吳瑤瑤綜述 張湘燕審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563003；2.貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 貴陽 550002 )

·綜 述·

產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌研究進展

吳瑤瑤1綜述 張湘燕2審校

(1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義563003；2.貴州省人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，貴州 貴陽 550002 )

肺炎克雷伯菌； 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶； 耐藥性； 感染

感染性呼吸系統(tǒng)疾病不僅是臨床上最常見的疾病之一，也是最常見的致死原因之一，導(dǎo)致了巨大的社會負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因此病原菌感染與抗感染治療長期以來不僅是一個關(guān)系重大的社會問題，也是呼吸系統(tǒng)和其他相關(guān)臨床及基礎(chǔ)-臨床領(lǐng)域密切關(guān)注的課題。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌目前已在全世界范圍內(nèi)流行，且多重耐藥菌株所占比例高，使臨床治療面臨巨大挑戰(zhàn)。因此，掌握產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株的流行病學(xué)特征、耐藥的特點及相關(guān)檢測方法，對有效地進行預(yù)防和控制至關(guān)重要。本篇文章就相關(guān)研究進展作一綜述。

肺炎克雷伯菌是人體口咽部常見腸桿菌科寄殖菌之一，在高齡患者、勞累、酗酒或合并各種基礎(chǔ)疾病時易誘發(fā)下呼吸道感染[1]。近年來，隨著抗菌藥物使用日益增多，尤其是三代頭孢菌素類藥物的不合理使用導(dǎo)致細(xì)菌對這些藥物產(chǎn)生了耐藥，特別是產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)的細(xì)菌因其耐藥譜廣、所攜帶的耐藥基因易于傳播而備受關(guān)注。一項多中心研究中收集了北京、安徽、福建等6個地區(qū)下呼吸道感染耐藥KP，多耐藥菌株比例高達34.2%，耐藥菌株呈現(xiàn)比例高、種類多、分布廣、抗藥性強的特點[2]。它的廣泛流行使得臨床抗感染治療在抗生素選擇方面越來越受限制，已成為目前有效治療細(xì)菌感染的一個關(guān)鍵性問題[3-5]。這類細(xì)菌的耐藥機制主要有以下3個途徑：抗生素水解酶基因的獲取、抗生素靶位點及膜蛋白基因突變、特點基因的差異性表達[6-7]。產(chǎn)生各種使抗生素失活的酶是KP臨床分離菌株耐藥的重要機制和環(huán)節(jié)[8]。

1 ESBLs的定義、來源和類型

1.1 定義與來源

超廣譜β-內(nèi)酰胺酶是指可水解包括單環(huán)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素和第三代頭孢菌素在內(nèi)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，并可被β-內(nèi)酰胺酶抑制劑所抑制的一類β-內(nèi)酰胺酶[9]。這類酶主要由質(zhì)粒介導(dǎo)，廣泛發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌、陰溝腸桿菌及肺炎克雷伯菌等腸桿菌科中。

1.2 ESBLs的分類

根據(jù)Bush功能分類法[10]和Ambler的分子結(jié)構(gòu)分類法[11]，ESBLs大部分屬于Bush功能分類中的2be群，Ambler分類法中 A類，少數(shù)屬于Bush 2d群、Ambler D類[10-11]。全球目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200多種ESBLs[12]。根據(jù)各個酶特性的不同，大致分為：SHV型、CTX-M型、TEM型、OXA型和其他類型如：PER、VEB、GES、SPO等。

1.2.1 SHV型ESBLs SHV在肺炎克雷伯菌中20%由質(zhì)粒介導(dǎo)的氨芐西林耐藥是因為SHV-1[13]。SHV-1 β-內(nèi)酰胺酶的變異位點為Gly238Ser和Glu240Lys，突變后分別對頭孢他啶和頭孢噻肟產(chǎn)生高效水解能力。其主要發(fā)現(xiàn)于陰溝腸桿菌、大腸埃希氏菌等細(xì)菌中。

1.2.2 CTX-M型ESBLs 該型酶對頭孢噻肟的水解能力明顯高于頭孢他啶，故以Cefotaxime而命名為CTX-M。CTX-M型酶與TEM、SHV型酶同源性僅有39%[14]。最新研究[15-16]表明，該酶與Kluyvera ascorbate菌染色體上的AmpC酶具有更高的同源性。該酶對酶抑制劑敏感，但敏感程度有差別：他唑巴坦>克拉維酸>舒巴坦。對頭孢他啶酶活性弱是多數(shù)CTX-M型ESBLs區(qū)別于TEM型、SHV型ESBLs的主要標(biāo)志。CTX-M型ESBLs主要通過整合子、插入序列(ISEcpl)等方式在菌株間發(fā)生傳播與擴散。

1.2.3 TEM型ESBLs TEM型ESBLs主要發(fā)現(xiàn)于肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌。在TEM-1和TEM-2的編碼基因上的突變形成了該類型的酶，其主要的突變位點為Glu104Lys、Arg164Ser/His、Gly238Ser、Glu240Lys。TEM-2是TEM-1的第1個突變產(chǎn)物，兩者等電點發(fā)生了變化，但酶底物譜未發(fā)生變化[17]。TEM-3與TEM-1相比：Glu104Lys、Gln39Lys、Gly238Ser，使得原有的特異性酶底物譜擴大，對β-內(nèi)酰胺酶類抗生素及第三代頭孢菌素產(chǎn)生廣泛耐藥[18]。

1.2.4 OXA型ESBLs OXA型ESBLs對OXA有很強的水解能力，故命名為OXA。該型酶屬分子分類法中的D類和功能分類法中的2 d功能亞組，主要以對苯唑西林和氯唑西林的高水解性、對頭孢菌素的水解能力不一、活性可被克拉維酸輕度抑制為特征。OXA型ESBLs主要為OXA-10，其水解頭孢菌素的能力有所提高，較少被克拉維酸所抑制，其中第72位上絲氨酸被天冬酰胺所替代，第157位上的天冬氨酸代替甘氨酸，這兩者的變化決定著ESBLs表型的呈現(xiàn)。OXA型酶主要存在于肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌及其他腸桿菌科細(xì)菌[5，19-20]。

1.2.5 其他類型ESBLs 其他的ESBLs有PER、VEB、MEN、TLA等。最新研究表明，在世界范圍內(nèi)不同地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了除腸桿菌科外的其他菌種還存在有不同型別的ESBLs，如SFO、CME、GES、FEC等。這些酶均具有較強的水解頭孢他啶和氨曲南的能力。

2 ESBLs分子流行病學(xué)分布特征

ESBLs的首次報道是在1983年德國，被發(fā)現(xiàn)于肺炎克雷伯菌和黏質(zhì)沙雷菌中，近30年間，產(chǎn)ESBLs菌株已大范圍出現(xiàn)在世界各地。但因各個國家、地區(qū)、醫(yī)院使用的抗菌藥物種類不同、細(xì)菌流行種類以及自然環(huán)境等不同，其檢出率、基因型的分布在不同國家、不同地區(qū)和不同醫(yī)院間也有很大差別。西班牙產(chǎn)ESBLs菌株具有高度多樣性，但以CTX-M-9、CTX-M-10、CTX-M-14及TEM-4型最多見[21]；在美國則以TEM-10、TEM-26和TEM-12為主；英國以TEM-10和TEM-12為主；韓國以SHV-12、TEM-52和SHV-2a為主；OXA型主要分布于法國及土耳其；近年來CTX-M型在逐年增加，現(xiàn)已在全世界范圍內(nèi)呈流行趨勢[22]。我國的ESBLs以CTX-M型及SHV型為主，常見的為CTX-M-14、CTX-M-9、CTX-M-3和SHV-12等。醫(yī)院ESBLs檢出率較高的科室為呼吸科、老干病房及ICU病房。主要原因：這些病房患者多合并有基礎(chǔ)疾病、免疫力差，可能存在有免疫抑制劑的使用以及侵襲性操作等因素；在分子學(xué)方面，ESBLs基因位于質(zhì)粒上，可通過接合轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)座和轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式使耐藥性發(fā)生傳遞。

3 ESBLs的檢測方法

美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)對肺炎克雷伯菌產(chǎn)ESBLs初篩和表型確證試驗作如下推薦[23]。

3.1 表型初篩試驗

標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散法：選擇頭孢他啶、氨曲南、頭孢噻肟、頭孢泊肟或頭孢曲松(每片含量均為30 μg)，采用M-H瓊脂平皿測試抑菌環(huán)直接，當(dāng)頭孢他啶≤22 mm或氨曲南≤27 mm或頭孢噻肟≤28 mm或頭孢泊肟≤17 mm或頭孢曲松≤25 mm時，提示菌株可能產(chǎn)ESBLs。

該法簡單易于操作，但特異性較差，因ESBLs對不同底物的水解能力不同，部分菌株在藥敏試驗中對單環(huán)類及頭孢菌素類抗生素表現(xiàn)為敏感或中介，因此容易造成漏檢。故該法僅能作為初篩試驗，進一步證實還需進行表型確證試驗。

3.2 表型確證試驗

3.2.1 紙片表型確證試驗 將待測菌制成濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙?，用棉棒均勻涂布于M-H平皿上，把頭孢他啶、頭孢他啶/克拉維酸、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸藥敏紙片貼在平皿上。35 ℃孵育18～24 h后觀察結(jié)果。判定標(biāo)按2009年版NCCLS(美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會)標(biāo)準(zhǔn)：頭孢噻肟/頭孢噻肟加克拉維酸、頭孢他啶/頭孢他啶加克拉維酸，對照不加克拉維酸組抑菌圈直徑≥5 mm為產(chǎn)酶株，即ESBLs陽性。該法簡單、經(jīng)濟，常作為實驗室常規(guī)檢測。

3.2.2 E-test法 將頭孢他啶以及復(fù)方制劑頭孢他啶/克拉維酸分別置于試條兩端，并將試條貼于受檢菌株的M-H瓊脂平板上，經(jīng)35 ℃孵育18～24 h后，讀取試條兩端的MIC值≥8即可判定產(chǎn)ESBLs，否則為陰性。該方法更為敏感和特異，可讀出具體MIC值，因此結(jié)論較為客觀；缺點為試條價格昂貴，且試條上抗生素濃度梯度有限，有造成漏檢的可能。

3.2.3 等電聚焦電泳 對未知的ESBLs進行等電聚焦電泳，將檢測結(jié)果與已知酶的等電點(PI)進行比較，若相同則可能為同一種類，若不同可能為一種新的ESBLs。已知SHV型的PI一般在7.0～7.8；而TEM型的PI多在5.2～6.3；非SHV型非TEM型的PI高低不等。因此有些酶的等電點在相同或相近時難以用該法進行區(qū)別。

4 小 結(jié)

近30年間，產(chǎn)ESBLs的肺炎克雷伯菌在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，并且不斷有新的產(chǎn)ESBLs菌株出現(xiàn)，各種ESBLs的特性有所差別。產(chǎn)ESBLs菌株可通過產(chǎn)酶基因的水平傳播(如整合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等)和產(chǎn)酶株的克隆傳播造成耐藥性的擴散及院內(nèi)感染的流行。快速、準(zhǔn)確的檢測產(chǎn)ESBLs菌株對臨床治療、院內(nèi)感染的控制有著重要意義，目前檢測手段有多種，可根據(jù)各自優(yōu)缺點靈活選擇。全面客觀的評價產(chǎn)ESBLs的肺炎克伯菌菌株的耐藥性特點，對臨床上抗生素的合理使用有著重要意義，可減少新的產(chǎn)酶菌株的產(chǎn)生。

[1] Levison ME,D.Pneumonia caused by gram-negative bacilli:an overview[J].Rev InfectDis,1985,7 (Suppl 4):S656-665.

[2] An S,Chen J,Wang Z,et al.Predominant characteristics of CTX-M-producing klebsiella pneumoniae isolate from patients with lower respiratory tract infection in multiple centers in China[J].FEMS Microbiol Lett,2012，332:137-145.

[3] Christiansen N, Nielsen L, Jakobsen L, et al. Fluoroquinolone resistance mechanisms in urinary tract pathogenic escherichiacoli isolate during rapidly increasing fluoroquinolone consumption in a low-use country[J]. Microb Drug Resist,2011,17(3):395-406.

[4] Clark NM, Patterson J, Lynch JP. Antimicrobial resistance among gram-negative organisms in the intensive careunit[J]. Curr Opin Crit Care,2003,9(5):413-423.

[5] Hawkey PM, Jones AM. The changing epidemiology of resistance[J]. J Antimicrob Chemother,2009,64 (Suppl 1): 3-10.

[6] Peleg AY, Hooper DC. Hospital-acquired infections due to gram-negative bacteria[J].N Engl J Med.2010，362:1804-1813.

[7] Zavascki AP,Carvalhaes CG,Picao RC,et al.Multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa and acinetobacter baumannii:resistance mechanisms and implications for therapy[J].Expert Rev Anti Infect Ther，2010，8:71-93.

[8] Bush K,Jacoby GA.Updated functional classification of beta-lactamases[J].Antimicrob Agents Chemother，2010.54:969-976.

[9] Bradford PA. Extended-spectrum beta-lactamases in the 21st century:characterization,epidemiology,and detection of this important resistance threat[J].Clin Microbiol Rev，2001,14(4):993-951.

[10] Bush K,Jacoby GA, Medeiros AA. A functional classification scheme for beta-lactamases and its correlation with molecular structure[J]. Antimicrob Agents Chemother，1995,39(6):1211-1233.

[11] Ambler RP,Coulson AF,Frere JM,et al.A standard numbering scheme for the class a beta-lactamases[J].Biochem J，1991,276(Ptl):269-270.

[12] Jacoby GA, Munoz-Price LS. The new β-lactamses[J].N Engl J Med，2005,352(4):380-391.

[13] Matthew M,Hedges RW,Smith JT.Types of beta-lactamase determined by plasmids in gram-negative bacteria[J].J Bacteriol，1979,138(3):657-662.

[14] Barthélémy M, Péduzzi J, Bernard H, et al. Close amino acid sequence relationship between the new plasmid-mediated extended-spectrumβ-lactamases MEN-1 and chromosomally encoded enzymes of Klebsiella oxytoca[J]. Biochim Biophys Acta，1992,1122(1):15-22.

[15] Jacoby GA, Munoz-Price LS.The new β-lactamases[J]. N Engl J Med，2005,352(4):380-391.

[16] Bush K. New beta-lactamases in gram-negative bacteria: diversity and impact on the selection of antimicrobial therapy[J]. Clin Infect Dis，2001, 32(7): 1085-1089.

[17] Palzkill T,Botstein D.Identification of amino acid substitutions that alter the substrate specificity of TEM-1 beta-lactamase[J]. J Bacteriol，1992,174(16): 5237-5243.

[18] Sirot J, Chanal C, Petit A,et al. Klebsiella pneumoniae and other Enterobacteriaceae producing novel plasmid-mediated beta-lactamases markedly active against third-generation cephalosporins: epidemiologic studies[J]. Rev Infect Dis，1988,10(4): 850-859.

[19] Bert F, Branger C，Lambert-Zechovsky N.Identification of PSE and OXA β-lactamase genes in pseudomonas aeruginosa using PCR-restriction fragment length polymorphism[J]. J. Antimicrob. Chemother， 2002,50(1): 11-18.

[20] Poirel L, Gerome P,Dechamps C,et al.Integron-located OXA-32 gene cassette encoding an extended-spectrum variant of OXA-2β-lactamase from pseudomonas aeruginosa[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2002,46(2): 566-569.

[21] Empel J，Baraniak A，Literacka E，et al.Molecular survey of beta-lactamases conferring resistance to newer beta-lactams in enterobac-teriaceae isolates from polish hospitals[J].Antimicrob Agents Chemother，2008，52(7):2449-2454.

[22] Gniadkowski M. Evolution and epidemiology of extended-spectrum β-lactamases and ESBL-producing microorganisms[J]. Clin Microbiol Infect， 2001,7(11):597-608.

[23] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 15th informational supplement[M]. National Committee for Clinical Laboratory Standards，2005：(M100-S15).

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