腸道病毒71型與臨床手足口病關(guān)系的研究進(jìn)展*

張　勝，王　楊△，李凌佳 綜述，高　輝 審校

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院檢驗(yàn)科　650051；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科　650032)

·綜述·

腸道病毒71型與臨床手足口病關(guān)系的研究進(jìn)展*

張勝1，王楊1△，李凌佳2綜述，高輝1審校

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)附屬延安醫(yī)院檢驗(yàn)科650051；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科650032)

腸道病毒71型；手足口病；實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

手足口病(HFMD)是一種常見(jiàn)的由腸道病毒引起的兒童感染性疾病，主要由柯薩奇病毒A型16(CA16)和腸道病毒(EV)71型感染引起。多數(shù)患者表現(xiàn)為一種輕微的自限性疾病，少數(shù)病例可迅速發(fā)展為致命的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，特別是由EV71引起的感染，而小于3歲的兒童是最容易發(fā)生EV7感染且中樞神經(jīng)系統(tǒng)最易受累[1-2]。常伴隨腦干腦炎、無(wú)菌性腦膜炎、腦脊髓炎、小兒麻痹癥樣癱瘓、心肺衰竭，甚至導(dǎo)致死亡，且腦干腦炎恢復(fù)后的兒童可能遺留嚴(yán)重的神經(jīng)病學(xué)方面的后遺癥[3]?，F(xiàn)就EV71的生物學(xué)特性、致病機(jī)制及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)進(jìn)行總結(jié)。

1EV71分子生物學(xué)特性

1.1EV71分子特性腸道病毒和柯薩奇病毒同屬于小RNA病毒科腸道病毒屬，EV71是無(wú)包膜和突起的單股正鏈小RNA病毒，直徑約33～35 nm，病毒基因組長(zhǎng)度大約為7.5 kb。病原體由一個(gè)60個(gè)亞單位的二十面體的衣殼包繞病毒基因組RNA構(gòu)成，它的基因組包含了一個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，兩端為5′和3′非編碼區(qū)(UTR)。其中5′非編碼區(qū)包含了一個(gè)涉及RNA復(fù)制的四葉式固定結(jié)構(gòu)和一個(gè)指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)翻譯的內(nèi)在核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)[4-6],在3′-UTR的末端含有多聚腺苷酸尾巴，UTR不僅可以保證病毒蛋白的正常表位，還可以維護(hù)病毒基因的穩(wěn)定性，決定病毒的毒力[7]。而開(kāi)放閱讀框編碼一種250×103的多聚蛋白，包括P1、P2和P3三個(gè)區(qū)，組成病毒衣殼的結(jié)構(gòu)蛋白(VP1、VP2、VP3及VP4)和參與病毒復(fù)制的7種非結(jié)構(gòu)蛋白(2A、2B、2C、3A、3B、3C及3D)。其中VP1是最具致病性的也是最重要的一種結(jié)構(gòu)蛋白，其變化是EV71免疫原性的主要決定因素，單個(gè)氨基酸的變化可以明顯改變免疫反應(yīng)和中和抗體反應(yīng)的敏感性；且包含主要的中和表位，可以用于病毒的鑒定和進(jìn)化分析[8]。EV71 VP1蛋白包含297個(gè)氨基酸，大小為32×103，具有“果凍卷”型的β-桶狀結(jié)構(gòu)和疏水性口袋因子。分布于病毒表面的VP1β桶狀結(jié)構(gòu)區(qū)，存在一個(gè)深凹，被認(rèn)為是EV71 病毒的黏附位點(diǎn)，也被稱為峽谷樣結(jié)構(gòu)[9]。

1.2EV71的生物學(xué)亞型EV71被分為3種基因型，分別是A、B和C，其中B和C劃分為B1-B5、C1-C5。而一個(gè)單獨(dú)的B0基因亞型最近是在荷蘭1963～1967年的回顧性分析中EV71毒株上得以確認(rèn)。也有研究表明EV71 C4亞基因型應(yīng)該歸類為一種新的基因型D中。此外，突變和重組是EV進(jìn)化過(guò)程中常見(jiàn)的現(xiàn)象，EV3D聚合酶的失真是導(dǎo)致基因組復(fù)制過(guò)程中突變的主要原因，正是由于高發(fā)的突變率和重組率，為臨床的治療和疫苗的研制帶來(lái)了困難。

2EV71引起HFMD的致病機(jī)制

2.1EV71的感染機(jī)制及過(guò)程發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜、多步驟過(guò)程，病毒和受體的相互作用是激發(fā)感染的第一步[10]。EV71起初吸附在細(xì)胞表面的吸附因子上，隨后進(jìn)入細(xì)胞和受體相互作用，EV71通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞與受體相互作用，細(xì)胞內(nèi)病毒RNA-dependent 翻譯，多聚蛋白被2A和3C蛋白酶裂解為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。非結(jié)構(gòu)蛋白主要參與病毒核酸RNA正負(fù)鏈的合成，其中正鏈病毒RNA被包裝成為衣殼前體，最終成為具有感染性的病毒顆粒[11]。而VP1作為病毒結(jié)構(gòu)蛋白，主要功能是協(xié)助病毒感染，結(jié)合細(xì)胞受體，參與吸附、穿入、脫殼等過(guò)程。目前的研究與其有關(guān)的有清道夫受體B2(SCARB2)、選擇素P糖蛋白配體1(PSGL-1)、人膜聯(lián)蛋白Ⅱ(Anx2)和硫酸乙酰肝素類糖胺聚糖。其中SCARB2是主要表達(dá)于核內(nèi)體及溶酶體膜的Ⅲ型糖蛋白，分布于重癥HFMD患者肺組織支氣管上皮、細(xì)支氣管上皮、炎癥細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞；PSGL-1表達(dá)于骨髓細(xì)胞及受激后的T淋巴細(xì)胞，作為細(xì)胞黏附因子P、E、L高親和性配體僅分布于重癥HFMD患者肺組織炎癥細(xì)胞，可能在重癥HFMD的感染過(guò)程中具有一定作用[9]。

2.2EV71致病機(jī)制與機(jī)體的反應(yīng)EV71感染后通過(guò)病毒編碼蛋白酶作用導(dǎo)致宿主蛋白翻譯停止，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。研究發(fā)現(xiàn)EV71可以通過(guò)幾種機(jī)制阻斷Ⅰ型干擾素(IFN)的表達(dá)，比如降低細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)病毒RNA感受黑色素瘤分化相關(guān)基因S(MDAS)減少Ⅰ型IFN的表達(dá)而降低宿主抗病毒反應(yīng)[12]。相關(guān)文獻(xiàn)研究數(shù)據(jù)顯示，EV71復(fù)制誘導(dǎo)細(xì)胞周期停止在S期，停在S期的細(xì)胞為EV71的感染提供了優(yōu)越的條件，這一過(guò)程主要是由非結(jié)構(gòu)蛋白3D介導(dǎo)引起，由此能更深一步理解EV71致病的機(jī)制。

目前已有研究者通過(guò)對(duì)原位EV71病毒RNA定位和詳細(xì)的免疫病理分析發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重的感染者炎癥細(xì)胞在不同的組織中的分布和分類不等，中樞神經(jīng)系統(tǒng)伴有巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的EV71感染易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)病變；另外，在一項(xiàng)伴有腦膜腦炎中樞神經(jīng)并發(fā)癥的患者血清中炎性因子與嚴(yán)重程度相關(guān)性的病例對(duì)照研究中顯示，白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10、IFN-α和IFN-γ明顯升高，可能與EV71感染誘導(dǎo)的中樞病變相關(guān)[13]。國(guó)內(nèi)研究結(jié)果顯示，IL-6和TNF-α參與EV71 感染所致的HFMD發(fā)病的病理、生理過(guò)程，并與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)[14]。

3EV71實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法

EV感染的檢測(cè)和血清型鑒別傳統(tǒng)方法是病毒分離和免疫熒光檢測(cè)法(IFA),但是很耗時(shí)且需要特殊實(shí)驗(yàn)設(shè)備[15]。傳統(tǒng)EV71的檢測(cè)最初是依賴病毒培養(yǎng)和鑒定及血清學(xué)診斷，但同樣是耗時(shí)或是很高的假陽(yáng)性率，現(xiàn)就EV不同檢測(cè)方法比較如下。

3.1培養(yǎng)病毒培養(yǎng)可以用糞便、咽喉拭子、水泡液體作為標(biāo)本，糞便被認(rèn)為是最適合的標(biāo)本類型，因?yàn)樗梢愿L(zhǎng)維持病毒存活，但是運(yùn)輸時(shí)間應(yīng)該盡可能短。分離和培養(yǎng)病毒的傳統(tǒng)診斷方法操作較為繁瑣，且假陰性率較高，影響臨床診斷和治療。

3.2免疫學(xué)檢驗(yàn)診斷中和抗體檢測(cè)，通過(guò)與特定血清型抗血清酸發(fā)生中和來(lái)識(shí)別相關(guān)血清型，空斑中和試驗(yàn)普遍應(yīng)用于EV71中和抗體檢測(cè)。此外，ELISA IgM檢測(cè)已經(jīng)應(yīng)用于快速診斷，從感染后的第一周至數(shù)周都保持很高的敏感性[8]。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)血清EV71 IgM抗體對(duì)于現(xiàn)癥感染的檢查具有重要意義，其有可操作性強(qiáng)、簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室血清抗體檢測(cè)中應(yīng)用廣泛，對(duì)于檢測(cè)設(shè)備的要求不高，適合在基層醫(yī)院推廣。

3.3分子生物學(xué)檢測(cè)目前，核酸檢測(cè)成為EV病原學(xué)檢測(cè)新的“金標(biāo)準(zhǔn)”，發(fā)揮出無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。其是基于PCR原理的一種更快捷、特異和敏感的檢測(cè)和鑒別EV亞型的試驗(yàn)方法。常用的具有很高特異性和敏感性的用來(lái)檢測(cè)EV71的包括反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR),其次還有內(nèi)標(biāo)多重?zé)晒釸T-PCR、基因芯片技術(shù)等分子診斷技術(shù)方法[16]。

3.3.1RT-PCR技術(shù)目前臨床診斷EV71感染最為常用的方法之一，其可對(duì)VP1基因進(jìn)行擴(kuò)增和核酸測(cè)序，以VP1蛋白作為目標(biāo)檢測(cè)抗原，對(duì)低載量水平的RNA可以測(cè)定，常用來(lái)對(duì)EV這種RNA病毒感染進(jìn)行診斷和血清型鑒定。但與qRT-PCR相比，其靈敏度和特異度都不夠高，且操作繁瑣，測(cè)定周期長(zhǎng)，具有較高的假陽(yáng)性率及假陰性率，對(duì)臨床的診斷和治療均具有一定的影響，導(dǎo)致其在臨床的應(yīng)用價(jià)值不斷下降。此外，因其需要先進(jìn)的設(shè)備和昂貴的試劑，很難應(yīng)用于發(fā)展中國(guó)家或是現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。

3.3.2qRT-PCR簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)的分子診斷過(guò)程，提高了靈敏度和特異度，有效地避免了交叉污染和手工操作誤差，達(dá)到了對(duì)檢測(cè)的各個(gè)反應(yīng)時(shí)段的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、定量，被認(rèn)為是目前檢測(cè)EV71及EV、CA16的首選方法。

3.3.3其他檢測(cè)方法一種快速、可靠、經(jīng)濟(jì)、有效的核酸擴(kuò)增分子檢測(cè)方法——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法在2000年首次建立[8]，與RT-PCR相比，具有更高的靈敏度和特異度，操作簡(jiǎn)便快捷，具有廣闊的應(yīng)用前景。此外，有研究顯示已成功發(fā)現(xiàn)了基于基因檢測(cè)的高通量二代測(cè)序方法可以直接對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行EV71全基因組測(cè)序，以對(duì)病毒變異和進(jìn)化提供重要的認(rèn)識(shí)依據(jù)[17]。目前還成功發(fā)展和驗(yàn)證了一種敏感的自動(dòng)化多通路一次性檢測(cè)實(shí)時(shí)RT-PCR方法來(lái)檢測(cè)EV，對(duì)HFMD的臨床管理和暴發(fā)流行疫情控制有重要作用[18]。

3.4聯(lián)合檢測(cè)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道RT-PCR與IgM聯(lián)合檢測(cè)可以提高EV71感染引起的嚴(yán)重HFMD早期診斷檢測(cè)率，所以在臨床上被強(qiáng)烈推薦[19]，此外，如白細(xì)胞(WBC)、降鈣素原(PCT)、IL-6、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)等項(xiàng)目聯(lián)合檢測(cè)在HFMD的早期診斷中的臨床價(jià)值及有效性也得到了認(rèn)可[20]。

4小結(jié)

雖然近年來(lái)對(duì)HFMD的臨床研究不斷深入，但EV71基因型變異，以及其易與其他不同亞型的交叉感染給HFMD的臨床的診療不斷帶來(lái)新的挑戰(zhàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，相信在不久的將來(lái)，EV71的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可以達(dá)到精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)水平，并能更加成熟地應(yīng)用于臨床，在HFMD的個(gè)體化防治中發(fā)揮重要作用。

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2016-01-20修回日期：2016-03-18)

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(2014FB080)。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.12.026

A

1673-4130(2016)12-1665-03