奉化江底泥碳、氮、硫轉(zhuǎn)化功能基因的定量研究*

顧 卿 張 旭 葉丹華 鄭 毓 孫 靜 魏 錚 周 瑩

(1.浙江省環(huán)境監(jiān)測中心，浙江 杭州 310015；2.上海大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，上海 200444)

水體中的微生物與區(qū)域環(huán)境有著密切的聯(lián)系，其在物質(zhì)循環(huán)與能量流動中起著非常重要的作用。在水生態(tài)系統(tǒng)中，微生物既是各種有機(jī)物質(zhì)的分解者和轉(zhuǎn)化者，又是物質(zhì)和能量的貯存者，同時有些微生物還是食物鏈中的重要生產(chǎn)者[1]。微生物能直接利用動植物生命活動過程中產(chǎn)生的和死后分解形成的各類碎屑、生物大分子、氨基酸等，在分解過程中釋放營養(yǎng)鹽為水域植物進(jìn)行光合作用提供養(yǎng)分。微生物種類繁多，分布廣泛，根據(jù)微生物的生理特性可將微生物分為不同的功能類群，如產(chǎn)甲烷菌、脂肪降解菌、纖維素降解菌、淀粉降解菌、磷細(xì)菌、氨化細(xì)菌、硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌等。各功能類群的微生物一方面表現(xiàn)在需要特定的生長條件，另一方面表現(xiàn)在物質(zhì)轉(zhuǎn)化中具有特定的功能，它們在生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用。

微生物對環(huán)境條件的變化十分敏感，人類活動(例如污染)引起的水體化學(xué)循環(huán)的改變會導(dǎo)致生境化學(xué)待征變化，因而從種類、數(shù)量和質(zhì)量上影響生境中的生物群落，微生物功能類群的種類、數(shù)量、分布及變動直接反映著所處生境的污染狀態(tài)[2]。本研究以奉化江為研究對象，采集奉化江4大支流及干流下游斷面底泥中的微生物，以碳、氮、硫關(guān)鍵轉(zhuǎn)化功能基因作為分子標(biāo)記，對不同的功能類群微生物的豐度進(jìn)行定量研究。分析河流底泥的碳、氮、硫轉(zhuǎn)化的功能基因豐度與主要環(huán)境影響因子的相關(guān)性，了解河流底泥物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化過程的主要影響因素，從而為河流水質(zhì)調(diào)控提供參考。

表1 不同采樣點(diǎn)底泥理化性質(zhì)

注：1)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計。

1 材料與方法

1.1 底泥采集與理化性質(zhì)分析

底泥樣品采自寧波市奉化江及其支流，共設(shè)22個采樣點(diǎn)，每個采樣點(diǎn)用抓斗式采樣器采集表層沉積物，每個采樣點(diǎn)取3個重復(fù)樣，貯存于無菌自封袋中，置于干冰中迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃冰箱保存，并盡快提取DNA。

1.2 DNA提取

底泥DNA采用土壤DNA提取試劑盒(美國MoBio UltraClean公司)提取，提取的DNA用Nanodrop 2000c紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)檢測濃度與純度，并在-20 ℃下保存。

1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備

以樣品DNA為模板，進(jìn)行各個功能基因的普通PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件參考表2。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶，由DNA凝膠回收試劑盒(美國Axygen公司)回收純化，用pGEM-T克隆載體試劑盒(美國Promega公司)進(jìn)行純化產(chǎn)物的酶連，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞JM109，在氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，選取陽性克隆(白斑)擴(kuò)繁菌液進(jìn)行測序分析，進(jìn)一步鑒定克隆結(jié)果。菌液質(zhì)粒采用 QIAprep試劑盒(德國Qiagen公司)提取，測定其濃度并計算拷貝數(shù)，以十倍梯度進(jìn)行梯度稀釋，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，各功能基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)見表2。

1.3.2 熒光定量PCR

使用iQ5型熒光PCR儀(美國Bio Rad 公司)對不同功能基進(jìn)行定量擴(kuò)增。定量PCR體系：染料法熒光定量試劑(SYBR premix Ex Taq) 10.0 μL，20 μmol/L上下游引物各0.5 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水補(bǔ)充至20 μL。

表2 各功能基因引物序列及定量PCR擴(kuò)增程序和標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)

注：1)氨氧化古菌硝化基因amoA；2)氨氧化細(xì)菌硝化基因amoA；3)R2為標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)，l為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，E為擴(kuò)增效率。

1.4 統(tǒng)計分析

采用 OriginPro 8和Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和制圖，SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(AVNOA)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 碳轉(zhuǎn)化功能基因定量分析

以單位質(zhì)量DNA提取基因的拷貝數(shù)表征基因豐度，對奉化江底泥樣品中各功能基因進(jìn)行定量分析，2種碳轉(zhuǎn)化功能基因(產(chǎn)甲烷基因mcrA與甲烷氧化基因pmoA)的定量分析結(jié)果見圖1。由圖1可見，干流下游mcrA的豐度顯著高于上游，可能受到下游溶解氧和養(yǎng)分的影響，奉化江干流下游養(yǎng)分較多，微生物消耗大量溶解氧，造成底泥的厭氧環(huán)境，有利于碳的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了產(chǎn)甲烷菌的生長。而pmoA的豐度在支流下游(采樣點(diǎn)DJL、SWC、CXA)、支流上游中的匯合處(采樣點(diǎn)SHC)、干流下游(采樣點(diǎn)HSP、LXH)較高，這可能與溶解氧和甲烷的存容相關(guān)。分析原因，由于干流下游采樣點(diǎn)TC和有機(jī)碳含量較高，促進(jìn)了產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的生長，從而促進(jìn)了底泥中碳的轉(zhuǎn)化。

碳循環(huán)是自然界基本的物質(zhì)循環(huán)之一，碳轉(zhuǎn)化功能類群微生物對所處生境的變化十分敏感，群落結(jié)構(gòu)會迅速發(fā)生變化來適應(yīng)各種有機(jī)或無機(jī)污染物的變化[14]。淡水沉積物每年對甲烷排放的貢獻(xiàn)率占40%～50%[15]。表層沉積物中存在著活躍的甲烷氧化和甲烷生成循環(huán)，而微生物對有機(jī)物礦化作用主要發(fā)生在深層淡水沉積物的厭氧環(huán)境中[16]。厭氧環(huán)境中，古菌中的產(chǎn)甲烷古菌對甲烷產(chǎn)生起著重要作用；而好氧環(huán)境下，產(chǎn)甲烷細(xì)菌的作用相對更多一些，并且不同水深處的功能細(xì)菌也有較大差別[17]。DEUTZMANN等[18]在研究貧營養(yǎng)湖康士坦茨湖底泥時發(fā)現(xiàn)，底泥中存在著顯著的甲烷氧化活動，甲烷氧化活動和NC10屬的甲烷氧化菌有關(guān)， 底泥中pmoA基因豐度較高。KOJIMA等[19]在研究中等營養(yǎng)的日本琵琶湖時得出相似結(jié)論，NC10屬的Methylomirabilisoxyfera菌是優(yōu)勢菌種，湖底表層沉積物為其提供一個穩(wěn)定環(huán)境，是該菌種生長的良好棲息地。

圖1 底泥樣品中碳轉(zhuǎn)化功能基因(mcrA、pmoA)的豐度Fig.1 The abundance of functional genes involved in carbon transformation (mcrA and pmoA) in the sediments

2.2 氮轉(zhuǎn)化功能基因定量分析

底泥樣品中固氮基因nifH和硝化基因AOA、AOB的豐度見圖2。由圖2可見，奉化江底泥樣品中nifH的豐度為4.39×103～1.41×104拷貝數(shù)/ng，支流上游(采樣點(diǎn)XKN、SD、XK-Ⅱ、SHC、TT)中nifH的豐度要顯著高于奉化江干流下游(采樣點(diǎn)CHL、SHQ、HSP)。奉化江底泥中AOA和AOB的豐度差異不顯著，其中采樣點(diǎn)SD、FJA、DJL、SWC、DTZ的AOB豐度顯著高于AOA，說明以上點(diǎn)位屬于富營養(yǎng)區(qū)域，其他采樣點(diǎn)的AOA豐度均大于AOB。

淡水生態(tài)系統(tǒng)的反硝化作用對全球氮損失的貢獻(xiàn)率約為19%[20]。淡水中的微生物參與到氮循環(huán)的各個機(jī)制有氮的固定、氨化、氨氧化、硝化和反硝化作用[21]。由于淡水生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)中同時存在硝化作用和反硝化作用，二者互相影響，對于保持水圈、生物圈和大氣圈氮的動態(tài)平衡均起著相當(dāng)重要的作用。SANTORO等[22]對地下河口沉積物中AOB和AOA基因豐度的研究中發(fā)現(xiàn)，AOA在低氧、微鹽環(huán)境中是AOB的10倍，但在好氧環(huán)境中AOB卻是AOA的約30倍。

底泥樣品中反硝化基因(nirK，nirS,nosZ)的豐度見圖3。由圖3可見，奉化江干流下游采樣點(diǎn)的反硝化基因(nirS,nosZ)豐度總體高于支流，尤其是HSP、LXH兩個采樣點(diǎn)的nirS基因豐度分別高達(dá)9.56×103、7.69×103拷貝數(shù)/ng，Nir屬于亞硝酸鹽還原酶，能催化亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為氧化氮，這是反硝化過程中最重要的限速步驟，也是反硝化作用有別于其他硝酸鹽代謝的標(biāo)志性反應(yīng)，而Nir是催化此反應(yīng)的限速酶。HSP、LXH兩個采樣點(diǎn)有機(jī)質(zhì)含量較高，可能促進(jìn)了反硝化作用導(dǎo)致nirS基因豐度較高。一氧化二氮還原酶(Nos)用于催化一氧化二氮至氮?dú)獾霓D(zhuǎn)化過程，普遍認(rèn)為其活性受到溶解氧的限制。由于該酶催化反硝化的最后一步，終產(chǎn)物為氮?dú)?，因此nosZ基因常常被作為檢測可進(jìn)行完全反硝化作用的微生物。在底泥樣品中發(fā)現(xiàn)下游的nosZ基因總體高于上游清潔點(diǎn)，說明下游的反硝化作用要強(qiáng)于上游，這與河流底泥中的溶解氧、養(yǎng)分有關(guān)。然而，支流上游SHC采樣點(diǎn)nosZ基因豐度達(dá)1.83×103拷貝數(shù)/ng，這是因?yàn)镾HC采樣點(diǎn)的有機(jī)碳含量較高，微生物降解有機(jī)質(zhì)消耗水中的溶解氧，造成底泥的厭氧環(huán)境促進(jìn)了反硝化菌的生長和反硝化過程。nirK基因與nirS基因趨勢相反，在上游清潔點(diǎn)的含量較高，如FJA、TT等采樣點(diǎn)，這可能與沉積物理化性質(zhì)不同有關(guān)。GASPAR等[23]在研究切薩皮克灣沉積物中與氮循環(huán)相關(guān)的功能基因豐度特征時發(fā)現(xiàn)，鹽度、無機(jī)氮和溶解有機(jī)碳對amoA、nifH、nirK、nirS的分布均有較大影響。

注：由于樣品采集的原因，部分?jǐn)?shù)據(jù)缺失。圖3同。圖2 底泥樣品中固氮基因(nifH)和硝化基因(AOA、AOB)的豐度Fig.2 The abundance of functional genes involved in nitrogen fixation (nifH) and nitrification (AOA and AOB) in the sediments

2.3 硫轉(zhuǎn)化功能基因定量分析

奉化江河流底泥中存在著較豐富的硫化物，因此底泥中存在一定數(shù)量的硫轉(zhuǎn)化功能菌，包括硫氧化菌(soxB基因)和硫酸鹽還原菌(dsrB基因)。奉化江底泥樣品中硫轉(zhuǎn)化功能基因(dsrB，soxB)的豐度見圖4。由圖4可見，CXA采樣點(diǎn)的dsrB豐度最大，達(dá)到1.16×103拷貝數(shù)/ng，DJL采樣點(diǎn)的soxB豐度最大，達(dá)到2.45×103拷貝數(shù)/ng，兩個采樣點(diǎn)均位于居民區(qū)，底泥中硫酸鹽含量顯著高于其他采樣點(diǎn)，因此促進(jìn)了硫的地球化學(xué)轉(zhuǎn)化。

硫元素在淡水中的復(fù)雜轉(zhuǎn)化是河流湖泊黑臭的重要原因之一，硫元素轉(zhuǎn)化的同時也會對碳、氮、磷等元素的循環(huán)產(chǎn)生一定影響。淡水沉積物中硫的氧化還原與硫酸鹽還原菌和硫氧化菌關(guān)系密切，但目前對此方面的研究相對較少[24]。王明義等[25]用稀釋培養(yǎng)測數(shù)法(MPN)測定阿哈湖沉積物中硫酸鹽還原菌，并對比湖底沉積物中和海洋沉積物中硫酸鹽還原菌含量，發(fā)現(xiàn)淡水湖泊沉積物中硫酸鹽還原菌有102～103個/g，低于海洋沉積物幾個數(shù)量級。同時，硫酸鹽還原菌也呈現(xiàn)季節(jié)和空間分布差異，秋季含量高于春季；一定深度范圍內(nèi)，隨著深度增加，硫酸鹽還原菌含量增加。SASS等[26]和LI等[27]也得到相似結(jié)論。

圖3 底泥樣品反硝化基因(nirK、nirS、nosZ)的豐度Fig.3 The abundance of functional genes involved in denitrification (nirK,nirS and nosZ) in the sediments

2.4 微生物基因豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性分析

3 結(jié) 論

(1) 干流下游采樣點(diǎn)TC和TOC含量較高，促進(jìn)了產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的生長，從而促進(jìn)了底泥中碳的轉(zhuǎn)化，奉化江干流下游的碳轉(zhuǎn)化基因mcrA豐度顯著高于上游清潔點(diǎn)，受溶解氧和甲烷存容影響，pmoA的豐度在支流下游、支流上游匯合處、干流下游較高。

(2) 采樣點(diǎn)SD、FJA、DJL、SWC、DTZ的AOB豐度顯著高于AOA，說明以上點(diǎn)位屬于富營養(yǎng)區(qū)域，其他采樣點(diǎn)的AOA豐度均大于AOB。

圖4 底泥樣品硫轉(zhuǎn)化功能基因(soxB、dsrB)的豐度Fig.4 The abundance of functional genes involved in sulfur transformation (soxB and dsrB) in the sediments

功能基因pHTCTOCTNNH+4NO-3SO2-4Fe3+mcrA-0.0520.2860.3220.169-0.251-0.004-0.249-0.083pmoA-0.3300.3460.3210.576**0.106-0.0160.2160.058dsrB0.156-0.250-0.2080.292-0.245-0.1670.048-0.149soxB-0.2620.2300.0140.3300.092-0.0010.174-0.048nifH-0.0150.323-0.0490.1970.208-0.307-0.024-0.384AOA-0.3060.124-0.011-0.1070.3840.0980.168-0.159AOB-0.3180.0580.2010.2580.2630.679**0.2720.321nirK0.134-0.024-0.0800.0560.2520.374-0.1290.195nirS-0.0920.3930.2550.331-0.1590.021-0.188-0.080nosZ-0.3720.615**0.4060.588**0.272-0.0170.2170.111

注：1)**表示差異達(dá)到1%極顯著水平。

(3) 奉化江底泥樣品中，干流下游的nosZ基因顯著高于上游清潔點(diǎn)，說明下游的反硝化作用要強(qiáng)于上游。

(4) 居民區(qū)附近采樣點(diǎn)河流底泥中硫轉(zhuǎn)化功能基因豐度相對較大，其中硫還原基因dsrB豐度最高達(dá)1.16×103拷貝數(shù)/ng，硫氧化基因soxB豐度最高達(dá)2.45×103拷貝數(shù)/ng。

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