乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥株(RT A181T)感染性克隆的構(gòu)建及在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)*

趙建華,陸仁飛

(江蘇省南通市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 226006)

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·論 著·

乙型肝炎病毒阿德福韋酯耐藥株(RT A181T)感染性克隆的構(gòu)建及在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)*

趙建華,陸仁飛△

(江蘇省南通市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 226006)

目的 利用重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(SOE-PCR)快速構(gòu)建乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韋酯耐藥株(RT A181T)感染性克隆，觀察重組質(zhì)粒在Huh7細(xì)胞中的表達(dá)，建立HBV阿德福韋酯耐藥株(RT A181T)的體外研究細(xì)胞模型。方法 設(shè)計(jì)保守引物，從慢性乙型肝炎阿德福韋酯耐藥患者血清中擴(kuò)增全長(zhǎng)HBV基因組，利用SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建1.3倍基因組長(zhǎng)度的感染性克隆質(zhì)粒pHBV1.3，轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系Huh7，采Western Blot、Real-time PCR檢測(cè)感染性克隆復(fù)制以及表達(dá)情況，同時(shí)用抗病毒藥物拉米夫定以及阿德福韋酯驗(yàn)證對(duì)感染性克隆復(fù)制及表達(dá)的抑制情況。結(jié)果 成功構(gòu)建了HBV阿德福韋酯耐藥株感染性克隆質(zhì)粒pHBV1.3(RT A181T),該質(zhì)粒在Huh7細(xì)胞系中能有效復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。拉米夫定能有效抑制該感染性克隆的復(fù)制和表達(dá)，阿德福韋酯不能抑制該感染性克隆的復(fù)制和表達(dá)。結(jié)論 構(gòu)建的HBV阿德福韋酯耐藥株感染性克隆質(zhì)粒pHBV1.3(RT A181T)在體外能高效復(fù)制及表達(dá)蛋白，其轉(zhuǎn)染細(xì)胞可用于HBV復(fù)制機(jī)制及抗病毒研究。

乙型肝炎病毒； 阿德福韋酯； 耐藥； 感染性克隆

乙型肝炎病毒(HBV)感染在全世界廣泛流行，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道全球約有20億人感染過(guò)HBV，每年大約有100萬(wàn)人死于因HBV感染而繼發(fā)的慢性乙型肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌，嚴(yán)重影響了人類的健康[1-3]。開(kāi)展HBV研究的困難之一就是缺乏很好的體內(nèi)感染動(dòng)物模型及體外感染細(xì)胞模型。目前，體外感染的細(xì)胞模型主要以穩(wěn)定表達(dá)HBV的HepG2.2.15細(xì)胞系為主[4]。該HBV的病毒基因型為D型、血清型為ayw的野生型[5]。近年來(lái)，拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋及替比夫定等核苷(類)抗病毒藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于慢性乙型肝炎的臨床治療。隨著大范圍、長(zhǎng)時(shí)間的抗病毒藥物治療，HBV耐藥問(wèn)題已經(jīng)成為臨床慢性乙型肝炎治療的棘手問(wèn)題[6]。相應(yīng)的，構(gòu)建各種耐藥株的感染性克隆用于HBV復(fù)制機(jī)制以及抗病毒研究已顯得十分迫切與必要。大量研究證實(shí)，HBV的1.1、1.2、1.3倍體重組質(zhì)粒均能在人類的肝癌細(xì)胞系中完成核酸的復(fù)制及相關(guān)蛋白的表達(dá)，其中1.3倍體HBV核酸復(fù)制水平和蛋白表達(dá)水平是最高的[7-8]。本研究從慢性乙型肝炎阿德福韋酯耐藥患者血清中擴(kuò)增全長(zhǎng)HBV基因組，利用重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)(SOE-PCR)技術(shù)快速構(gòu)建1.3倍HBV的感染性克隆質(zhì)粒pHBV1.3(RT A181T)，在體外驗(yàn)證了該感染性克隆的核酸復(fù)制、蛋白表達(dá)以及抗病毒藥物耐藥情況。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞株Huh7用含10%胎牛血清(Gibco公司)、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。

1.2 方法

1.2.1 HBV阿德福韋酯耐藥株基因組DNA的提取 HBV血清標(biāo)本均來(lái)源于南通大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，患者均長(zhǎng)期服用阿德福韋酯，并出現(xiàn)病毒學(xué)突破被診斷為阿德福韋酯臨床耐藥，標(biāo)本中HBV的DNA載量在104～107copy/mL。磁分離試劑盒(北京鑫諾美迪公司)抽提HBV DNA，提取方法嚴(yán)格參照說(shuō)明書，提取的HBV DNA在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 HBV全長(zhǎng)基因組的克隆 參考文獻(xiàn)[9]的引物設(shè)計(jì)，F(xiàn)1:5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCT TTT TCA CCT CTG CCT AAT CA-3′；R1:5′-CCG GAA AGC TTG AGC TCT TCA AAA AGT TGC ATG GTG CTG G-3′。以上述方法提取的HBV DNA為模板,采用高保真性聚合酶KOD plus(Toyobo公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA膠回收試劑盒(上海生工生物有限公司)瓊脂糖凝膠電泳膠回收PCR產(chǎn)物，用平末端克隆載體試劑盒pEASY-Blunt Zero cloning kit(北京全式金公司)連接目的片段和載體，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞TOP10(Tiangen公司)，涂板過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單菌落，酶切鑒定，陽(yáng)性菌落送上海邁浦生物公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用MEGA5軟件BLAST分析。

1.2.3 利用SOE-PCR構(gòu)建1.3倍體HBV 利用SOE-PCR技術(shù)構(gòu)建HBV的感染性克隆-1.3倍體HBV(阿德福韋酯耐藥，RT A181T)，命名為pHBV1.3(RT A181T)，測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 感染性克隆Huh7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染及表達(dá) 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)用Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系Huh7，轉(zhuǎn)染方法參照說(shuō)明書。共轉(zhuǎn)染3種質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組為質(zhì)粒pHBV1.3(RT A181T)，轉(zhuǎn)染空載體pBluescript KS(+)(陰性對(duì)照)和pHBV1.3(C)質(zhì)粒(陽(yáng)性對(duì)照)。轉(zhuǎn)染后6 h換液，48 h后分別吸取培養(yǎng)上清液和收集細(xì)胞，通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)水平，Real-time PCR檢測(cè)復(fù)制水平。

1.2.5 免疫印跡試驗(yàn) 裂解轉(zhuǎn)染后的Huh7細(xì)胞,上樣，SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜。一抗使用濃度如下：鼠抗-HBs單克隆抗體1∶1 000稀釋，兔抗-HBc單克隆抗體1∶4 000稀釋，兔抗-GAPDH單克隆抗體1∶1 000稀釋，抗體均購(gòu)自Santa Cruz公司。孵育結(jié)束后洗膜，加二抗室溫孵育1 h，二抗使用濃度如下：HRP標(biāo)記的羊抗-鼠IgG 1∶5 000稀釋，HRP標(biāo)記的驢抗-兔IgG 1∶5 000稀釋，二抗均購(gòu)自Sigma公司。孵育結(jié)束后洗膜。用化學(xué)發(fā)光顯色試劑盒Immobilon Western(Millipore公司)暗室顯影。

1.2.6 Real-time PCR試驗(yàn) 采用HBV實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(上?？迫A生物工程有限公司)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后分泌到培養(yǎng)基上清液中的HBV DNA載量，具體操作步驟以及擴(kuò)增條件按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行，PCR儀(ABI7500)。

1.2.7 藥物敏感試驗(yàn) 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)轉(zhuǎn)染Huh7肝癌細(xì)胞系12 h后，換成含不同濃度拉米夫定(0、0.5、1、2 μg/mL)的培養(yǎng)基和不同濃度阿德福韋酯(0、0.5、1、2 μg/mL)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)36 h，分別收集上清液和細(xì)胞，檢測(cè)核酸復(fù)制水平和蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié) 果

2.1 HBV 阿德福韋酯耐藥株基因組的克隆 收集7份HBV 阿德福韋酯耐藥患者血清，提取HBV DNA。以提取的HBV DNA為模板，采用高保真性聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后與載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10并涂板，挑取單克隆酶切鑒定，結(jié)果顯示：在載體中插入了一個(gè)大小約3 200 bp的DNA片段，陽(yáng)性克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果BLAST分析顯示，克隆到的這株HBV，基因組的C、X、P和S區(qū)4個(gè)ORF區(qū)均完整無(wú)致死性突變，但在反轉(zhuǎn)錄區(qū)181位置出現(xiàn)了A→T的突變，表明克隆的這株HBV發(fā)生了阿德福韋酯的基因型耐藥，將克隆到的這株阿德福韋酯耐藥的HBV全長(zhǎng)基因組命名為pHBV(RT A181T)。

以克隆到的pHBV(RT A181T)為模板進(jìn)行亞克隆，通過(guò)SOE-PCR構(gòu)建1.3倍體HBV感染性克隆，將構(gòu)建的亞克隆1.3倍體HBV重組質(zhì)粒以及空載體pBluescript KS(+)進(jìn)行酶切鑒定，1.3倍體HBV重組質(zhì)粒單酶切后呈線性片段，約7 000 bp，EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ雙酶切后可見(jiàn)3 000 bp位置和接近4 300 bp位置有兩條明顯的條帶，即載體pBluescript KS(+)和目的片段HBV1.3，證實(shí)1.3倍體HBV重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,命名為pHBV1.3(RT A181T)。

2.2 感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)的體外復(fù)制

2.2.1 轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎核心抗原(HBcAg) 為了驗(yàn)證感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)能否在Huh7細(xì)胞中表達(dá)HBsAg、HBcAg，本研究進(jìn)行了轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞48 h后，分別收集轉(zhuǎn)染pHBV1.3(RT A181T)Huh7細(xì)胞培養(yǎng)上清液以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染pHBV1.3(C)的Huh7細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：和陽(yáng)性對(duì)照一樣，轉(zhuǎn)染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7細(xì)胞的均明顯表達(dá)蛋白HBsAg、HBeAg，而陰性對(duì)照無(wú)相應(yīng)蛋白表達(dá)。

2.2.2 轉(zhuǎn)染細(xì)胞分泌HBV DNA 為檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否分泌HBV顆粒，利用熒光探針PCR法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中HBV DNA的載量，結(jié)果顯示：和陽(yáng)性對(duì)照一樣，轉(zhuǎn)染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7細(xì)胞上清液中HBV DNA的滴度達(dá)到106copy/mL，而陰性對(duì)未檢測(cè)到HBV DNA。

2.3 抗病毒藥物敏感性檢測(cè) 為檢測(cè)轉(zhuǎn)染pHBV1.3(RT A181T)的Huh7細(xì)胞對(duì)藥物的敏感性，將抗病毒治療藥物拉米夫定、阿德福韋酯加入到pHBV1.3(RT A181T)的Huh7細(xì)胞中。在加入拉米夫定后，HBV感染性克隆表達(dá)的蛋白HBsAg、HBeAg明顯受到抑制，且與藥物劑量正相關(guān)。而加入阿德福韋酯后，HBV感染性克隆表達(dá)的蛋白HBsAg、HBeAg不受抑制。實(shí)驗(yàn)表明，所構(gòu)建的感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)轉(zhuǎn)染Huh7后，對(duì)拉米夫定敏感，對(duì)阿德福韋酯耐藥。

3 討 論

此前的報(bào)道中，構(gòu)建HBV感染性克隆采用的方法一般都是以擴(kuò)增的HBV 基因組短片段基礎(chǔ)上，通過(guò)幾次酶切連接，拼接成HBV感染性克隆[10-11]。這種方法耗時(shí)耗力，還受到酶切效率及酶切特異性的限制，很難精準(zhǔn)構(gòu)建合適起止位點(diǎn)的1.3倍體HBV感染性克隆。SOE-PCR技術(shù)采用具有互補(bǔ)末端的引物,使模板鏈之間形成了重疊區(qū)域,從而在隨后的延伸過(guò)程中沿著重疊部分延伸,將兩條具有部分重疊區(qū)域的模板鏈拼接起來(lái)[12-13]。該技術(shù)能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行快速、方便的片段重組,并且不需要內(nèi)切酶和連接酶處理,利用該技術(shù)也能快速地將兩條短片段合成一條長(zhǎng)片段[14]。通過(guò)精巧的引物設(shè)計(jì)，在線性HBV全基因組序列前面增加了一組內(nèi)源性的HBV增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，由此構(gòu)建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞后，將依賴自身啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄翻譯，這樣可以充分反映HBV病毒株的自身轉(zhuǎn)錄情況，有利于研究 HBV 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄翻譯的全過(guò)程。

在本研究中，從HBV 阿德福韋酯耐藥患者血清中擴(kuò)增得到1株完整的HBV基因組，經(jīng)局部系列比對(duì)基本檢索工具分析顯示，該株病毒基因組的C、X、P和S區(qū)4個(gè)ORF區(qū)均完整無(wú)致死性突變，并且在反轉(zhuǎn)錄區(qū)181位置出現(xiàn)了A→T的突變，表明發(fā)生了抗病毒藥物阿德福韋酯基因型耐藥。以克隆到的HBV全基因組為模板，通過(guò)SOE-PCR快速構(gòu)建了1.3倍體HBV感染性克隆pHBV1.3(RT A181T)。pHBV1.3(RT A181T)是完整的病毒復(fù)制體，包含了5′末端增強(qiáng)子EnhⅠ、EnhⅡ、復(fù)制起始位點(diǎn)(DR1和DR2)、前基因組轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、X開(kāi)放讀碼框等，可轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生3.5、2.4、2.1、0.8 Kb等所有HBV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[15-16]。

最后，將pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞系。通過(guò)免疫印跡實(shí)驗(yàn)和real-time PCR等方法，驗(yàn)證了感染性克隆核酸復(fù)制及特異性蛋白合成的能力，結(jié)果顯示構(gòu)建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆具備完整的核酸復(fù)制及蛋白合成能力。而且，該感染性克隆對(duì)抗病毒藥物拉米夫定敏感，對(duì)抗病毒藥物阿德福韋酯耐藥。因此，構(gòu)建的pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆可用于HBV基礎(chǔ)研究及臨床抗病毒藥物耐藥研究。

本研究將pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞株，HBV在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制以及相關(guān)蛋白的表達(dá)在轉(zhuǎn)染48 h后達(dá)到峰值，隨著時(shí)間的推移病毒的復(fù)制以及相關(guān)蛋白的表達(dá)都逐漸下降，因此將pHBV1.3(RT A181T)感染性克隆穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Huh7細(xì)胞株,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株將是下階段實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)，為進(jìn)一步研究HBV的結(jié)構(gòu)和功能、表達(dá)與調(diào)控、病毒與宿主的關(guān)系、抗病毒藥物的篩選提供研究工具。

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Construction of infectious clone of HBV adefovir-resistant strain RT A181T and its expression in Huh7 cells*

ZHAOJianhua,LURenfei△

(DepartmentofClinicalLaboratory,NantongMunicipalThirdPeople′sHospital,Nantong,Jiangsu226006,China)

Objective To rapidly construct hepatitis B virus(HBV) adefovir(ADV)-resistant strain(RT A181T) infectious clone by using SOE-PCR,to observe the expression of recombinant plasmids in Huh7 cells and to establish the in vitro cell model of HBV ADV-resistant strain(RT A181T).Methods The conservative primers were designed,the full-length HBV genome was amplified from serum in the patients with ADV-resistant chronic hepatitis B.Then,the 1.3-fold genome-length infectious clone pHBV1.3 was constructed by using the SOE-PCR technique,which was transfected into human hepatoma cells Huh7 cell line.ELISA,Western Blot and Real-time PCR were adopted to detect infectious cloning replication and expression,meanwhile the antiviral drugs lamivudine(LAM) and ADV were used to verify the infectious clone copy and inhibition of expression.Results The HBV ADV-resistant infectious cloning plasmids pHBV1.3 was successfully constructed.This plasmid could be effectively replicated,transcripted and expressed in Huh7 cell lines.LAM could effectively inhibit the replication and expression of the infectious clone,while ADV could not inhibit the replication and expression of the infectious clone.Conclusion The constructed infectious clone plasmids pHBV1.3(RT A181T) of HBV ADV-resistant strain can efficiently replicate and express protein in vitro,its transfected cells can be used in the study of HBV replication mechanism and antiviral study.

hepatitis B virus; adefovir; drug resistance; infectious clone

江蘇省南通市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)資助項(xiàng)目(WQ2014038，W201217)；江蘇省南通市科技局資助項(xiàng)目(HS2014062)。

趙建華，男，副主任技師，主要從事臨床微生物研究?！?/p>

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.23.010

A

1673-4130(2016)23-3266-03

2016-06-02

2016-07-22)