蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其溶藻方式的研究*

李文利 劉征宇 陸雅雅 章忠輝 李曉暉

(上海海洋大學(xué)上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

水體富營養(yǎng)化導(dǎo)致藍(lán)藻水華的爆發(fā)日趨頻繁，嚴(yán)重破壞了水生生態(tài)系統(tǒng)，危及人類和水生生物的健康。常用的除藻方法包括物理法、化學(xué)法和生物法[1-2]。物理法除藻最為方便可行，效果也比較顯著，對(duì)于緊急處理時(shí)有很好的成效，但成本過高，治標(biāo)不治本；化學(xué)法除藻通過向水體中投加化學(xué)藥劑，能快速殺死藻細(xì)胞，但大多數(shù)化學(xué)藥劑有毒，易造成二次污染；生物法除藻是目前來說操作最簡單、成本最低、對(duì)環(huán)境最安全的方法[3-5]。溶藻細(xì)菌是一類能通過直接接觸藻細(xì)胞或間接分泌胞外代謝產(chǎn)物來抑制藻類生長，甚至溶解藻細(xì)胞、殺死藻類的細(xì)菌的統(tǒng)稱[6]。溶藻細(xì)菌治理藍(lán)藻水華是生物除藻的一種方式[7-8]。

本研究從太湖水華水域分離得到一株蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)，是一種有效的溶藻細(xì)菌。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過優(yōu)化培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、裝瓶量、接種量、發(fā)酵時(shí)間等培養(yǎng)條件，并根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，得到蠟樣芽孢桿菌的最佳培養(yǎng)條件，從而提高溶藻細(xì)菌培養(yǎng)液對(duì)銅綠微囊藻905(Microcystisaeruginosa905)的清除能力。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 藻種和菌種

銅綠微囊藻905購自中國科學(xué)院野生生物種質(zhì)庫——淡水藻種庫，轉(zhuǎn)種到新鮮的BG11培養(yǎng)基后在溫度為25 ℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、光暗比為14 h∶10 h的條件下培養(yǎng)[9]。

蠟樣芽孢桿菌從太湖水華水域分離得到并經(jīng)鑒定確認(rèn)。

1.1.2 培養(yǎng)基

蔗糖6.5 g/L、酵母膏13 g/L、NaCl 0.5 g/L、K3PO40.5 g/L、MgSO4·3H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.2 g/L、CaCl20.15 g/L、MnSO40.5 g/L，調(diào)pH=8.2。

1.1.3 主要儀器

智能型光照培養(yǎng)箱(SPX-250PG)；紫外—可見分光光度計(jì)(SQ-UV2300)；光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯，CX21)；多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)(TDZ5-WS)等。

1.2 方 法

1.2.1 溶藻實(shí)驗(yàn)

蠟樣芽孢桿菌經(jīng)過營養(yǎng)瓊脂活化后接種在新鮮的培養(yǎng)基中，在37 ℃、180 r/min的條件下發(fā)酵12 h。發(fā)酵液經(jīng)4 000 r/min離心10 min后，取上清液0.5 mL與對(duì)數(shù)生長期的銅綠微囊藻905藻液4.5 mL混合，同時(shí)取0.5 mL無菌的培養(yǎng)基與生長對(duì)數(shù)期的銅綠微囊藻905藻液4.5 mL混合后作為對(duì)照(T0)，放置在溫度為25 ℃、光照強(qiáng)度為2 000 lx、光暗比為14 h∶10 h的條件下培養(yǎng)5 d。

1.2.2 銅綠微囊藻905生物量的測定

用光學(xué)顯微鏡視野計(jì)數(shù)法測定銅綠微囊藻905的藻細(xì)胞濃度[10]。

銅綠微囊藻905中含有葉綠素a，因此在超聲振蕩的條件下使銅綠微囊藻905藻細(xì)胞破碎釋放出葉綠素a，也可以用葉綠素a的濃度間接表征銅綠微囊藻905的生物量。葉綠素a的測定方法：用丙酮在低溫黑暗條件下萃取待測培養(yǎng)液12 h后離心，取上清液分別在 630、647、664、750 nm波長下測定吸光度，根據(jù)式(1)計(jì)算葉綠素a的濃度[11]。

c=11.85(A664-A750)-1.54(A647-A750)-0.08(A630-A750)

(1)

式中，c為葉綠素a的質(zhì)量濃度，mg/L；A630、A647、A664、A750分別為630、647、664、750 nm波長下的吸光度。

通過清除率來評(píng)價(jià)蠟樣芽孢桿菌的溶藻效率，計(jì)算公式見式(2)。

η=(1-ce/cc)×100%

(2)

式中，η為藻細(xì)胞或葉綠素a的清除率，%；ce為實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞濃度或葉綠素a質(zhì)量濃度，單位根據(jù)實(shí)際情況確定；cc為對(duì)照組的藻細(xì)胞濃度或葉綠素a質(zhì)量濃度，單位根據(jù)實(shí)際情況確定。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

將活化好的蠟樣芽孢桿菌接種在250 mL錐形瓶中培養(yǎng)，對(duì)培養(yǎng)溫度、轉(zhuǎn)速、裝瓶量、接種量、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。研究培養(yǎng)溫度對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、接種量為4%、發(fā)酵時(shí)間為12 h，培養(yǎng)溫度設(shè)置為27、32、37、42、47 ℃；研究轉(zhuǎn)速對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制培養(yǎng)溫度為37 ℃、裝瓶量為50 mL、接種量為4%、發(fā)酵時(shí)間為12 h，轉(zhuǎn)速設(shè)置為60、100、140、180、220 r/min；研究裝瓶量對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、接種量為4%、發(fā)酵時(shí)間為12 h，裝瓶量設(shè)置為25、50、75、100、125 mL；研究接種量對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、發(fā)酵時(shí)間為12 h，接種量設(shè)置為2%、4%、6%、8%、10%；研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)葉綠素a清除率的影響時(shí)，控制培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝瓶量為50 mL、接種量為4%，發(fā)酵時(shí)間設(shè)置為4、6、8、10、12 h。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇培養(yǎng)溫度(X1)、轉(zhuǎn)速(X2)和發(fā)酵時(shí)間(X3)3個(gè)主要因素再進(jìn)一步采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，綜合考慮因素間的交互作用。利用Design-Export 8.0軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)的因素水平表見表1。

表1 因素與水平表

1.2.5 蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式探究

為探討蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式，對(duì)其培養(yǎng)液進(jìn)行如下處理：(1)用 121 ℃、103.4 kPa高溫高壓滅菌20 min，記為T1；(2)用0.2 μm濾膜過濾，記為T2；(3)用12 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心1 min，記為T3；(4) 用250 W超聲振蕩15 min，記為T4；(5)不做任何處理，記為T5。將上述處理的培養(yǎng)液再按照1.2.1的溶藻實(shí)驗(yàn)進(jìn)行溶藻方式探究[12]。

2 結(jié) 果

2.1 蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化

蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1(a)可見，37 ℃時(shí)蠟樣芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率最高達(dá)92.30%，溫度過高或過低都會(huì)影響溶藻效果；圖1(b)顯示，轉(zhuǎn)速為60～180 r/min時(shí)，蠟樣芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率隨轉(zhuǎn)速的升高而升高，180 r/min時(shí)葉綠素a清除率達(dá)到最高(89.92%)，轉(zhuǎn)速為220 r/min時(shí)葉綠素a清除率反而有所降低；裝瓶量通過影響發(fā)酵過程的通氣量而影響蠟樣芽孢桿菌對(duì)銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率，圖1(c)結(jié)果顯示，當(dāng)裝瓶量為75 mL時(shí)葉綠素a清除率最高(90.53%)；從圖1(d)可以看出，蠟樣芽孢桿菌接種量為2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)～6%時(shí)，銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率隨接種量增加而升高，當(dāng)接種量達(dá)到6%以后，葉綠素a清除率基本保持不變；圖1(e)為發(fā)酵時(shí)間對(duì)銅綠微囊藻905的葉綠素a清除率的影響，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長葉綠素a清除率先升高后降低，發(fā)酵時(shí)間為8 h時(shí)葉綠素a清除率最高(91.97%)。

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.1 The results of the single factor experiments

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，蠟樣芽孢桿菌在培養(yǎng)溫度為37 ℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min、裝瓶量為75 mL、接種量為6%、發(fā)酵時(shí)間為8 h的條件下對(duì)葉綠素a的清除率最高。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)葉綠素a清除率結(jié)果見表2，以葉綠素a清除率(Y)為因變量得到二次回歸方程如式(3)所示，并對(duì)各變量的回歸系數(shù)進(jìn)行顯著性分析(見表3)。

(3)

從表4可知，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的回歸模型P<0.000 1，失擬的P=0.681 3，因此回歸模型高度顯著(P≤0.05)，但失擬檢驗(yàn)不顯著(P>0.05)；蠟樣芽孢桿菌菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化的回歸模型的校正決定系數(shù)R2(adj)為0.939 8，說明模型能解釋約93.98%的總變異；決定系數(shù)R2為0.968 3，說明模型擬合程度良好，誤差較小，可以用來分析和預(yù)測蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化情況。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及相應(yīng)葉綠素a清除率結(jié)果

表3 回歸系數(shù)的顯著性分析

最終，Design-Expert 8.0軟件的預(yù)測結(jié)果為：培養(yǎng)溫度39.35 ℃，轉(zhuǎn)速170.40 r/min，發(fā)酵時(shí)間9.08 h?？紤]到實(shí)際條件的可控制性，把最佳培養(yǎng)條件修正為：接種量6%、裝瓶量75 mL、培養(yǎng)溫度39 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min、發(fā)酵時(shí)間為9 h，此時(shí)葉綠素a清除率為86.72%。

表4 回歸模型的方差分析1)

注：1)模型R2(adj)=0.939 8，R2=0.968 3。

2.3 蠟樣芽孢桿菌的溶藻方式探究

溶藻方式的探究結(jié)果見表5，除T4的藻細(xì)胞清除率較低外，T1～T3處理方式與T5幾乎沒有差別，而蠟狀芽孢桿菌耐高溫性較差，經(jīng)高溫處理后細(xì)胞已經(jīng)失活[13]，由此可以初步判斷蠟狀芽孢桿菌可能通過分泌一種耐高溫的代謝產(chǎn)物或是細(xì)胞外物質(zhì)來抑制銅綠微囊藻905的生長，溶藻方式屬于間接溶藻，超聲振蕩可能會(huì)破壞這種代謝產(chǎn)物或細(xì)胞外物質(zhì)。

表5 溶藻方式的研究結(jié)果

3 討 論

微囊藻是藍(lán)藻水華的優(yōu)勢藻類，其中以銅綠微囊藻最具代表性，會(huì)產(chǎn)生對(duì)人體有害的微囊藻毒素[14]。利用溶藻細(xì)菌治理藍(lán)藻水華已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)和趨勢。溶藻細(xì)菌的溶藻方式分為直接溶藻和間接溶藻[15-16]。直接溶藻是指溶藻細(xì)菌與藻細(xì)胞直接接觸，通過破壞藻細(xì)胞的結(jié)構(gòu)達(dá)到溶藻效果；間接溶藻是指溶藻細(xì)菌通過分泌代謝產(chǎn)物或細(xì)胞外物質(zhì)來抑制藻類的生長，如抗生素、多肽、蛋白質(zhì)等。崔亞青等[17]從太湖水域分離得到一株水單胞菌屬的溶藻細(xì)菌，菌體無溶藻作用，主要是通過代謝產(chǎn)物達(dá)到溶藻的效果，與本研究發(fā)現(xiàn)的蠟樣芽胞桿菌的溶藻方式一致，屬于間接溶藻細(xì)菌，但其溶藻效果不穩(wěn)定、溶藻效率較低。微生物生長和代謝與很多因素有關(guān)，如培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量等[18]。因此，徐長安等[19]對(duì)溶藻細(xì)菌的培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量等發(fā)酵條件進(jìn)行了單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵條件對(duì)溶藻效果影響顯著。許珂等[20]利用單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)溶藻細(xì)菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，溶藻效率提高了10倍。因此，對(duì)溶藻細(xì)菌培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化是必要的。

4 結(jié) 論

蠟樣芽胞桿菌的最佳培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度39 ℃、轉(zhuǎn)速170 r/min、裝瓶量75 mL、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間為9 h，葉綠素a清除效率可達(dá)86.72%；通過溶藻方式的探究，可以初步判斷蠟樣芽孢桿菌是通過分泌一種耐高溫的代謝產(chǎn)物或是細(xì)胞外物質(zhì)來抑制銅綠微囊藻905生長的，溶藻方式屬于間接溶藻，超聲波處理可能會(huì)破壞這種代謝產(chǎn)物或細(xì)胞外物質(zhì)。

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