應(yīng)用形態(tài)學(xué)及動力學(xué)參數(shù)篩選優(yōu)質(zhì)囊胚的研究進(jìn)展

魏明明，何玉潔

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·綜述·

應(yīng)用形態(tài)學(xué)及動力學(xué)參數(shù)篩選優(yōu)質(zhì)囊胚的研究進(jìn)展

魏明明，何玉潔△

囊胚的質(zhì)量在選擇性單囊胚移植（elective single blastocyst transfer，eSBT）中至關(guān)重要，移植1個優(yōu)質(zhì)的囊胚，可以有效降低多胎率并保持較高的臨床妊娠率。目前，囊胚質(zhì)量的評價方法仍以形態(tài)學(xué)為主。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)評分法對各形態(tài)學(xué)參數(shù)進(jìn)行綜合評分，得分高的囊胚質(zhì)量較優(yōu)。但當(dāng)有2個以上綜合評分相同的囊胚可供移植時，需要新的指標(biāo)來選擇出最具有發(fā)育潛力者。研究顯示，囊胚的3個相互獨立的形態(tài)學(xué)參數(shù)：內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cellmass，ICM）、滋養(yǎng)層（trophectoderm，TE）和囊胚擴(kuò)張程度三者對妊娠結(jié)局的預(yù)測價值不同，可以為囊胚的進(jìn)一步篩選提供參考。近年來，應(yīng)用延時（time-lapse）成像技術(shù)可以動態(tài)觀察胚胎發(fā)育的全過程，原核期、卵裂期以及囊胚期的動力學(xué)參數(shù)成為了囊胚質(zhì)量評價的新指標(biāo)。綜述應(yīng)用形態(tài)學(xué)及動力學(xué)參數(shù)篩選優(yōu)質(zhì)囊胚的研究進(jìn)展。

受精，體外；胚胎移植；囊胚；形態(tài)發(fā)生；動力學(xué)

【Abstract】The blastocyst quality is very important for the elective single blastocyst transfer（eSBT）.The multiple pregnancy rate can be effectively reduced，and the clinical pregnancy rate can be kept at a higher level，by transplanting a high-quality blastocyst.At present，the main method to evaluate the quality of blastocysts is morphology.The morphological parameters were comprehensively scored by the traditionalmorphological scoring method，which means that the blastocystwith higher score is of the better quality.However，when there aremore than two blastocysts with the same score，new indicators are necessary for embryologists to select the blastocyst with the most developmental potential for transplantation.Three independent morphological parameters of blastocyst，inner cell mass（ICM），trophectoderm（TE）and degree of blastocyst expansion with the different predictive value for the pregnancy outcomes，can provide additional references for the further screening of the blastocyst.In recent years，the whole process of embryonic development can be observed dynamically by timelapse imaging technology.The kinetic parameters of pronuclear stage，cleavage stage and blastocyst stage were tried as the new index for evaluating the quality of embryo.In this article，we reviewed the research progress on the screening high quality blastocyst bymorphological and kinetic parameters.

【Keywords】Fertilization in vitro；Embryo transfer；Blastula；Morphogenesis；Kinetics

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：308-312）

隨著輔助生殖技術(shù)（assisted reproductive technology，ART）日漸成熟，體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）的胚胎移植率、著床率、妊娠率均有明顯的提高。由于囊胚比卵裂期胚胎更加符合妊娠生理，因此有更好的妊娠結(jié)局［1］。為避免導(dǎo)致多胎妊娠，臨床工作者逐漸認(rèn)可選擇性單囊胚移植（elective single blastocyst transfer，eSBT）［2］。在eSBT中，囊胚質(zhì)量關(guān)系到妊娠結(jié)局，所以如何有效評價囊胚質(zhì)量，選擇一個優(yōu)質(zhì)囊胚進(jìn)行移植，變得尤為重要。目前囊胚的評價方法包括形態(tài)學(xué)、代謝組學(xué)、基因組學(xué)，目前常用的是Gardner等［3］提出的囊胚標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)評分方法。由于可選擇囊胚數(shù)量的增加，各個獨立的形態(tài)參數(shù)對臨床妊娠的重要性也逐漸引起輔助生殖領(lǐng)域的重視。并且，早期的囊胚標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)評分均是在離散時間點對囊胚進(jìn)行觀察，這限制了選擇最佳胚胎的信息量。而近年興起的延時（time-lapse）成像技術(shù)則彌補了這個不足。一些在胚胎發(fā)育過程中新的動力學(xué)指標(biāo)有助于胚胎學(xué)家更有效地評價胚胎質(zhì)量，并且在臨床上取得了一定的效果。

作者單位：030001太原，山西醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院（魏明明）；山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院（何玉潔）

通信作者：何玉潔，E-mail：hyj7007@163.com

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審校者

1　形態(tài)學(xué)參數(shù)綜合評分

卵母細(xì)胞受精后第5天（D5）有可能發(fā)育到囊胚期，細(xì)胞間開始形成囊腔，其內(nèi)充滿液體。形成囊胚后，細(xì)胞開始分化，形成滋養(yǎng)層（trophectoderm，TE）細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（inner cellmass，ICM）細(xì)胞兩種不同的細(xì)胞成分。由于不同質(zhì)量的胚胎發(fā)育速度不一致，有的胚胎可能在受精后D6、D7甚至更晚才形成囊胚。已有研究證實，較早形成的囊胚發(fā)育潛能更佳，移植后可獲得更好的妊娠結(jié)局［4-5］。目前，國內(nèi)外的共識是在受精后D5～D6對囊胚進(jìn)行篩選及移植。

Dokras等［6］最早提出了一個簡易囊胚評分系統(tǒng)，根據(jù)囊胚的發(fā)育速度將囊胚分為3級。1級：D5或D6形成的ICM和TE、清晰的擴(kuò)張囊胚；2級：比1級囊胚發(fā)育延遲24～48 h，D6或D7形成與1級囊胚形態(tài)相似的胚胎；3級：體外培養(yǎng)5～7 d形成的囊胚發(fā)育差、ICM和TE內(nèi)有退化區(qū)域的囊胚。該方法雖然簡單，卻是一個直觀完整的指導(dǎo)囊胚篩選的形態(tài)學(xué)評分體系，為此后囊胚形態(tài)學(xué)評分的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

2000年Gardner等［3］提出了一個綜合囊胚擴(kuò)張程度、ICM和TE發(fā)育的形態(tài)學(xué)評分方法。用1～6的連續(xù)數(shù)字將囊胚按照擴(kuò)張程度和孵化狀態(tài)進(jìn)行區(qū)分，已經(jīng)擴(kuò)張的囊胚，則進(jìn)一步對ICM和TE進(jìn)行質(zhì)量分級，均分成A、B、C三級。并通過實驗證實移植一個高評分的囊胚，可以在保持妊娠率較高的同時降低多胎率。此后，有研究也證實了此囊胚評分方法的有效性［7］。Gardner評分法作為囊胚形態(tài)學(xué)評分及研究的傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)，在國內(nèi)外廣泛沿用至今。

2　獨立形態(tài)學(xué)參數(shù)

雖然有研究表明2個或2個以上形態(tài)學(xué)參數(shù)得分最高的囊胚進(jìn)行移植，可以實現(xiàn)最高的植入率［7］。但3個形態(tài)學(xué)參數(shù)具有獨立性，ICM將來發(fā)育為胎兒，TE發(fā)育為與母體連接的胎盤，囊胚擴(kuò)張程度也一定程度上體現(xiàn)出胎兒的發(fā)育潛能。所以，在eSBT中，當(dāng)有多個綜合評分相同但獨立形態(tài)學(xué)參數(shù)評分不同的囊胚可供移植時，即當(dāng)有Gardner綜合評分為4AB（分別代表囊胚擴(kuò)張程度，ICM和TE）與4BA的囊胚同時存在，給囊胚的選擇帶來了困惑。這些囊胚可能在發(fā)育潛能上有一定差異，當(dāng)選擇最佳囊胚時可以利用這種差異。但Gardner評分法在對囊胚的發(fā)育潛能了解上具有局限性，因此要作出這一決定，有必要了解每個形態(tài)參數(shù)對囊胚植入過程的貢獻(xiàn)。

2.1ICM ICM的研究曾經(jīng)成為預(yù)測囊胚移植成功的關(guān)鍵，并且認(rèn)為ICM是囊胚移植后臨床結(jié)局的最好預(yù)測因子［8-9］。2001年，Richter等［8］研究發(fā)現(xiàn)，囊胚擴(kuò)張程度和TE數(shù)量與種植率無關(guān)，培養(yǎng)至D5擁有最佳大小和形狀的ICM的囊胚植入率最高。提示ICM的數(shù)量高度顯示囊胚植入潛能，但其研究的重點放在用來定義一個最優(yōu)的ICM，TE形態(tài)只是基于橫斷面的細(xì)胞計數(shù)，不包括評價TE的大小和形狀，影響到了結(jié)果的判斷價值。之后，一項以Gardner評分為基礎(chǔ)的研究，比較了3個獨立形態(tài)學(xué)參數(shù)對妊娠結(jié)局的預(yù)測作用后提出，只有ICM等級與早期妊娠丟失率顯著相關(guān)，該研究認(rèn)為移植時選擇ICM A級的囊胚可顯著減少早期流產(chǎn)發(fā)生，提示了在Gardner評分上ICM預(yù)測囊胚能力的重要性［10］。

2.2TE近年更多的研究認(rèn)為TE評分較ICM更能預(yù)測臨床結(jié)局。2011年，Ahlstr?m等［11］研究發(fā)現(xiàn)，TE細(xì)胞形態(tài)是預(yù)測出生結(jié)局最重要的形態(tài)學(xué)參數(shù)。雖然囊胚腔擴(kuò)張和ICM形態(tài)在進(jìn)行單因素和多因素分析中是顯著的預(yù)測因子，但在多元Logistic回歸分析中并不是活產(chǎn)的顯著預(yù)測因子。Kovacic等［9］在研究中描述了一個囊胚分級系統(tǒng)，依據(jù)囊胚的3個獨立形態(tài)學(xué)參數(shù)將囊胚分為8個形態(tài)等級（B1～B8），B1～B8的囊胚移植結(jié)果顯示了植入率與出生率的顯著降低。其結(jié)論是一個正常的ICM是囊胚植入的最重要參數(shù)，但從囊胚B1到B2的分類中，唯一的形態(tài)差異是TE的等級差別，這種等級差別導(dǎo)致了活產(chǎn)率降低13%（45.2%vs.32.8%）。同樣，Ahlstr?m等［11］的研究也指出，當(dāng)TE形態(tài)從A下降到B時，活產(chǎn)率下降16% （49.9%vs.33.9%），這說明當(dāng)一個正常的ICM存在時，TE可影響出生率。此后有研究提出，更好的TE形態(tài)、更年輕的患者以及囊胚的進(jìn)一步培養(yǎng)都可以獲得較高的臨床妊娠率和活產(chǎn)率，但TE形態(tài)是最佳囊胚移植的關(guān)鍵因素［12］。且有國外學(xué)者對1 087個冷凍SBT中3個獨立形態(tài)學(xué)參數(shù)對妊娠結(jié)局的預(yù)測能力進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，僅TE形態(tài)與臨床持續(xù)妊娠率和流產(chǎn)率有關(guān)［13］。有研究對囊胚擴(kuò)張程度進(jìn)行限定，將TE 與ICM對妊娠結(jié)局的預(yù)測能力進(jìn)行了比較，也認(rèn)為TE是最重要的預(yù)測因子［14］。一項對194個整倍體胚胎和238個非整倍體胚胎的研究發(fā)現(xiàn)，TE形態(tài)可能與非整倍體有關(guān)。相對于好的TE形態(tài)，TE形態(tài)較差的囊胚非整倍體發(fā)生率上升2.5倍，且這種對非整倍體的影響出現(xiàn)在囊胚期而不是卵裂期，凸顯了TE形態(tài)在囊胚質(zhì)量評價中的優(yōu)勢［15］。

2.3囊胚擴(kuò)張程度2013年，Thompson等［12］對3 151例新鮮SBT進(jìn)行了回顧性分析發(fā)現(xiàn)，除TE形態(tài)是最佳囊胚移植的關(guān)鍵因素外，囊胚擴(kuò)張程度也可在一定程度上預(yù)測出生結(jié)局。但有研究結(jié)果顯示，囊胚擴(kuò)張程度對妊娠結(jié)局無顯著的預(yù)測價值［11，13］。由于解凍周期過程比新鮮周期過程更復(fù)雜，針對此過程是否會對囊胚產(chǎn)生影響，Ahlstr?m等［16］對預(yù)凍和解凍后囊胚的重新擴(kuò)張程度進(jìn)行了研究，認(rèn)為預(yù)凍囊胚擴(kuò)張程度、TE等級和重新擴(kuò)張程度是解凍后囊胚移植出生率的最重要預(yù)測因素。但解凍后囊胚重新擴(kuò)張程度是否對妊娠結(jié)局具有預(yù)測作用，由于研究較少，目前無比較的價值，這也是未來囊胚形態(tài)學(xué)研究關(guān)注的重點。

許多IVF實驗室沒有適當(dāng)?shù)淖C據(jù)，ICM一直被認(rèn)為是最重要的預(yù)測妊娠/生育的因素［8-10］，主要理由是ICM細(xì)胞可以引起胎兒生長。然而，近年的研究表明，在囊胚移植過程中，TE對臨床結(jié)局的預(yù)測價值更加顯著，如果沒有一個功能性TE建立的著床，ICM在母體內(nèi)的發(fā)展就很難發(fā)生［11-16］。所以，在eSET中，當(dāng)有綜合評分為4AB和4BA的囊胚可供選擇時，應(yīng)該優(yōu)先選擇4BA的囊胚進(jìn)行移植。而囊胚擴(kuò)張程度是否具有預(yù)測價值，仍在不斷探索中。

3動力學(xué)參數(shù)

胚胎早期發(fā)育主要經(jīng)歷原核期、卵裂期及囊胚期三個連續(xù)的過程。囊胚標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)學(xué)評分在靜態(tài)觀察下對囊胚進(jìn)行篩選，一定程度上限制了對優(yōu)質(zhì)囊胚的判斷。近年來，延時（time-lapse）成像技術(shù)逐漸應(yīng)用于胚胎培養(yǎng)并得到不斷改進(jìn)［17］，最新的延時成像技術(shù)已可以在盡量減少對胚胎影響的同時，動態(tài)地觀察胚胎早期發(fā)育的全過程。動物模型研究提示：植入前胚胎的行為特點是反映囊胚形成能力、囊胚質(zhì)量以及妊娠結(jié)局的一個重要依據(jù)［18-19］。隨著該項技術(shù)在臨床的推廣應(yīng)用，越來越多的研究期望從中找出具有預(yù)測囊胚質(zhì)量以及妊娠結(jié)局價值的動力學(xué)指標(biāo)，以彌補現(xiàn)有囊胚形態(tài)評分的不足。

3.1原核期、卵裂期動力學(xué)參數(shù)2008年，Lemmen等［20］報道了采用延時成像技術(shù)觀察胚胎由受精卵到卵裂期的相關(guān)動力學(xué)參數(shù)的研究，認(rèn)為原核消失時間早的胚胎發(fā)育潛能更好。此后，有研究用延時成像觀察了受精后14～15 h、16～18 h、19～20 h這3個時間段內(nèi)原核核仁前體分布情況的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在3個時間間隔的核仁分布發(fā)生著不斷改變，認(rèn)為常規(guī)19～20 h靜態(tài)觀察，可能造成對胚胎質(zhì)量的誤判，實時動態(tài)觀察法更為可靠，可以獲得更多對胚胎篩選有價值的觀測指標(biāo)［21］。

2010年，Wong等［22］的研究指出，胚胎前3次分裂的時間能夠準(zhǔn)確地預(yù)測囊胚形成的能力，提示了囊胚的形成與卵裂期動力學(xué)參數(shù)有關(guān)；2012年，Hlinka等［23］的研究中，連續(xù)觀察胚胎裂解到16-細(xì)胞階段，提出能夠成功妊娠的囊胚在前期的培養(yǎng)中有一致的卵裂模式和間隔；有研究對延時成像中觀察到的動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示從2-細(xì)胞到8-細(xì)胞分裂的同步性是預(yù)測囊胚形成和質(zhì)量的最佳指標(biāo)［24］；Hashimoto等［25］將形態(tài)學(xué)綜合評分與動力學(xué)參數(shù)相結(jié)合，比較了囊胚質(zhì)量與完成第2次及第3次有絲分裂所需時間，結(jié)果顯示評分高的囊胚比評分低的囊胚完成2次分裂所需的時間短；Cruz等［26］的研究也指出，囊胚的形態(tài)學(xué)參數(shù)與前期胚胎發(fā)育的動力學(xué)參數(shù)有關(guān)，卵裂期胚胎的動力學(xué)參數(shù)影響囊胚質(zhì)量的評價。另有研究表明卵裂期細(xì)胞碎片也一定程度上影響了囊胚的質(zhì)量和妊娠結(jié)局［27］。

隨著越來越多與胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局相關(guān)的動力學(xué)參數(shù)的發(fā)現(xiàn)，有學(xué)者建立了一個基于延時成像動力學(xué)參數(shù)預(yù)測囊胚發(fā)育的多因素回歸模型，模型中納入的動力學(xué)參數(shù)包括由受精開始到胚胎分裂成2，3，4和5卵裂球的連續(xù)的時間過程，以及每一個過程之間的時間間隔，結(jié)果顯示發(fā)育到囊胚的各胚胎預(yù)測參數(shù)的大小與沒有發(fā)育到囊胚階段相比有顯著差異［28］。最近Milewski等［29］建立了一個預(yù)測囊胚移植后妊娠結(jié)局的動力學(xué)參數(shù)回歸模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)植入組與非植入組的參數(shù)差異顯著。以上模型的建立，體現(xiàn)了動力學(xué)參數(shù)包含的信息對囊胚質(zhì)量及妊娠結(jié)局的重要價值，可以為優(yōu)質(zhì)囊胚的篩選提供更多的幫助。

3.2囊胚期動力學(xué)參數(shù)近年隨著胚胎培養(yǎng)技術(shù)及延時成像技術(shù)的不斷成熟，逐漸發(fā)現(xiàn)了不易觀察到的囊胚期動力學(xué)參數(shù)。研究者開始嘗試將這些參數(shù)納入預(yù)測囊胚發(fā)育潛能及妊娠結(jié)局的模型中，探尋更加全面的胚胎篩選方式。Motato等［30］建立了一個預(yù)測囊胚形成及植入的動力學(xué)參數(shù)回歸模型，結(jié)果顯示囊胚擴(kuò)張時間可以預(yù)測囊胚植入。另有研究顯示，囊胚擴(kuò)張時間是囊胚質(zhì)量的最佳預(yù)測參數(shù)，并提出篩選優(yōu)質(zhì)囊胚的動力學(xué)參數(shù)模型應(yīng)包含囊胚擴(kuò)張時間［31］。

在囊胚期的觀察中，會發(fā)現(xiàn)部分囊胚的囊腔收縮（皺縮），持續(xù)時間通常不超過1 h。傳統(tǒng)靜態(tài)觀察方式通常是在囊胚再擴(kuò)張后進(jìn)行評價，忽略了這一時期的動力學(xué)改變。而早期已有研究對小鼠囊胚的收縮進(jìn)行延時觀察并發(fā)現(xiàn)，囊胚在形成10 h后有不同程度的重復(fù)收縮，弱的收縮（體積減少＜20%）有利于囊胚孵化，而強大的收縮（體積減少≥20%）抑制孵化，提示了囊胚的收縮可能對胚胎的發(fā)育能力產(chǎn)生影響［32］。Marcos等［33］應(yīng)用延時成像觀察了囊胚的崩潰（強烈收縮）過程（囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞表面自透明帶分離≥50%）及胚胎種植率，結(jié)果顯示崩潰的囊胚相比于無崩潰的囊胚植入率顯著降低（35%vs. 48.5%），認(rèn)為囊胚崩潰模式可以作為囊胚篩選的額外標(biāo)準(zhǔn)。但近期有學(xué)者對囊胚崩潰與出生率的相關(guān)性進(jìn)行了多因素分析后發(fā)現(xiàn)，囊胚崩潰不是顯著的預(yù)測因素，提出囊胚崩潰模式不應(yīng)單獨作為生殖預(yù)后的預(yù)測因素，應(yīng)與預(yù)測生殖結(jié)局的其他動力學(xué)變量協(xié)同考慮［34］。

有研究指出：無論是通過靜態(tài)或動態(tài)觀測，囊胚培養(yǎng)應(yīng)用的增加，可能放緩基于胚胎發(fā)育早期階段質(zhì)量評價指標(biāo)的研究［35］。因此，隨著目前可移植囊胚數(shù)量的增加，囊胚培養(yǎng)階段的動力學(xué)參數(shù)將是未來研究的重點，也將為優(yōu)質(zhì)囊胚的篩選提供更多的參考。

4結(jié)語

綜上所述，在囊胚質(zhì)量的評價上，形態(tài)學(xué)仍是一個不可忽略的重要方法。eSBT中，優(yōu)質(zhì)囊胚的選擇應(yīng)從形態(tài)學(xué)評價開始。通過進(jìn)一步的前瞻性研究，與獨立形態(tài)參數(shù)對預(yù)測妊娠結(jié)局的重要性上達(dá)成統(tǒng)一，為進(jìn)一步的篩選提供幫助。2011年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會（ESHRE）對卵母細(xì)胞和胚胎形態(tài)學(xué)評價進(jìn)行了總結(jié)，為確定植入潛力最高的胚胎，提出了一種以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，聯(lián)合延時成像分析新參數(shù)的胚胎質(zhì)量評價模式［36］。這種模式在囊胚質(zhì)量的評價上結(jié)合了形態(tài)學(xué)和動力學(xué)參數(shù)后更加完善，但要逐漸應(yīng)用于臨床還需進(jìn)一步的研究。

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［本文編輯秦娟］

Screening High Quality Blastocyst by M orphological and K inetic Parameters

WEIMing-ming，HE Yu-jie. Clinical Medicine College of ShanxiMedical University，Taiyuan 030001，China（WEIMing-ming）；First Hospital of ShanxiMedical University，Tiayuan 030001，China（HE Yu-jie）

HE Yu-jie，E-mail：hyj7007@163.com

（2016-03-23）