羊誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞研究概況

(豆興堂，李萬(wàn)波，王家明，楊秋鳳)

(遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼寧 遼陽(yáng) 111000)

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羊誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞研究概況

(豆興堂，李萬(wàn)波，王家明，楊秋鳳)

(遼寧省畜牧科學(xué)研究院，遼寧 遼陽(yáng) 111000)

摘要：體細(xì)胞重編程是產(chǎn)生干細(xì)胞的重要途徑。體細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入特定的誘導(dǎo)因子，可將其重編程為誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)，iPSCs同胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)一樣具有自我更新并維持未分化狀態(tài)的能力。利用小分子化合物組合進(jìn)行體細(xì)胞重編程，使iPSCs技術(shù)向安全應(yīng)用更近一步。羊方面已經(jīng)獲得了iPSCs，并生產(chǎn)出了iPSCs 嵌合羊。本文主要從體細(xì)胞重編程、iPSCs誘導(dǎo)方法、誘導(dǎo)因子和iPSCs鑒定研究現(xiàn)狀作一綜述。

關(guān)鍵詞：羊；體細(xì)胞重編程；誘導(dǎo)多能干細(xì)胞

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞技術(shù)是近年來(lái)干細(xì)胞領(lǐng)域最令人矚目的一項(xiàng)新興干細(xì)胞制造技術(shù)。通過(guò)病毒載體或構(gòu)建的特異載體將特定轉(zhuǎn)錄因子組合轉(zhuǎn)入被誘導(dǎo)細(xì)胞中，從而誘導(dǎo)已分化的體細(xì)胞重編程為未分化的多能細(xì)胞，為干細(xì)胞應(yīng)用技術(shù)研究開(kāi)辟了一條新途徑。iPSCs與ESCs極為類(lèi)似，具有多能性和自我更新的能力[1]。iPSCs具有同胚胎干細(xì)胞類(lèi)似的特性并能在適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)條件下分化為3個(gè)胚層的細(xì)胞，是具有全能分化能力的干細(xì)胞。體細(xì)胞重編程是實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞向干細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素。iPSCs重編程方法、誘導(dǎo)因子、鑒定方法等是iPSCs技術(shù)的重要研究?jī)?nèi)容。

1體細(xì)胞重編程技術(shù)

在哺乳動(dòng)物發(fā)育的過(guò)程中，是由具有全能性的受精卵開(kāi)始，逐漸地經(jīng)歷2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞、桑椹胚和囊胚等階段，最終分化為特定的組織器官形成一個(gè)完整個(gè)體。這是一個(gè)全能性到多能性再到最后的單能性的過(guò)程，細(xì)胞的可塑性就會(huì)逐漸失去，進(jìn)而成為某一特定類(lèi)型的細(xì)胞。然而，卻有一些試驗(yàn)方法可以使不同類(lèi)型細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)換成為可能，這就是細(xì)胞重編程技術(shù)。體細(xì)胞重編程主要指的是分化的體細(xì)胞在特定的條件下被逆轉(zhuǎn)后恢復(fù)具有自我更新能力和分化潛能的胚胎干細(xì)胞狀態(tài)[2]。目前最常用的重編程方法包括：體細(xì)胞核移植、體細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞進(jìn)行融合、特定轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)技術(shù)等。

1.1體細(xì)胞核移植重編程為多能干細(xì)胞

體細(xì)胞核移植(Somatic Cell Nuclear Transfer，SCNT)技術(shù)是研究最早的細(xì)胞重編程技術(shù)。早在1952年Briggs與King[3]首次報(bào)道了林蛙成功核移植試驗(yàn)，并且成功孵化出正常的蝌蚪。到2007年Egli[4]等以成年小鼠體細(xì)胞作為供核細(xì)胞，以受精卵作為受體，通過(guò)核移植技術(shù)獲得多能性細(xì)胞?？傊?，從動(dòng)物克隆結(jié)果看，細(xì)胞核重編程效率與供核細(xì)胞分化程度成反比，克隆囊胚分離ESCs克隆和正常胚胎克隆，克隆效率都非常低，通過(guò)SCNT技術(shù)獲得ESCs系在技術(shù)上還存在困難。

1.2體細(xì)胞與ESCs融合重編程為ESCs

細(xì)胞融合技術(shù)(cellular fusion)，將體細(xì)胞與胚胎癌細(xì)胞、胚胎生殖細(xì)胞、ESCs融合，可以發(fā)生重編程為多能干細(xì)胞。2001年Tada等[5]利用電融合技術(shù)，將體細(xì)胞與小鼠ESCs融合，得到多能性細(xì)胞。2005年Cowan等[6]報(bào)道了人類(lèi)ESCs通過(guò)融合后得到多能性細(xì)胞的研究。由于融合細(xì)胞內(nèi)存在ESCs基因組，移植排斥反應(yīng)不可避免，如何真正去除這些ESCs來(lái)源的基因組是目前還不容易克服的難題。

2006年Takahashi與Yamanaka等[7]使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體把24個(gè)與細(xì)胞多向分化潛能和保持多能分化狀態(tài)相關(guān)的候選基因逐一導(dǎo)入小鼠胚胎成纖維細(xì)胞中(mouse embryonic fibroblasts，MEF)，最終明確了 Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4這4種轉(zhuǎn)錄因子(OSKM)導(dǎo)入MEF后能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行基因重組編程，獲得了具有ESCs特性的細(xì)胞。這些細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特性以及畸胎瘤形成能力等方面，都與ESCs非常相似，并將其命名為iPSCs。2007年Yamanak等[8]和Thomson[9]分別采用相同的基因改造方法將人體細(xì)胞重編程為類(lèi)ESCs，具有與ESCs幾乎一樣的生物學(xué)特性，即iPSCs。這些研究成果為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，開(kāi)啟了干細(xì)胞研究新途徑。

2IPS細(xì)胞重編程方法

小鼠與人類(lèi)iPSCs最初是應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體[7]和重組慢病毒載體[8]重編程體細(xì)胞完成的。其誘導(dǎo)效率當(dāng)時(shí)在所有誘導(dǎo)方法中是最高的，但這兩種誘導(dǎo)系統(tǒng)會(huì)將其攜帶的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，會(huì)增加iPSCs致瘤的可能性。隨著研究深入，研究人員試驗(yàn)出了一些新的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入重編程方法。

2.1外源載體誘導(dǎo)

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體導(dǎo)入外源基因，使獲得的誘導(dǎo)細(xì)胞具有較高的致瘤性，在臨床上應(yīng)用受到了很大的阻礙。Okita等[9]將攜帶有外源基因的普通質(zhì)粒作為載體導(dǎo)入細(xì)胞，成功獲得小鼠iPSCs，但此法誘導(dǎo)效率低且誘導(dǎo)所用的時(shí)間較長(zhǎng)。外源載體誘導(dǎo)DNA重編程也即非病毒載體介導(dǎo)的DNA分子重編程。Woltjen等[10]利用OSMK 組合、2A 序列(自剪切多肽編碼序列)和piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建多順?lè)醋虞d體導(dǎo)入細(xì)胞，誘導(dǎo)獲得了iPSCs；同時(shí)證明了2A序列之間的重編程因子被完全移除，實(shí)現(xiàn)了外源基因沉默。piggyBac轉(zhuǎn)座系統(tǒng)轉(zhuǎn)座頻率和準(zhǔn)確率較高，適用范圍更廣，是一個(gè)非常有效又比較安全的載體。Jia等[11]利用微環(huán)DNA誘導(dǎo)獲得來(lái)源于脂肪干細(xì)胞的iPSCs，微環(huán)DNA缺失了細(xì)胞分裂的相關(guān)基因，保證了iPSCs的穩(wěn)定性。但這些方法無(wú)法完全避免基因重組和插入突變，誘導(dǎo)效率普遍較低。

2.2RNA的誘導(dǎo)方法

有mRNA 誘導(dǎo)和 miRNA 誘導(dǎo)兩種方式。Warren等[12]應(yīng)用mRNA誘導(dǎo)人多樣細(xì)胞類(lèi)型重編程為干性細(xì)胞比當(dāng)時(shí)其他方法更高效，且能使iPSCs更高效分化為終末分化肌細(xì)胞。潘傳英等[13]研究發(fā)現(xiàn)Oct4、Sox2、猴病毒40大T抗原的mRNA以一定比例混合后轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，誘導(dǎo)因子均能特異性表達(dá)并正確定位在細(xì)胞核；各誘導(dǎo)因子不僅具有相應(yīng)的生物學(xué)活性而且還協(xié)同作用激活了細(xì)胞內(nèi)源性干性標(biāo)志基因Nanog的表達(dá)。這種方法更容易控制外源目的基因在靶細(xì)胞中的表達(dá)量和表達(dá)時(shí)間，但是足量的特定mRNA較難獲得。

2.3小分子化合物誘導(dǎo)

Hou等[14]2013年研究表明，小分子化合物能重編程小鼠體細(xì)胞為多能干細(xì)胞。該方法完全無(wú)基因整合，致癌風(fēng)險(xiǎn)低，成為iPSCs研究領(lǐng)域的新趨勢(shì)。Hou等利用 7個(gè)小分子組合 (VPA、CHIR99021、616452、Tranylcypromine、Froskolin、3-deazaneplanocin A 和 TTNPB)，成功將小鼠體細(xì)胞重編程為iPSCs，命名為化學(xué)誘導(dǎo)的多潛能干細(xì)胞(CiPSCs)。將小鼠CiPSCs注射到8-細(xì)胞卵裂球或桑椹胚中獲得了嵌合鼠，其中CiPSCs可以整合到包括性腺在內(nèi)的所有的器官當(dāng)中，而且可以傳遞給后代，證明其是完全重編程的。這一發(fā)現(xiàn)更有利于深入理解細(xì)胞命運(yùn)決定和轉(zhuǎn)變的機(jī)制，在iPSCs研究領(lǐng)域意義重大。

學(xué)校要把提高教學(xué)質(zhì)量作為學(xué)校發(fā)展的首要任務(wù)，狠抓課堂教學(xué)改革，提升教師的專(zhuān)業(yè)技能，做好教學(xué)的評(píng)價(jià)及激勵(lì)機(jī)制。家長(zhǎng)應(yīng)給孩子創(chuàng)設(shè)良好的家庭環(huán)境，重視教育，關(guān)注孩子的成長(zhǎng)。社會(huì)也應(yīng)轉(zhuǎn)變教育評(píng)價(jià)體系。期待在學(xué)校、教師、家長(zhǎng)、社會(huì)各方面的共同努力下，使邊疆貧困地區(qū)高中思想政治課堂教學(xué)效率發(fā)生質(zhì)的飛躍。

3一些主要的iPSCs誘導(dǎo)因子

自從2006年Takahashi與Yamanaka等報(bào)道重編程小鼠MEF細(xì)胞成功獲得iPSCs以來(lái)，Oct4、Sox2、Nanog、Lin28等因子是細(xì)胞重編程中較為關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子。

3.1Oct4

Oct4是Oct家族的同源轉(zhuǎn)錄因子，包括POU區(qū)域在多能干細(xì)胞中，ESCs、EG細(xì)胞、EC細(xì)胞和mGS細(xì)胞中表達(dá)。Zaehres等[15]研究表明，抑制人和小鼠ESCs中Oct4基因的表達(dá)，ESCs就不能維持自我更新，將會(huì)分化為滋養(yǎng)層細(xì)胞。這表明Oct4在維持ESCs多能性和促進(jìn)分化上具有很重要的作用。因此，Oct4常常被用于檢測(cè)ESCs是否保持未分化狀態(tài)的標(biāo)志性基因[16]。

3.2Sox2

Sox2是Sox蛋白在ESCs中的表達(dá)形式[17]。Masui等[18]研究發(fā)現(xiàn)將小鼠ESCs的Sox2敲除，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞向滋養(yǎng)外胚層分化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)入Sox2或者Oct4的cDNA可以緩解Sox2的敲除產(chǎn)生的影響。表明Sox2和Oct4一樣，對(duì)于維持細(xì)胞的多能性來(lái)說(shuō)是很重要的，Sox2的作用可能是控制Oct4的表達(dá)。

3.3Nanog

Nanog是Chalnbers等[19]2003年在小鼠和人的ESCs中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)在維持ESCs多能性方面具有強(qiáng)大功能的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子，Nanog缺失的小鼠胚胎不能維持外胚層的多能性。在體外培養(yǎng)的ESCs，終止Nanog的表達(dá)導(dǎo)致ESCs的自發(fā)分化。外源的Oct4、Sox2和其他的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)入體細(xì)胞后，可能直接通過(guò)相互聯(lián)系的自身調(diào)節(jié)環(huán)路誘導(dǎo)內(nèi)源Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)，之后這些因子通過(guò)維持自身的表達(dá)和激活多能性轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)細(xì)胞的多能性[20]。顯然Nanog與Sox2和Oct4一起在維持多能性方面發(fā)揮著重要作用。

3.4Lin28

Lin28基因是一種非常保守的RNA連接蛋白，也是一個(gè)翻譯加速器或推進(jìn)器，通過(guò)啟動(dòng)多核糖體mRNA來(lái)增加蛋白合成效率，來(lái)提高ESCs與iPSCs等多能性干細(xì)胞重編程效率[21]。Balzer和Moss[22]認(rèn)為，Lin28基因還能阻止一種叫做let-7基因的miRNA加工，抑制由于miRNA原因引起的干細(xì)胞分化，從而保證干細(xì)胞多能性的維持。

近年來(lái)，研究者發(fā)現(xiàn)小分子化合物能促進(jìn)重編程過(guò)程，在染色質(zhì)的修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等方面發(fā)揮作用。

3.5組蛋白去乙?；敢种苿?/p>

Huangfu等[23]研究發(fā)現(xiàn)多種影響細(xì)胞重編程的化學(xué)抑制劑。組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑，如丙戊酸(VPA)，曲古抑菌素A(TSA)和suberoylanilide hydroxami cacid(SAHA)都能顯著地提高重編程效率?；瘜W(xué)處理可以作為一種途徑在動(dòng)力學(xué)和效率方面提高重編程?？蓚鞔纳诚导?xì)胞也已通過(guò)VPA的處理使OSK(Oct4，Sox2，Klf4等轉(zhuǎn)錄因子組合)參與的重編程誘導(dǎo)出的多能性干細(xì)胞獲得。因此，VPA的處理和細(xì)胞多能性的誘導(dǎo)過(guò)程是相一致的。Huangfu等研究表明，在VPA存在時(shí)，OSK誘導(dǎo)的原代成纖維細(xì)胞重編程的效率提高，比先前研究報(bào)道的效率高10～20倍。相關(guān)研究說(shuō)明在使用VPA處理的情況下，Oct4和Sox2是人成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程所必備的。

3.6天然化合物維生素 C(Vc)

包括成纖維細(xì)胞在內(nèi)的體細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)都會(huì)發(fā)生細(xì)胞衰老現(xiàn)象，部分原因是因?yàn)樵诩?xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧(ROS)的聚集。有研究表明，Vc可促進(jìn)小鼠和人類(lèi) iPSCs的產(chǎn)生效率。Vc 促進(jìn)重編程效率可能在某種程度上是通過(guò)降低活性氧的水平而實(shí)現(xiàn)的。

此外，還有DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(AZA和5-AzadC)，5-AzadC是AZA的同系物，都是DNA甲基化抑制劑，可通過(guò)使特定區(qū)域的基因去甲基化從而激活相關(guān)的基因。細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MEK)和糖原合成激酶-3信號(hào)通路抑制劑，能夠促進(jìn)ESCs維持自我更新，有助于ESCs的增殖。

4iPSCs鑒定

iPSCs與ESCs相似，從形態(tài)上講一般都生長(zhǎng)成集落，集落內(nèi)的細(xì)胞小而密集，有較大的細(xì)胞核，有1～2個(gè)清晰可見(jiàn)的核仁，具有較高的核質(zhì)比[7]。由于iPSCs與ESCs具有相似的特性，可報(bào)告特異性關(guān)鍵基因如Nanog和Oct4，鑒定挑選iPSCs[16]。堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)在未分化的多能性細(xì)胞中含量大，而分化的多能性細(xì)胞不表達(dá)或者弱表達(dá)AP，多能性細(xì)胞維持未分化狀態(tài)檢測(cè)的重要指標(biāo)之一就是AP呈陽(yáng)性。因此iPSCs應(yīng)該具有AP活性，經(jīng)AP染色后呈陽(yáng)性。iPSCs在功能上必須具有分化為具有三個(gè)胚層不同組織細(xì)胞的能力，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)不同胚層的特異性抗原，如βⅢ微管蛋白(外胚層)、結(jié)蛋白(中胚層)、α胎兒球蛋白(內(nèi)胚層)等，可以對(duì)iPSCs的體外分化特性進(jìn)行鑒定。產(chǎn)生生殖系嵌合是判斷多能性細(xì)胞的一個(gè)重要指標(biāo)，將獲得動(dòng)物多能性細(xì)胞通過(guò)顯微操作的方法注射入同物種的桑椹胚或者囊胚中，將注射后的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，產(chǎn)生嵌合體動(dòng)物，來(lái)驗(yàn)證iPSCs的多能性。體內(nèi)分化實(shí)驗(yàn)即畸胎瘤驗(yàn)證，iPSCs注射到免疫缺陷小鼠的背部或肌肉組織內(nèi)，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的生長(zhǎng)后可以產(chǎn)生畸胎瘤，通過(guò)組織學(xué)方法可以檢測(cè)是否形成瘤體。iPSCs的鑒定和評(píng)價(jià)應(yīng)該根據(jù)研究目的選擇鑒定評(píng)價(jià)方法，若重演完全的細(xì)胞核重編程過(guò)程，那么最終得到的細(xì)胞要能夠產(chǎn)生嵌合體；若產(chǎn)生有效的干細(xì)胞用于藥物開(kāi)發(fā)等用于人類(lèi)疾病醫(yī)療，那么最終得到的細(xì)胞只要具有自我更新能力并能產(chǎn)生有效的子代就可以。

5iPSCs技術(shù)前景

在羊iPSCs 研究方面，已經(jīng)能完全重編程體細(xì)胞為iPSCs，并且生產(chǎn)出了嵌合體羊。Bao等[24]先后獲得了能形成畸胎瘤和擬胚體并具有正常核型的羊iPSCs。 Liu等[25]將綿羊iPSCs注入到二倍體或四倍體胚胎中，形成了內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的部分結(jié)構(gòu)，但未形成嵌合體。Sartori等[26]用鼠OSMK誘導(dǎo)綿羊成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生iPSCs，經(jīng)核型、畸胎瘤和擬胚體鑒定為完全重編程；將獲得的iPSCs移植入胚胎后，生出了嵌合體的小羊。

iPSCs研究經(jīng)過(guò)10年的探索，已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但iPSCs的生物安全性和低效率等問(wèn)題制約著其廣泛應(yīng)用，這是未來(lái)iPSCs研究需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。若提高iPSCs生產(chǎn)效率，確保其生物安全，將會(huì)促進(jìn)其在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、優(yōu)質(zhì)動(dòng)物種質(zhì)資源的保護(hù)、瀕危動(dòng)物保護(hù)、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用，具有廣闊前景。

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Overview of Ovine Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

DOU Xing-tang,LI Wang-bo,WANG Jia-ming,YANG Qiu-feng

(Institute of Animal husbandry of Liaoning province Liaoyang 111000)

Abstract：Somatic cell reprogramming was important way of produced stem cell.Induced pluripotent stem cells (iPSCs) can be generated from somatic cells by ectopic-expression of specific inducing factors，which are capable of maintaining self-renewal and an undifferentiated state just like embryonic stem cells (ESCs).The technique of iPSCs will be close to safe application by used a number of small-molecule compounds aiming at replacing some transcription factors，reprogramming somatic cell and finally succeeding in obtaining iPSCs completely induced by a group of chemicals without any genetic manipulation.Some researchers have obtained iPSCs and also generated chimera of lambs on ovine iPSCs reseach.This review presents a general progress on somatic cell reprogramming，the inducing methods，the inducing factors as well as the research status of identifying iPSCs.

Key words：Ovine；Somatic cell reprogramming；Induced pluripotent stem cells (iPSCs)

中圖分類(lèi)號(hào)：S826.3；S814.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1005-2739(2016)03-0003-05

作者簡(jiǎn)介：豆興堂(1978-)，男，農(nóng)業(yè)推廣碩士，高級(jí)畜牧師。主要從事遼寧絨山羊繁殖育種與胚胎工程技術(shù)研究與推廣工作。E-mail：dou791120@sina.com

收稿日期：2016-03-01