人凝血因子Ⅷ在基因工程中的研究進展

江婉蓉 王珍 何遵衛(wèi)

人凝血因子Ⅷ在基因工程中的研究進展

江婉蓉 王珍 何遵衛(wèi)

目的 因原料血漿不足，作為治療血友病A的唯一有效用藥人凝血因子Ⅷ資源短缺，而運用基因工程生產(chǎn)的重組人凝血因子Ⅷ能很好的解決這些問題。本文從人凝血因子Ⅷ的結(jié)構(gòu)改造、載體及表達系統(tǒng)、基因治療和前沿基因編輯技術(shù)的應(yīng)用等幾個方面對FⅧ在基因工程中的研究進行總結(jié)及展望。

重組人凝血因子Ⅷ；基因工程；基因治療

人凝血因子Ⅷ作為治療凝血障礙性疾病血友病A的惟一有效用藥，主要有兩個來源。一是血漿離心后獲得的冷沉淀中分離的人凝血因子Ⅷ(coagulation factor Ⅷ，F(xiàn)Ⅷ)；二是通過基因改造獲得的重組人凝血因子Ⅷ(recombinant FⅧ，rFⅧ)。而利用基因工程手段生產(chǎn)的rFⅧ相比于FⅧ具有以下優(yōu)勢：(1)不受原料血漿產(chǎn)量的限制；(2)患者接受治療后感染病毒性肝炎和艾滋病等傳染性疾病的風險更低；(3)產(chǎn)品的穩(wěn)定性更強。李文卿[1]研究證實了重組人凝血因子Ⅷ在中國血友病A患者的治療中具有較好的有效性、安全性及較低的抑制物產(chǎn)生率。所以，面對國內(nèi)凝血因子Ⅷ短缺、進口國外的基因重組凝血因子產(chǎn)品價格相對昂貴的困境，提高凝血因子Ⅷ的產(chǎn)量和利用率是一方面，另外對重組人凝血因子Ⅷ的研究和開發(fā)，生產(chǎn)中國自己的人重組凝血因子Ⅷ的產(chǎn)品，具有廣闊的應(yīng)用前景和積極的意義。本文從人凝血因子Ⅷ的結(jié)構(gòu)改造、載體及表達系統(tǒng)、基因治療和前沿基因編輯技術(shù)的應(yīng)用等幾個方面對FⅧ在基因工程中的研究進行總結(jié)。

1 人凝血因子Ⅷ的結(jié)構(gòu)及其改造

1.1 人凝血因子Ⅷ的結(jié)構(gòu) 自Wood等[2]克隆人凝血因子Ⅷ的基因，解析了該基因的cDNA序列，并成功表達提取rFⅧ以來，F(xiàn)Ⅷ的基因和蛋白結(jié)構(gòu)逐漸被人們所探知。FⅧ的基因由26個外顯子和25個內(nèi)含子組成，其中14和26兩個外顯子最大，分別為3 106 bp和1 958 bp，全長186 kb，位于X染色體長臂末端，約占整個X染色體的0.1%。FⅧ基因經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、剪切后的mRNA長約9 kb，編碼一條包含2 351個氨基酸殘基的前體。信號肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中被水解后，形成含有2 332個氨基酸殘基，6個結(jié)構(gòu)域的成熟FⅧ單鏈蛋白。

根據(jù)FⅧ內(nèi)部序列的同源性的關(guān)系，F(xiàn)Ⅷ可分為A、B、C三種結(jié)構(gòu)域,其中：A結(jié)構(gòu)域可分為A1、A2、A3三種，每個約含350個氨基酸殘基，具有30%的同源性，A1、A2位于重鏈，A3位于輕鏈；B結(jié)構(gòu)域為重鏈，位于分子的中部，共有908個氨基酸殘基；C結(jié)構(gòu)域位于輕鏈的C端，分為C1、C2，每個約有150個氨基酸殘基，具有40%的同源性。Stoilova-McPhie等[3]通過電子顯微鏡技術(shù)成功得到了FⅧ的晶體結(jié)構(gòu)。FⅧ的A3區(qū)位于細胞膜磷脂雙分子層且緊鄰C1和C2區(qū)；C1區(qū)的長軸與細胞膜平面大約平行且與C2幾乎垂直；A1、A2和A3區(qū)之間互有微小角度且均有2個高度保守的β桶裝結(jié)構(gòu)域。整個分子排列成A1-A2-B-A3-C1-C2[4]。通過與細胞內(nèi)外的多種結(jié)構(gòu)的蛋白和酶之間復(fù)雜的相互作用，從而影響著FⅧ的蛋白質(zhì)活性、跨膜轉(zhuǎn)運和基因表達等。

1.2 人凝血因子Ⅷ結(jié)構(gòu)的改造 盡管重組人凝血因子Ⅷ對于血友病A患者的治療效果顯著，但因人凝血因子Ⅷ的基因較大，表達水平低和極易降解等缺陷，尋找合適的途徑和表達載體顯得尤為重要。通過對FⅧ基因結(jié)構(gòu)的改造，能有效的提高FⅧ在細胞中的表達。當前，對于對FⅧ基因結(jié)構(gòu)的改造有以下幾個方面：(1)缺失B區(qū)：FⅧ的B區(qū)結(jié)構(gòu)域占整個分子的大約40%，但B區(qū)缺失型FⅧ與野生型FⅧ具有相似的生物學(xué)特征，F(xiàn)Ⅷ基因的B區(qū)在加工的過程中被剪切，其與基因表達和凝血功能等關(guān)系不大。且B區(qū)缺失型FⅧ沒有載體包裝容量的的缺陷，表達產(chǎn)物也更為簡單朱甫祥等[5]研究了將FⅧ基因在大腸桿菌中分別表達的重鏈和輕鏈，利用內(nèi)含子介導(dǎo)的蛋白剪切法進行拼接。隨后，將促進重鏈分泌的基因區(qū)導(dǎo)入其中，經(jīng)雙載體共轉(zhuǎn)染的方式，獲得了高活性和高表達量的B區(qū)缺失型FⅧ。Pittman等[6]將FⅧcDNA的若干結(jié)構(gòu)域去除后獲得的B區(qū)缺失型FⅧcDNA插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，基因的表達量不僅比野生型有較大程度提高，而且表達產(chǎn)物的生物特性及免疫原性與野生型相同。另外，美國輝瑞、韓國綠十字等幾家醫(yī)藥公司已有B區(qū)缺失或保留B區(qū)部分氨基酸的重組FⅧ成功上市[7]。(2)定點突變：通過對氨基酸位點的定點突變，減少FⅧ在分泌途中與相關(guān)蛋白結(jié)合，從而提高其表達量；通過特定結(jié)構(gòu)改造的FⅧ能抵制特定蛋白對其作用位點接切后的抑制，增強了FⅧ的穩(wěn)定性。Wakabayashi等[8]通過對包埋在分子內(nèi)部、帶電荷較多的4個位點進行突變，突變產(chǎn)物相比于野生型的凝血活性和熱穩(wěn)定性均有很大程度的提高。細胞內(nèi)蛋白的相互作用會抑制FⅧ的表達。 Miao等[9]設(shè)計了F309S的突變位點，降低FⅧ在分泌過程中與BiP的相互作用；有研究表明通過突變2個半胱氨酸的位點，消除了二硫鍵對分泌蛋白的影響，表達量均有顯著提高[10]。(3)聚乙二醇修飾：聚乙二醇修飾又稱PEG化，是將活化的聚乙二醇與蛋白質(zhì)分子相偶聯(lián)，進而影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)各種生物化學(xué)性質(zhì)的改變。通過PEG化，能增強蛋白質(zhì)分子化學(xué)穩(wěn)定性，提高抵抗蛋白酶水解能力，降低蛋白免疫原性及延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。

進行PEG化的半胱氨酸殘基在B區(qū)缺失型FⅧ中一共含有19個，其中16個以二硫鍵相互配對，另外3個包埋在分子內(nèi)部。所以需要通過定點突變等方法引入新的半胱氨酸殘基進行PEG化。Mei等[11]研究了不同位點引入單個半胱氨酸殘基進行PEG化，結(jié)果表明，大多數(shù)經(jīng)過PEG化的FⅧ突變體的生物活性與野生型效果相同，且在半衰期和治療效果均優(yōu)于野生型FⅧ。另外，在B區(qū)還有4個半胱氨酸殘基，Turecek等[12]通過對重組全長的FⅧ進行定點PEG化，大部分修飾位點處于B區(qū)，經(jīng)PEG化的FⅧ的結(jié)構(gòu)和功能沒有影響。因此，PEG化作為一個有效的手段，拜耳、百特等醫(yī)藥公司已有相關(guān)的定點氨基酸PEG化的重組FⅧ進入臨床，以后將會給血友病A患者帶來福音[7]。

另外，為延長重組FⅧ的半衰期，在FⅧ末端和B區(qū)缺失的FⅧ末端融合表達IgG的Fc片段；利用PEG化脂質(zhì)體非共價包裹FⅧ等。FⅧ作為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)藥物，隨著對FⅧ結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，將會研制出高效、安全、價廉的重組FⅧ產(chǎn)品。

2 重組FⅧ的表達載體及系統(tǒng)

通常的載體有三種，細菌質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。它們是一類能將目的基因轉(zhuǎn)移至受體細胞的一種能自我復(fù)制的DNA或RNA分子。在重組FⅧ載體的構(gòu)建中，這三種類型均有所應(yīng)用，細菌質(zhì)粒和動物病毒的應(yīng)用更為普遍。病毒載體以其宿主范圍廣、載體容量大及操作簡單等優(yōu)勢得到廣泛應(yīng)用，腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒及單純皰疹病毒等病毒載體均有相關(guān)研究報道。

表達系統(tǒng)中，原核生物表達系統(tǒng)操作簡便，卻在表達真核來源的重組FⅧ蛋白時存在一些缺陷，如二硫鍵的錯誤鏈接、肽鏈不能有效折疊及糖基化效率低等問題，故應(yīng)用并不廣泛?，F(xiàn)今的研究關(guān)注更多的是真核微生物和動物細胞類的表達載體，王澤[13]將分泌性載體Ppic9導(dǎo)入甲醇誘導(dǎo)性畢赤酵母中進行重組FⅧ的表達，成功的表達出重組FⅧ，為重組FⅧ表達系統(tǒng)的擴展研究提供基礎(chǔ)。孫夏瑜[14]通過克隆FⅧ基因的cDNA，利用桿狀病毒-昆蟲表達系統(tǒng)成功地制備了具有凝血活性的重組FⅧ。趙倩[15]通過構(gòu)建含有BDDh FⅧ的重組真核表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入HepG2細胞中，得到了能穩(wěn)定表達重組FⅧ的細胞株。生產(chǎn)應(yīng)用最多的表達系統(tǒng)還是中國倉鼠卵巢細胞(CHO)，通過載體轉(zhuǎn)染CHO，細胞培養(yǎng)后，通過親和層析等蛋白分離技術(shù)獲得重組FⅧ，有些產(chǎn)品已成功上市。

3 基因治療

血友病A的主要發(fā)病機制是內(nèi)含子22的倒位和錯義突變。隨著科學(xué)家對FⅧ基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的透徹研究，加之個體對FⅧ的正常生理水平要求較低，許多器官均能產(chǎn)生有活性的FⅧ。因此，血友病A作為體細胞基因治療的首選疾病。

3.1 體外治療 體外治療指的是先從患者體內(nèi)取出某一組織的細胞，通過體外擴增培養(yǎng)后，將攜帶有重組FⅧ基因的載體轉(zhuǎn)染到受體細胞中，篩選出轉(zhuǎn)染成功的細胞移植到患者體內(nèi)，進而通過這些移植的細胞表達出FⅧ來達到治療的目的。Van Damme等[16]將攜帶有B區(qū)缺失型FⅧ的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染至人骨髓間充質(zhì)細胞中，然后將成功轉(zhuǎn)染的重組細胞移植到免疫缺陷的NOD-SCID小鼠中，重組FⅧ在小鼠體內(nèi)的表達量對于治療有顯著價值。因病毒載體的不安全性，纖維細胞、成肌細胞等取材方便、體外擴增迅速的組織細胞在臨床中得到應(yīng)用。

3.2 體內(nèi)治療 體內(nèi)治療是指將能表達FⅧ的載體直接注入患者機體。目前最為安全的治療方法是向患者體內(nèi)直接注射不含載體的裸DNA，通過體內(nèi)肝細胞的轉(zhuǎn)染，自身表達FⅧ來進行治療，這是一個比較有效的體內(nèi)治療方法。另外，通過轉(zhuǎn)座子對哺乳動物基因的高效整合，將真核生物的含有FⅧ基因轉(zhuǎn)座子載體導(dǎo)入受體體內(nèi)，表達FⅧ達到治療目的。但因轉(zhuǎn)座子整合基因位置的不確定，這種方法的安全性還需進一步驗證。劉雄昊[17]通過構(gòu)建攜帶有h FⅧ-SK39的核糖體基因區(qū)靶向表達載體電轉(zhuǎn)染至人肝細胞中，采用高水壓注射法將載體直接通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi)，結(jié)果顯示該載體在小鼠體內(nèi)得到有效表達，這為血友病的基因治療開拓了新的思路并奠定了基礎(chǔ)。

不得不提的是，隨著最近幾年一種全新的基因編輯技術(shù)CRISPR(規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列)的誕生，科學(xué)家只需要設(shè)計一段幾十個堿基的CRISPR，利用靶點特異性的RNA將Cas9核酸酶帶到基因組的具體靶點上，便能對特定基因位點進行切割導(dǎo)致突變。這項技術(shù)應(yīng)用在基因敲除、基因編輯相關(guān)的疾病、基因的激活和表達等多個領(lǐng)域。CRISPR/Cas9還可以作為一種精確的基因剪切工具運用在真核細胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中。將CRISPR/Cas9應(yīng)用在重組FⅧ的研究中，不僅能簡化基因編輯操作步驟，更重要的是其精準的定位能極大了提高重組效率，減少因剪切帶來的基因片段的殘留或缺失，這可以提高轉(zhuǎn)染成功率，同樣在表達系統(tǒng)中能使表達的重組FⅧ正確折疊，進而提高重組FⅧ收率。CRISPR/Cas9在血友病A的基因治療方面同樣有革命性的應(yīng)用前景，相信將這項技術(shù)應(yīng)用在重組FⅧ的研究中將具有深遠的意義。

在我國30多家血液制品生產(chǎn)廠家中僅有4家生產(chǎn)人凝血因子Ⅷ，且還沒有國內(nèi)公司生產(chǎn)重組FⅧ的產(chǎn)品，產(chǎn)量遠遠不能滿足血友病患者的需求，進口的重組FⅧ以其安全、高效的優(yōu)勢已被越來越多的血友病患者所接受。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)的進一步發(fā)展，相信在不久的將來，現(xiàn)今存在的受體產(chǎn)生免疫反應(yīng)、插入突變及CRISPR/ Cas9的脫靶等問題將會得到解決，重組FⅧ的永久性表達的也將會實現(xiàn)。

1 李文卿.重組人凝血因子Ⅷ在中國血友病A患者的有效性及抑制物產(chǎn)生的追蹤觀察.血檢與止血,2008,14:257-260.

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4 Shen B W,Paul Clint S,Chong-Hwan C,et al.The tertiary structure and domain organization of coagulation factor VIII.Blood,2008,111:1240-1247.

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12 Turecek PL,Bossard MJ,Graninger M,et al.BAX 855,a PEGylated rFVIII product with prolonged half-life.Hamostaseologie,2012,32:529-538.

13 王澤.凝血因子Ⅷ在畢赤酵母中的表達.河南師范大學(xué),2011.27.

14 孫夏瑜,李杰,武堅銳,等.重組人凝血因子Ⅷ在昆蟲表達系統(tǒng)的分泌表達及鑒定.中國優(yōu)生與遺傳雜志,2014,20:19-20.

15 趙倩.重組人凝血因子Ⅷ表達質(zhì)粒的構(gòu)建及其在HepG2細胞中的表達.天津醫(yī)科大學(xué),2012.19.

16 Van Damme A,Chuah MKL,Dell'Accio F,et al.Bone marrow mesenchymal cells for haemophilia A gene therapy using retroviral vectors with modified long-terminal repeats.Haemophilia the Official Journal of the World Federation of Hemophilia,2003,9:94-103.

17 劉雄昊.利用攜帶人凝血因子Ⅷ的核糖體基因區(qū)打靶載體進行血友病A基因治療的研究.中南大學(xué),2007.23.

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.24.035

430000 湖北省武漢市中醫(yī)醫(yī)院(江婉蓉)；武漢中原瑞德生物制品有限責任公司(王珍、何遵衛(wèi))

R 349.83

A

1002-7386(2016)24-3800-03

2016-04-12)