結(jié)核菌實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展

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·綜述·

結(jié)核菌實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展

吳敏 綜述， 張麗霞 審校

(天津市海河醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300350)

關(guān)鍵詞:診斷；微生物學(xué)；免疫學(xué)；結(jié)核

結(jié)核病是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率較高的一種疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織2013年的調(diào)查研究數(shù)據(jù)表明，2012年估計(jì)全球結(jié)核病發(fā)病率總體上從南非的1 000/10萬至美國和歐洲部分地區(qū)、日本、澳大利亞和新西蘭等的10/10萬。當(dāng)年共發(fā)生結(jié)核病病例860萬，其中13%(110萬)是HIV陽性病例，大約75%的新發(fā)病例出現(xiàn)在非洲地區(qū)。2012年世界范圍內(nèi)的結(jié)核病病例主要集中在東南亞(29%)，非洲(27%)和西太平洋(19%)地區(qū)，印度和中國的結(jié)核病病例占病例總數(shù)的26%和12%。大多數(shù)結(jié)核病患者和死亡病例發(fā)生在男性人群，但該病仍是女性前三名的死因之一。在2012年，全球共有45萬病例發(fā)展為耐多藥結(jié)核病，因此死亡的患者達(dá)到17萬人[1]。

在臨床實(shí)踐中快速發(fā)現(xiàn)個體是否感染結(jié)核比較困難[2]，只有44%的新發(fā)病例(兒童中是15%～20%[3])可以通過痰標(biāo)本的快速抗酸染色陽性發(fā)現(xiàn)[1]。結(jié)核病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌。事實(shí)上，最終診斷依據(jù)也是在人的樣本中通過微生物培養(yǎng)方法檢測到結(jié)核分枝桿菌。盡管如此，平均需要花費(fèi)至少2周或者數(shù)周的時間才能夠培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌。針對于一些臨床上結(jié)核病的患者，痰抗酸染色陰性話無法早期使用抗結(jié)核治療。臨床上關(guān)于活動性結(jié)核病的診斷分類往往依據(jù)于不同的檢測方法：包括結(jié)核菌素實(shí)驗(yàn)，胸部放射學(xué)檢查，結(jié)核分枝桿菌核酸檢測和(或)生物樣本病理學(xué)檢查。在這篇文章中研究者綜述了一些近期發(fā)展的針對于患者活動性肺結(jié)核早期快速診斷的一些方法。

1傳統(tǒng)微生物學(xué)檢查

由于新的診斷技術(shù)發(fā)展不斷，已經(jīng)取得了全球性可喜效果。盡管如此，結(jié)核患者的診斷仍舊主要依賴痰涂片和痰培養(yǎng)，影像學(xué)檢查和臨床癥狀，并且全球57%的結(jié)核患者采用了細(xì)菌學(xué)診斷方法。因此，仍有必要盡力改善現(xiàn)存方法的診斷質(zhì)量。并且也已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。

1.1顯微鏡痰涂片檢查傳統(tǒng)顯微鏡檢查的一大進(jìn)展就是熒光顯微鏡的出現(xiàn)，相比傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡來說，檢測的敏感度大大提高，特異度也不差[4]。熒光顯微鏡在資源較富裕國家已經(jīng)普遍運(yùn)用，效果遠(yuǎn)優(yōu)于普通的光學(xué)顯微鏡。

為了提高痰涂片的敏感度，需要做3次檢測，但是現(xiàn)在這個原則受到懷疑，認(rèn)為第3次的效果較前兩次的結(jié)果并沒有很明顯的有效，至少在質(zhì)控較好的實(shí)驗(yàn)室是這樣的[5]。如果一個患者不能分泌痰，必須采取一些方法使患者分泌痰。這些方法的應(yīng)用，大大提高了醫(yī)療資源缺乏國家痰涂片的陽性率，因?yàn)閷τ谒麄儊碚f，獲取支氣管灌洗液較困難。

1.2培養(yǎng)方法的進(jìn)展從20世紀(jì)90年代以來，發(fā)明了很多方法，利用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法來快速檢測結(jié)核分枝桿菌。有文獻(xiàn)表明，利用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法的敏感度比固體培養(yǎng)基高[6]。培養(yǎng)的平均時間，BACTEC MGIT960是12.9 d，BACTEC 460是15.0 d，Lowenstein Jensen固體培養(yǎng)基是27.0 d。因此，世界衛(wèi)生組織推薦在資源缺乏的國家采用液體培養(yǎng)基的方法檢測結(jié)核分枝桿菌和進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[7]。一些新的診斷方法，利用分枝細(xì)菌噬菌體僅需要2.0 d或是更短的時間即可檢測結(jié)核分枝桿菌，具有較高的特異度(83%～100%)，但是敏感度不高(21%～88%)，和傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法相比[8]。噬菌體檢測的方法也用于快速檢測結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性。盡管如此，這些分析方法的診斷準(zhǔn)確性對于臨床標(biāo)本的直接運(yùn)用是不足的。

仍然有其他的依據(jù)表型分析的儀器研發(fā)，主要運(yùn)用于藥物敏感性檢測。有一種儀器是顯微鏡觀察藥物敏感性，利用倒置顯微鏡觀察結(jié)核分枝桿菌在孔內(nèi)液體培養(yǎng)基中的生長形態(tài)。另外一種設(shè)備是，細(xì)菌生長時，通過培養(yǎng)基顏色的改變，同時也有一些其他的顏色指示劑運(yùn)用于檢測結(jié)核分枝桿菌多耐藥分析。這些DST方法可以運(yùn)用于臨床痰標(biāo)本，并且具有較好的應(yīng)用性，同遺傳學(xué)方法相比，敏感度和特異度較高，平均時間是21.0～23.0 d[9]。

2微生物分子生物學(xué)診斷方法

2.1核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAAT)結(jié)核分枝桿菌特異性NAAT檢測肺支氣管樣本是實(shí)驗(yàn)室常用的用于診斷肺結(jié)核的分子學(xué)方法。NAAT結(jié)果在獲取痰標(biāo)本或是支氣管灌洗液標(biāo)本1.0 d之內(nèi)得出，并且匯報給臨床醫(yī)生，對于患者病情診療具有很大的意義。不幸的是，NAAT擴(kuò)增的靶序列沒有標(biāo)準(zhǔn)化，診斷的準(zhǔn)確性高度不均一。NAAT應(yīng)用于臨床樣本肺結(jié)核診斷的臨床價值的meta分析表明[10]痰標(biāo)本抗酸染色陽性的患者來說，NAAT方法的敏感度高于95%。NAAT檢測陰性的結(jié)果可以提示該患者沒有結(jié)核分枝桿菌感染。相反的，抗酸染色陰性結(jié)果的患者，NAAT關(guān)于活動性肺結(jié)核診斷的敏感度高度不均一，并且不持續(xù)，準(zhǔn)確性不夠作為日常推薦診斷結(jié)核。一般來說，巢式NAAT方法，以IS61 10作為靶序列，具有較高的診斷準(zhǔn)確性。

一個患者的痰涂片結(jié)果為陰性的話，早期meta分析認(rèn)為NAAT法診斷活動性肺結(jié)核的特異度是97%，而近期的研究[10]表明該方法的特異度為98%。結(jié)核分枝桿菌特異的NAAT法的陽性結(jié)果可以高度提示肺結(jié)核。盡管如此，遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于50%的患者具有痰結(jié)核菌涂片陰性，而痰標(biāo)本或是灌洗液標(biāo)本NAAT檢測陽性，有結(jié)核病病史的患者和支氣管肉瘤的患者易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果。

2.2線性探針分析線性探針分析是一種檢測抗菌藥物耐藥性分析常見基因突變。簡單地說，這個檢測包括DNA提取，核酸擴(kuò)增，固相反雜交在膜，檢測耐藥性突變。The Genotype MTBD Rplus分析檢測許多基因突變，包括rpoB，katG基因和inhA基因啟動子區(qū)域[11]。通過meta分析，利福平敏感度在臨床樣本中和傳統(tǒng)DST培養(yǎng)一致。同時可以檢測其他基因突變，包括那些喹諾酮類和可注射的藥物,如阿米卡星或是卡那霉素。

3免疫學(xué)診斷

3.1抗原抗體檢測進(jìn)展利用血清學(xué)檢測來診斷結(jié)核已經(jīng)有較長的歷史，因此，這種檢測方法的改進(jìn)特別需要。由于要在少菌階段，包括成年人肺結(jié)核痰涂片陰性和肺外結(jié)核，兒童結(jié)核和共感染HIV的結(jié)核患者，早期診斷疾病的方法必須操作簡便、快速，并且診斷的敏感度和特異度較高。有些時候，這些方法也用于檢測近期結(jié)核感染、監(jiān)測結(jié)核病治療的進(jìn)展。盡管如此，與其他急性細(xì)菌和病毒感染的患者相比，運(yùn)用血清學(xué)反應(yīng)診斷結(jié)核具有更多阻礙，包括活動性疾病和先天性感染之間的區(qū)別；一個具有廣泛空洞性損害的患者疾病不活動；微小的疾??；和與非結(jié)核分枝桿菌感染的區(qū)別。

近來，Steingart等[12]對該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行meta分析，作者指出在痰涂片陰性的患者總結(jié)出沒有一種抗原的敏感度高的足夠可以代替顯微鏡痰涂片鏡檢，因此必須進(jìn)行相關(guān)的研究，發(fā)現(xiàn)新的抗原。與此同時，新技術(shù)的質(zhì)量也需要改進(jìn)，包括有好的研究設(shè)計(jì)和好的效果指示劑設(shè)計(jì)敏感度和特異度，建立結(jié)核患者樣本庫。因此，現(xiàn)在有的血清學(xué)檢測不推薦作為結(jié)核診斷的方法。

3.2細(xì)胞免疫診斷的進(jìn)展結(jié)核菌素皮試(TST)和干擾素γ釋放分析(IGRA)分別在體內(nèi)和體外檢測了持續(xù)性結(jié)核特異性T細(xì)胞反應(yīng)性。它們是結(jié)核既往感染和現(xiàn)行感染的直接指示標(biāo)志。TST和IGRA單獨(dú)在外周血中起作用，因此不能區(qū)分隱性結(jié)核感染、活動性結(jié)核和既往結(jié)核感染[13]。

3.3TSTTST是由澳大利亞科學(xué)家發(fā)明的，作為一種檢測兒童結(jié)核中的一種變應(yīng)原測試。自20世紀(jì)初以來，它被認(rèn)為是結(jié)核免疫診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。盡管近代出現(xiàn)了IGRA技術(shù)，TST仍然應(yīng)用很廣泛，作為一種篩查方法，鑒定患者對結(jié)核分枝桿菌的一種陽性免疫反應(yīng)。

一個標(biāo)準(zhǔn)的純化蛋白制備，結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物上清的滅菌提取物，產(chǎn)生延遲超敏反應(yīng)通過局部皮膚注射。為了檢測結(jié)果的可靠性，TST在人的反應(yīng)是通過腫塊的直徑大小來反應(yīng)，在皮下注射純蛋白衍生物(PPD)后48～72 h觀察結(jié)果。最近的meta分析[14]指出TST檢測活動性結(jié)核的敏感度是77%，盡管如此，這項(xiàng)測試的敏感度可能被急劇降低，例如在新生兒和一些老年人；具有獲得性免疫缺陷的患者(如HIV感染的患者)；接受糖皮質(zhì)激素治療的患者；接受免疫抑制劑治療的患者；患有急性腎衰的患者；營養(yǎng)不良的患者及腫瘤患者。TST測試的特異度主要是依賴于BCG疫苗的狀態(tài)和測試個體的免疫反應(yīng)狀態(tài)?？乖慕徊娣磻?yīng)性在暴露于NTM[15]或是注射BCG疫苗以后可能導(dǎo)致TST測試陽性結(jié)果。TST誘導(dǎo)反應(yīng)超過15 mm的話，一般提示結(jié)核或是早期結(jié)核感染。近來，有皮膚測試一期臨床實(shí)驗(yàn)利用重組早期分泌抗原靶標(biāo)-6(ESAT-6)代替結(jié)核菌素安全性高[16]，培養(yǎng)濾過蛋白(CFP)-10抗原結(jié)合可以提高診斷的敏感度。

3.4IGRAIGRA是ESAT-6和CFP-10抗原的耦合，這兩種是結(jié)核分枝桿菌相對特異度較高的。主要包括兩種商業(yè)系統(tǒng)，QuantiFERON-Gold (QFT-G)測量干擾素-γ單位為IU/mL，利用酶聯(lián)免疫放射分析；以及T-SPOT.TB計(jì)數(shù)釋放干擾素γ的細(xì)胞，可見通過酶聯(lián)免疫印記(ELISPOT)?？偨Y(jié)不同國家研究表明[14，17]，IGRA最初是用于診斷隱性結(jié)核感染，但不是結(jié)核感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，IGRA的特異度一直很高，并且顯然優(yōu)于TST，然而敏感度在不同的研究中是相當(dāng)不同的。這些可變性可以歸咎于患者在不同結(jié)核病時期、年齡、劃線的疾病下的免疫狀態(tài)的特異度不同等。盡管如此，IGRA的敏感度還是高于TST。比較QFT-G和 T-SPOT.TB，T-SPOT.TB的敏感度高于QFT-G[14]。

4結(jié)核病狀態(tài)和診斷的其他生物標(biāo)志

4.1熒光激活細(xì)胞分選通過熒光激活細(xì)胞分選技術(shù)分選支氣管細(xì)胞或是痰細(xì)胞進(jìn)行抗原刺激的免疫分型，可以快速診斷痰涂片陰性的結(jié)核患者。然而多色流式細(xì)胞儀分析可以更好的分選細(xì)胞樣本，在結(jié)核隱性感染的患者中，支氣管細(xì)胞和痰T細(xì)胞被富集為PPD特異的淋巴細(xì)胞，并且流式細(xì)胞儀分析經(jīng)過PPD刺激后不能區(qū)分活動性結(jié)核和隱性結(jié)核感染。盡管如此，如果需要的話，流式細(xì)胞儀分析法是推薦作為精確診斷痰抗酸染色陰性結(jié)核患者的局部免疫診斷分析方法[18]。

4.2結(jié)核診斷的其他可能方法作為結(jié)構(gòu)和功能蛋白的科學(xué)，蛋白組學(xué)已經(jīng)鑒定蛋白標(biāo)志物為診斷或是預(yù)后的標(biāo)志物，或者是作為一些疾病治療的靶標(biāo)，包括結(jié)核病。Agranoff等[19]運(yùn)用這種方法來分析血清蛋白指紋，或者是個體蛋白質(zhì)文庫，來鑒別個體是否感染結(jié)核。它的診斷有效性的敏感度(93.5%)和特異度(94.9%)都較高。

除了血清學(xué)診斷，脂質(zhì)體被考慮作為一種激活的尿標(biāo)志物在一種抗原捕獲ELISA分析系統(tǒng)中運(yùn)用于診斷結(jié)核。依據(jù)一種商業(yè)試劑盒評價，這種脂質(zhì)體ELISA的敏感度很低[20]，但是有研究表明這種敏感度在HIV陽性的研究對象中有所提高[21]，因此推薦在HIV感染的患者中該方法同痰涂片檢查聯(lián)合使用。

5結(jié)論

診斷和治療很好的結(jié)合是控制結(jié)核病的最基本的元素，并且也會持續(xù)很久，直到出現(xiàn)新的疫苗或是可以有效防止結(jié)核病進(jìn)展的藥物，在20世紀(jì)中時代，結(jié)核病的治療取得了革命性的進(jìn)展，出現(xiàn)了一系列化療的方法，然而在診斷方面卻沒有什么太大的進(jìn)展變化。盡管如此，結(jié)核病控制不是可能的，如果活動性疾病患者的診斷被延遲的話，就會導(dǎo)致很多其他與之接觸的人受到傳染。另外，錯誤的陰性感染陽性診斷也會導(dǎo)致個體不必要的負(fù)擔(dān)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)的負(fù)擔(dān)。新的診斷技術(shù)的出現(xiàn)是急需的。據(jù)本文中總結(jié)的結(jié)核診斷相關(guān)技術(shù)，應(yīng)該制訂出針對不同的情況運(yùn)用相應(yīng)的技術(shù)，只有這樣才能使患者和治療機(jī)構(gòu)很好的結(jié)合，更好地做到結(jié)核病控制。

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(收稿日期：2015-10-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.04.037

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)04-0519-03

作者簡介：吳敏，女，主管技師，主要從事微生物分子生物學(xué)研究。