilin 132013, China)

Poly-β-hydroxybutyrate (PHB) belongs to a bacterial cell by a synthetic substance as accumulated carbon and energy storage. It can be used for the synthesis of biodegradable plastics. PHB has good physical plasticity and biocompatibility, applies more widely in real-world. However, due to the high cost of production of PHB and the complex process, PHB is no universal access to people’s lives. In recent years, studies on the synthesis of PHB attract more attentions, synthetic methods of PHB were reviewed such as microbial synthesis, genetic engineering, activated sludge and chemical synthesis method.

PHB; biodegradable plastics; synthesis method

吉林省科技支撐重大攻關(guān)專項(項目編號：20116034)。

劉俊梅(1973-)，女，博士，副教授，研究方向食品生物化學(xué)與功能食品。

TQ050.4

A

1001-9677(2016)01-0016-03