一株產(chǎn)生物表面活性劑耐鹽堿菌株的分離及鑒定*

王 君 范延輝 姚志剛

(濱州學(xué)院生命科學(xué)系，山東省黃河三角洲野生植物資源開發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，山東 濱州 256603)

生物表面活性劑是微生物或植物在一定條件下培養(yǎng)時(shí)，在其代謝過程中分泌出的具有一定表面活性的代謝產(chǎn)物，其種類繁多，包括糖脂、磷脂、脂肪酸、脂肽或中性類脂衍生物等[1-2]。相比化學(xué)表面活性劑，生物表面活性劑除了具有降低界面張力和表面張力外，還具有無毒、易降解、用量少及生物兼容性等特點(diǎn)[3]，故其在石油工業(yè)的生物降黏、提高原油采收率、修復(fù)石油污染土壤等方面得到廣泛應(yīng)用。此外，還應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品生產(chǎn)、造紙、重金屬去除等諸多領(lǐng)域[4]。

近年來，隨著石油與天然氣資源的開發(fā)利用，石油泄露與污染事件時(shí)有發(fā)生，生物修復(fù)是一種有效的手段。大多數(shù)石油降解微生物具有產(chǎn)生物表面活性劑的特點(diǎn)，這在石油工業(yè)具有非常重要的應(yīng)用。生物表面活性劑的兩親結(jié)構(gòu)可促使烴類污染物乳化、分散，從而加大微生物與石油污染物的接觸面，促進(jìn)污染物降解[5]。

本研究從石油污染土壤中分離獲得了一株產(chǎn)生物表面活性劑的菌株BG，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，研究了其產(chǎn)生物表面活性劑的最適溫度、pH和鹽度，并對(duì)其活性成分進(jìn)行了提取和初步鑒定，該菌株在黃河三角洲石油污染鹽漬土壤的生物治理方面有應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母膏0.1 g，葡萄糖2 g，柴油10 mL，NH4NO33 g，KH2PO40.5 g，水1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5 g，酵母粉1 g，蛋白胨2 g，pH=7，水1 000 mL。

1.2 菌種分離

取0.5 g石油污染鹽漬土土樣接種于100 mL富集培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)7 d。將富集液進(jìn)行梯度稀釋，涂布發(fā)酵培養(yǎng)基固體平板，37 ℃培養(yǎng)2 d，得到單菌落。取初篩后的菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃過夜培養(yǎng)，使其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。以1%(體積分?jǐn)?shù))接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)集中，37 ℃、180 r/min下培養(yǎng)48 h，對(duì)發(fā)酵液表面張力變化情況進(jìn)行測(cè)定[6]。

1.3 菌種鑒定

生理生化特征分析參見文獻(xiàn)[7]。16S rRNA序列分析：以菌株基因組DNA為模板，用16S rRNA通用引物(27F：5’-GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG-3’，1541R：5’-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3’)擴(kuò)增得到近全長(zhǎng)的16S rRNA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)產(chǎn)物測(cè)序后采用Clustal X2.0對(duì)所獲得的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)分析，得到序列之間的相似值；用MEGA 4.1計(jì)算出序列的系統(tǒng)進(jìn)化距離，采用鄰位相連法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 菌株產(chǎn)生物表面活性劑的特性研究

1.4.1 表面張力和生長(zhǎng)值測(cè)定

將菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h后，使用全自動(dòng)表面張力儀鉑金環(huán)法測(cè)定發(fā)酵液的表面張力。以7 d為周期，每隔12 h取發(fā)酵液測(cè)定表面張力；0～36 h每2 h測(cè)定發(fā)酵液在630 nm下的吸光度(OD630)，36 h后每12 h測(cè)定OD630，以表征菌株生長(zhǎng)值。

1.4.2 菌株產(chǎn)生物表面活性劑最適溫度測(cè)定

將菌株接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別在27、32、37、42、47 ℃下，180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定不同發(fā)酵液的表面張力和OD630。

1.4.3 菌株產(chǎn)生物表面活性劑的耐堿特性

發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變，調(diào)節(jié)pH分別為7、8、9、10、11、12、13，將菌株接種至不同pH的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液的表面張力和OD630。

1.4.4 菌株產(chǎn)生物表面活性劑的耐鹽特性

發(fā)酵培養(yǎng)基其他成分不變，按照0、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%的質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加NaCl，將菌株接種至不同鹽度的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，測(cè)定發(fā)酵液的表面張力和OD630。

1.5 生物表面活性劑分離

采用酸沉法提取發(fā)酵液中的生物表面活性劑[8]，具體方法是：將菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液在4 ℃條件下，8 000 r/min離心10 min，棄菌體。收集上清液后測(cè)定表面張力，然后用1 mol/L HCl將上清液的pH調(diào)至2，4 ℃靜置過夜后，8 000 r/min下離心10 min，分離沉淀和上清液，將沉淀重溶于去離子水，測(cè)定表面張力，獲得生物表面活性劑。

1.6 生物表面活性劑的定性定量分析

采用硫酸-蒽酮糖顯色法進(jìn)行生物表面活性劑的糖定性分析；采用茚三酮顯色法進(jìn)行生物表面活性劑的蛋白質(zhì)定性分析；采用鉬酸銨-高氯酸法進(jìn)行生物表面活性劑的脂定性分析。采用二氯甲烷/甲醇法、考馬斯亮藍(lán)染色法對(duì)其中的脂類和蛋白質(zhì)組分含量進(jìn)行分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并對(duì)各指標(biāo)的相關(guān)性進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)生物表面活性劑菌種的分離

通過富集培養(yǎng)，從石油污染鹽漬土壤中獲得4株優(yōu)勢(shì)菌，分別命名為菌株BB、BF、BL、BG。對(duì)4株菌進(jìn)行復(fù)篩，測(cè)得4株菌對(duì)發(fā)酵液表面張力的降低情況。菌株BB、BL、BF、BG將發(fā)酵液的表面張力從對(duì)照的51.5 mN/m，分別降低到44.5、48.0、45.2、30.7 mN/m(如圖1所示)，降低幅度分別為13.6%、6.9%、12.2%、40.5%，差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。菌株BG降表面張力的能力最強(qiáng)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究菌種。

圖1 發(fā)酵液的表面張力Fig.1 Surface tension of the fermentation liquid

2.2 菌株BG的分類鑒定

參照文獻(xiàn)[7]對(duì)菌株BG進(jìn)行了初步鑒定，該菌株為革蘭氏陽(yáng)性菌，桿狀、有芽孢、無鞭毛；在發(fā)酵培養(yǎng)基平板上37 ℃培養(yǎng)24 h，菌落呈圓形、白色、邊緣整齊、不透明、表面濕潤(rùn)(見圖2)。淀粉酶實(shí)驗(yàn)、纖維素降解實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原、VP實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性，甲基紅(MR)實(shí)驗(yàn)為陰性。將16S rRNA測(cè)序獲得1 448 bp序列，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，菌株BG與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的16S rRNA序列相似性為99%，構(gòu)建的菌株BG和GenBank中親緣關(guān)系較近菌屬的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。經(jīng)生理生化鑒定和16S rRNA序列分析，可初步判定菌株BG屬于芽孢桿菌屬。

圖2 菌株BG的菌落照片F(xiàn)ig.2 Colonies of strain BG

圖3 菌株BG和其他相關(guān)菌株基于16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of strain BG and its related strains

2.3 菌株BG產(chǎn)生物表面活性劑的發(fā)酵曲線

菌株BG生長(zhǎng)與降低表面張力的關(guān)系曲線如圖4所示。0～24 h，菌株BG在14 h時(shí)OD630到達(dá)最高點(diǎn)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)進(jìn)入衰敗期。0～48 h，表面張力隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，由初始的58.4 mN/m降低到48 h時(shí)的25.1 mN/m，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；48～96 h，表面張力隨時(shí)間延長(zhǎng)而增加，最后穩(wěn)定在37.6 mN/m?？梢?，發(fā)酵48 h，菌株BG發(fā)酵效果達(dá)到最佳。菌株BG在24 h內(nèi)生長(zhǎng)情況最佳，隨時(shí)間的延長(zhǎng)生物表面活性劑開始積累，48 h可將發(fā)酵液的表面張力降至最低。

圖4 菌株BG生長(zhǎng)與降低表面張力的關(guān)系曲線Fig.4 Relation between the growth of strain BG and its ability to reduce the surface tension

2.4 溫度對(duì)菌株BG降低發(fā)酵液表面張力的影響

溫度對(duì)菌株BG降低發(fā)酵液表面張力的影響如圖5所示。當(dāng)溫度分別為27、47 ℃時(shí)，菌株BG的OD630分別為0.27、0.25，發(fā)酵液的表面張力從對(duì)照的51.5 mN/m(見圖1)分別降至42.1、43.5 mN/m，分別降低了18.2%、15.6%，差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)溫度分別為32、37、42 ℃時(shí)，菌株BG的OD630分別為0.32、0.34、0.29，發(fā)酵液的表面張力分別比對(duì)照(見圖1)降低了39.8%、48.3%、30.8%，菌株BG的生長(zhǎng)值差異仍不顯著(P>0.05)，但是表面張力降低值差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，菌株BG產(chǎn)生的生物表面活性劑可將發(fā)酵液表面張力降低至26.6 mN/m。溫度過低，菌株BG菌體生長(zhǎng)緩慢，轉(zhuǎn)化底物的效率低；而溫度過高，菌體易于老化，不利于生物表面活性劑的合成。

圖5 溫度對(duì)菌株BG降低發(fā)酵液表面張力的影響Fig.5 Effect of temperature on reduction of surface tension by strain BG

2.5 菌株BG產(chǎn)生物表面活性劑的耐堿分析

pH對(duì)菌株BG降低發(fā)酵液表面張力的影響如圖6所示。當(dāng)pH為7～11，菌株BG降低發(fā)酵液表面張力之間、菌株生長(zhǎng)值之間的差異均不顯著(P>0.05)；當(dāng)pH分別為12、13時(shí)，菌體生長(zhǎng)值之間差異仍不顯著(P>0.05)。pH的增加對(duì)于生物表面活性劑的產(chǎn)生與表面張力的變化影響較小，可使發(fā)酵液表面張力降到26.4 mN/m左右，當(dāng)pH大于12時(shí)表面張力的降低量變小，但是菌株BG降低表面張力的能力仍比對(duì)照分別降低了25.8%、18.4%，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)?？梢钥闯?，菌株BG在堿性較高的環(huán)境中仍可產(chǎn)生物表面活性劑。

圖6 pH對(duì)菌株BG降低發(fā)酵液表面張力的影響Fig.6 Effect of pH on reduction of surface tension by strain BG

2.6 菌株BG產(chǎn)生物表面活性劑的耐鹽分析

NaCl對(duì)菌株BG降低發(fā)酵液表面張力的影響如圖7所示。當(dāng)NaCl為0～6%時(shí)，菌株BG的表面張力降低能力較強(qiáng)，表面張力之間和菌體生長(zhǎng)值之間的差異均不顯著(P>0.05)；當(dāng)NaCl大于6%時(shí)，菌株BG的生物表面活性劑產(chǎn)生能力和生長(zhǎng)受到影響，但差異仍不顯著(P>0.05)。當(dāng)NaCl為9%時(shí)表面張力仍可降低到33.5 mN/m，可以看出菌株BG具有很強(qiáng)的耐鹽產(chǎn)生物表面活性劑的特性。

圖7 NaCl對(duì)菌株BG降低發(fā)酵液表面張力的影響Fig.7 Effect of NaCl on reduction of surface tension by strain BG

2.7 菌株BG產(chǎn)生的生物表面活性劑的提取及分析

從1 L菌株BG的發(fā)酵液中提取得到0.127 g棕褐色粉末。將該物質(zhì)重溶到蒸餾水中，再次測(cè)定其表面張力，表面張力平均值為29.5 mN/m。對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性分析，結(jié)果表明，該物質(zhì)含有脂類和蛋白質(zhì)，不含糖類，是一種脂蛋白類物質(zhì)。定量分析結(jié)果表明，脂類和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為64.7%、35.3%。

3 討 論

黃河三角洲地區(qū)是我國(guó)第二大石油基地，擁有豐富的油氣資源，然而在石油開采、運(yùn)輸和加工過程中，造成了嚴(yán)重的污染。另外，該地區(qū)的土壤以濱海鹽土為主，土壤含鹽量高，土壤表層鹽分為0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)～3.0%[9]。2009年，國(guó)務(wù)院已正式批復(fù)《黃河三角洲高效生態(tài)經(jīng)濟(jì)區(qū)發(fā)展規(guī)劃》?；诖?，黃河三角洲的上升發(fā)展成為國(guó)家戰(zhàn)略，成為國(guó)家區(qū)域協(xié)調(diào)發(fā)展的重要部分。隨著發(fā)展的需要，該地區(qū)的石油污染與治理問題也將引起更多的關(guān)注，而對(duì)該地區(qū)進(jìn)行石油污染鹽漬土壤的生物修復(fù)，需要利用耐鹽微生物[10-11]。

石油烴類化合物在土壤中吸附固定，水溶性低是限制其生物修復(fù)速率的關(guān)鍵因素。表面活性劑能增大石油烴類物質(zhì)在水相中的溶解度，提高污染物在土壤中的傳質(zhì)速率和生物可利用性，進(jìn)而促進(jìn)其降解[12-13]。生物表面活性劑與化學(xué)表面活性劑相比，除具有表面張力低、乳化性能穩(wěn)定等共同特性外，還具有低毒、易于生物降解、可在原位合成等諸多優(yōu)點(diǎn)。以特定的方式加入或利用微生物自身所產(chǎn)生的生物表面活性劑促進(jìn)烴類物質(zhì)的生物降解，已成為石油污染土壤生物修復(fù)的一個(gè)重要研究方向[14-15]。

現(xiàn)已報(bào)道的產(chǎn)生物表面活性劑耐鹽菌主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、紅球菌屬(Rhodococcussp.)等，但這些耐鹽菌主要從油田廢水和油污海水中分離得到，由于土壤環(huán)境較復(fù)雜，在高鹽環(huán)境下修復(fù)石油污染土壤的應(yīng)用潛力很有限。MAKKAR等[16]分離到一株芽孢桿菌，該菌株經(jīng)96 h培養(yǎng)后，可將發(fā)酵液表面張力降至34 mN/m，但是該菌株不具有耐鹽堿特性。吳濤等[17]從石油污染鹽漬土壤中分離得到一株耐鹽的沙雷氏菌，可將發(fā)酵液表面張力從56.5 mN/m降低到28.4 mN/m。本研究從黃河三角洲的地域?qū)嶋H出發(fā)，自黃河三角洲石油污染鹽漬土壤中分離得到一株芽孢桿菌，該菌株培養(yǎng)48 h能將發(fā)酵液的表面張力從初始的58.4 mN/m降至25.1 mN/m，并且具有良好的耐鹽堿特性，該菌株在實(shí)際應(yīng)用中是否具有作用將會(huì)成為下一步工作的重點(diǎn)，下一步實(shí)驗(yàn)將把該菌株用于石油污染鹽漬土壤的生物修復(fù)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)，為生物修復(fù)提供可靠的理論和實(shí)踐支持。

4 結(jié) 論

(1) 從石油污染鹽漬土壤中分離到一株高效產(chǎn)生物表面活性劑的耐鹽堿菌株BG，結(jié)合菌落形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rRNA序列分析，確定該菌株為芽孢桿菌屬。

(2) 菌株BG在37 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h，可將發(fā)酵液的表面張力由初始的58.4 mN/m降低至25.1 mN/m。

(3) 溫度對(duì)菌株BG產(chǎn)生物表面活性劑的影響較大，最適溫度是37 ℃，此溫度下菌株BG有良好的耐鹽堿特性，顯著降低發(fā)酵液表面張力。

(4) 采用酸沉法提取了菌株BG產(chǎn)生的生物表面活性劑，定性分析表明，該物質(zhì)是一種脂蛋白類物質(zhì)，其中脂類和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為64.7%、35.3%。

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