聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)梅毒螺旋體的進(jìn)展

葉興東 林宏達(dá) 戴向農(nóng) 任澤舫

聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)梅毒螺旋體的進(jìn)展

葉興東 林宏達(dá) 戴向農(nóng) 任澤舫

梅毒是由蒼白螺旋體感染引起的一種常見系統(tǒng)性性傳播疾病，早診早治梅毒有利于減少傳播、減輕系統(tǒng)損害。直接暗視野檢查蒼白螺旋體或血清抗體檢測(cè)是診斷梅毒的主要手段，但有局限性。聚合酶鏈反應(yīng)通過(guò)擴(kuò)增蒼白螺旋體靶序列診斷梅毒，而polA、tpp47基因?yàn)榫酆厦告湻磻?yīng)法檢測(cè)蒼白螺旋體常用靶基因。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)和巢式聚合酶鏈反應(yīng)的敏感性高于其他聚合酶鏈反應(yīng)法。聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)一期梅毒拭子中蒼白螺旋體敏感性可達(dá)60%以上，而檢測(cè)血液及腦脊液蒼白螺旋體敏感性不超過(guò)60%（胎傳梅毒可達(dá)83%），特異性93%以上?；颊逪IV感染與聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)敏感性無(wú)關(guān)。

梅毒；蒼白密螺旋體；聚合酶鏈反應(yīng)；診斷；基因

梅毒是由梅毒蒼白螺旋體（Tp）感染引起的性傳播疾病，有胎傳梅毒和獲得性梅毒，后者又分為早期梅毒（包括一期梅毒、二期梅毒、早期隱性梅毒）和晚期梅毒（包括三期良性梅毒、心血管梅毒、晚期隱性梅毒）、神經(jīng)梅毒［1］。Tp不能體外培養(yǎng)，兔睪丸培養(yǎng)Tp耗時(shí)且難于普及［2］，硬下疳拭子暗視野顯微鏡檢測(cè)Tp敏感性僅72%［3］，無(wú)臨床癥狀時(shí)，血清特異性及非特異性梅毒抗體檢測(cè)陽(yáng)性也僅為推測(cè)性診斷梅毒，因此，診斷早期梅毒、潛伏梅毒需更敏感及特異的方法。PCR直接擴(kuò)增Tp靶基因序列，診斷梅毒具有敏感、特異等特點(diǎn)，且可檢測(cè)多種臨床標(biāo)本。

1 PCR技術(shù)檢測(cè)Tp的不同方法

自PCR技術(shù)發(fā)明以來(lái)，經(jīng)典PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）、巢式PCR、定量PCR和實(shí)時(shí)定量PCR等相繼用于梅毒的診斷。

1.1 經(jīng)典PCR法：Hay等［4］首次用PCR法檢測(cè)有中樞神經(jīng)損害的梅毒合并HIV感染者腦脊液中的Tp，結(jié)果50%（7/14）陽(yáng)性，認(rèn)為該方法檢測(cè)效能為130 Tp分子/ml，檢測(cè)Tp DNA的敏感性47%，特異性93%，但檢測(cè)無(wú)梅毒治療史的患者腦脊液時(shí)，敏感性為59%，特異性97%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值91%，陰性預(yù)測(cè)值是83%。該方法需要技術(shù)熟練，且產(chǎn)物容易被污染。

作者單位：510095廣州市皮膚病防治所（葉興東、戴向農(nóng)）；中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)與流行病學(xué)系（林宏達(dá)、任澤舫）

1.2 RT-PCR 法：Marra 等［5］用 RT-PCR 方法，優(yōu)化引物設(shè)計(jì)后，檢測(cè)326例患者腦脊液中Tp DNA，陽(yáng)性率為 8%（26/326），Tp DNA陽(yáng)性者腦脊液中，白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于Tp DNA陰性者，分別為34.5 個(gè)/μl、2 個(gè)/μl，RT-PCR 檢測(cè)腦脊液中的 Tp DNA的效能可達(dá)1～10個(gè)Tp分子/ml。

1.3 巢式 PCR 法 Grange等［3］以 Nichol 株（4 ×107個(gè)/ml）連續(xù)1∶10稀釋成標(biāo)準(zhǔn)DNA為參照，用巢式PCR和暗視野顯微鏡法同時(shí)檢測(cè)109份標(biāo)本中的 Tp，陽(yáng)性率分別為 82.6%（90/109）、73.4%（80/109），暗視野顯微鏡的敏感性和特異性分別為73%、88%，而巢式PCR法檢測(cè)Tp的敏感性和特異性則分別為82%、95%，與梅毒臨床診斷相比，巢式PCR法陽(yáng)性預(yù)測(cè)者為94%，陰性預(yù)測(cè)值為57%，檢測(cè)TP效能約為20個(gè)Tp分子/ml，高于經(jīng)典PCR方法的檢測(cè)腦脊液中Tp的效能。

1.4 定量PCR：又稱實(shí)時(shí)定量PCR，Gayet-Ageron等［6］用定量PCR檢測(cè)74例患者的126份不同生物樣本中的Tp DNA，結(jié)果不分樣品類別，定量PCR檢測(cè)TP DNA整體敏感性分別為65%、53%；檢測(cè)效能為0.05pg DNA（相當(dāng)于10個(gè)Tp分子基因組DNA的量），大致相當(dāng)于10×103個(gè)/ml，而定量PCR在潛伏梅毒患者血液中未檢出Tp。Chi等［7］報(bào)道定量PCR檢測(cè)皮損中Tp-DNA敏感性僅 15.5%，Gayet-Ageron 等［2］Meta分析表明，經(jīng)典 PCR、RT-PCR 和巢式PCR的敏感性較定量PCR和多重PCR高出100倍，各種PCR法檢測(cè)Tp的特異性達(dá)93%以上，但某些梅毒標(biāo)本（如腦脊液）的特異性可低至83%。不同PCR方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如經(jīng)典PCR容易污染，干擾因素多，RT-PCR中RNA保存要求高，提取時(shí)容易降解，使反轉(zhuǎn)錄中c-DNA量不穩(wěn)定，實(shí)時(shí)定量PCR雖然敏感性稍低，但無(wú)需電泳，且因密閉環(huán)境，污染源少。而巢式PCR，經(jīng)歷初始幾個(gè)循環(huán)后，模板得到放大，提高了目的基因的檢測(cè)能力，綜合起來(lái)，巢式PCR是檢測(cè)Tp較為理想的PCR技術(shù)。

2 PCR檢測(cè)TP的靶基因

PCR技術(shù)可通過(guò)檢測(cè)多種靶基因，診斷Tp感染 ， 如 膜 蛋 白 基 因 4D、tmpA、tmpB、tmpC、bmp、tpp47、TP0136、TP0548［8-9］，核糖核蛋白基因 16S rRNA、23SrRNA［9-10］以及polA基因等［9，11］，tpp47 和polA是最常用的靶基因［2-3，6，9，12-17］，檢測(cè) Tp 的效能基本類似［12］。

2.1tpp47基因：tpp47編碼相對(duì)分子質(zhì)量為47 000的青霉素結(jié)合蛋白，與其他細(xì)菌和真核生物DNA無(wú)同源性［6］，該蛋白能裂解β內(nèi)酰胺類抗生素，其功能受β內(nèi)酰胺酶活性產(chǎn)物的抑制，這對(duì)保留Tp對(duì)青霉素敏感至關(guān)重要［18］。以tpp47為靶基因，視不同類型標(biāo)本，PCR檢測(cè)Tp-DNA的敏感性14%～95%［3，6，14，19］。Grange 等［3］報(bào)道，檢測(cè)血液中 Tp-DNA敏感性為 14.7% ～ 29%。Gayet-Ageron 等［6］對(duì) 74 例患者126份樣品進(jìn)行Tp DNA檢測(cè)，結(jié)果隱性梅毒血液中Tp全部陰性，視一期梅毒不同血液成分，Tp敏感性28%～55%，而二期梅毒則為36%～47%。Dai等［14］對(duì)372例疑似梅毒患者潰瘍拭子進(jìn)行Tp DNA檢測(cè)，316例（86%）Tp DNA陽(yáng)性。Gayet-Ageron等［12］同時(shí)用tpp47-PCR和polA-PCR方法，分別檢測(cè)了272份性病性潰瘍拭子，結(jié)果表明，兩個(gè)靶基因檢測(cè)Tp DNA的敏感性類似，tpp47基因檢測(cè)拭子標(biāo)本中Tp DNA敏感性62.5%～95%，檢測(cè)腦脊液中Tp敏感性接近60%。

2.2polA基因：polA是一高度保守基因，編碼Tp DNA聚合酶Ⅰ，有兩個(gè)特點(diǎn)：一是其編碼氨基酸序列中，半胱氨酸殘基高達(dá)24個(gè)之多，而在其他大多數(shù)生物中該基因僅有1～2個(gè)半胱氨酸殘基。二是在Tp基因組中，有4個(gè)特異性堿基序列，這兩個(gè)特征使得Tp-polA基因具有高敏感性和特異性，因此，擴(kuò)增polA的引物選擇在有額外插入和半胱氨酸殘基的DNA序列區(qū)域。Liu等［17］首次用該基因檢測(cè)Tp，發(fā)現(xiàn)polA基因檢測(cè)Tp的能力為2拷貝/50 μl反應(yīng)體系，與多重PCR法比較，PCR檢測(cè)Tp的能力可以提高10個(gè)數(shù)量級(jí)，敏感性和特異性分別達(dá)到95.8%、95.7%。Peng 等［20］PCR 法檢測(cè) 110 份疑似梅毒患者樣本中的Tp，提示該基因敏感性和特異性分別為 83.3%、92.9%。Flasarová等［9］以巢式 PCR 等檢測(cè)294例疑似梅毒患者的415份臨床標(biāo)本中Tp DNA，視梅毒類型與標(biāo)本類型而異，陽(yáng)性率位于22.2% ～ 64.7%；具體而言，一期、二期、隱性梅毒陽(yáng)性率分別為 64.8%、22%、8.8%，而同樣方法，tpp47基因檢測(cè)隱性梅毒血液Tp陰性［6］。Gayet-Ageron等［2］用Meta分析發(fā)現(xiàn)，polA比tpp47基因具有更高的陽(yáng)性似然比?？梢姡琾olA基因是PCR檢測(cè)Tp時(shí)最佳引物候選基因之一。

3 PCR檢測(cè)Tp的臨床標(biāo)本

3.1 皮損拭子：PCR方法檢測(cè)不同病期梅毒皮損拭子，Tp 敏感性 60% ～ 95%［2-3，11，16］。Gayet-Ageron 等［2］發(fā)現(xiàn)，梅毒流行區(qū)梅毒血清學(xué)陰性的生殖器潰瘍拭子Tp敏感性為78.4%，皮損陽(yáng)性似然比是血液陽(yáng)性似然比的2倍。Grange等［3］對(duì)230例梅毒患者中149例（77例HIV陰性，72例HIV陽(yáng)性）拭子進(jìn)行Tp DNA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HIV陰性患者拭子的陽(yáng)性率為83.3%，敏感性和特異性分別為83%、96%，而HIV陽(yáng)性者拭子陽(yáng)性率為75%，敏感性和特異性分別為76.4%、93.3%。一期、二期梅毒拭子陽(yáng)性率分別為81.3%、76.8%。診斷梅毒與暗視野顯微鏡結(jié)果高度一致（κ =0.53），陽(yáng)性似然比為 18，陰性似然比為0.18。Martin 等［16］對(duì) 41 例梅毒（其中一期 19 例）患者53份臨床標(biāo)本檢測(cè)Tp-DNA，結(jié)果一期梅毒拭子陽(yáng)性率為60%，如剔除樣本中DNA含量不足因素，實(shí)際陽(yáng)性率可以提高到75%，作者認(rèn)為，潰瘍拭子是檢測(cè)一期梅毒的最佳標(biāo)本選擇。李軍和鄭和義［21］綜合國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，認(rèn)為PCR用于檢測(cè)梅毒螺旋體DNA時(shí)，對(duì)一期梅毒患者潰瘍性皮損的敏感性較高，對(duì)二期梅毒患者血液標(biāo)本的敏感性不高。Gayet-Ageron等［6］檢測(cè)74例早期梅毒患者126份不同生物樣本中的Tp，結(jié)果一期梅毒患者拭子敏感性為80%，高于二期梅毒拭子敏感性（20%）。Wu 等［13］檢測(cè)136例患者211份標(biāo)本（拭子75份）中Tp-DNA，結(jié)果拭子陽(yáng)性率為63%，高于血漿（49%）和血清（36%）的敏感性。Gayet-Ageron 等［2］用 Meta分析發(fā)現(xiàn)，PCR法檢測(cè)潰瘍拭子Tp敏感性可達(dá)75.9%，特異性96.5%?？傮w上，PCR法檢測(cè)梅毒皮損拭子Tp陽(yáng)性率在60%以上，一期梅毒最高可達(dá)95%，高于二期梅毒皮損陽(yáng)性率。

3.2 梅毒患者血液或血液成分：Sutton 等［11］首次報(bào)道，在梅毒患者血液中檢出Tp，但陽(yáng)性率僅27%，低于拭子陽(yáng)性率。Grange等［3］對(duì)294例疑似梅毒血液標(biāo)本進(jìn)行Tp-DNA檢測(cè)，結(jié)果外周血單核細(xì)胞、血漿、血清、全血碎片的檢測(cè)Tp DNA敏感性分別為29%、18%、14.7%、24%。Wu 等［13］報(bào)道 125 份梅毒患者血液Tp-DNA檢測(cè)結(jié)果，血漿、血清 Tp-DNA陽(yáng)性率分別為49%、36%；二期梅毒患者血液Tp-DNA陽(yáng)性率為58.6%，高于一期梅毒及隱性梅毒患者的陽(yáng)性率（7.7%）。Castro 等［22］首次在耳垂血中檢出Tp，作者對(duì)69例潛伏梅毒和18例治療后的梅毒患者全血、血漿、血清和耳垂血進(jìn)行Tp-DNA檢測(cè)，共235份潛伏梅毒血樣，視不同PCR引物，PCR檢測(cè)全血Tp陽(yáng)性率位于25%～56%，多重PCR陽(yáng)性率38.3%，耳垂血陽(yáng)性率最高 56%，血清最低（25%），提示耳垂血是潛伏梅毒患者檢測(cè)Tp的優(yōu)先樣本。Peng等［23］的研究也支持該觀點(diǎn)，認(rèn)為耳垂血提取Tp-DNA的量平均高于血漿、全血和腦脊液而有利于潛伏梅毒Tp的分型。血液采樣時(shí)要注意患者是否經(jīng)過(guò)驅(qū)梅治療，因?yàn)轵?qū)梅抗生素會(huì)導(dǎo)致血中Tp載量下降，甚至呈假陰性。Wang等［24］研究顯示，梅毒患者治療后外周血Tp-DNA下降，并且認(rèn)為，外周血檢測(cè)Tp-DNA不敏感。與拭子檢測(cè)Tp類似，HIV感染狀態(tài)均不影響血液 Tp-DNA 檢測(cè)結(jié)果［3，13］。Gayet-Ageron等［2］用Meta分析發(fā)現(xiàn)，PCR檢測(cè)血液中Tp-DNA，除了胎傳梅毒敏感性高達(dá)83%之外，其余各類型梅毒血液敏感性均低，血液成分中，血漿和血清高于全血（但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），與此相反，潰瘍或皮損檢測(cè)Tp敏感性高于70%。

3.3 其他臨床樣本：除了常用的潰瘍拭子、血清（漿）外，其他如腦脊液［6］、尿液［6］、眼內(nèi)液［13，15，25］、石蠟包埋的組織［26］、淋巴結(jié)［27］、關(guān)節(jié)液、羊水［28］等均能發(fā)現(xiàn)Tp，并用于梅毒的診斷。Wu等［13］檢測(cè)9例腦脊液和2份玻璃體液，結(jié)果Tp DNA陽(yáng)性率18%。Dumaresq等［29］檢測(cè)120例合并早期梅毒的HIV感染者腦脊液中TP-DNA，敏感性為58%，特異性為67%、陰性預(yù)測(cè)值為85%。Gayet-Ageron等［6］首次檢測(cè)尿液中Tp-DNA，結(jié)果一期、二期梅毒患者尿液中Tp-DNA敏感性分別為29%、44%。作者認(rèn)為，盡管尿液檢測(cè)Tp敏感性低，但為最容易獲取的標(biāo)本，有一定的檢測(cè)價(jià)值。

4 結(jié)語(yǔ)

PCR技術(shù)檢測(cè)Tp-DNA敏感性視不同梅毒類型、不同樣本、靶基因的選擇、患者治療情況等有關(guān)。經(jīng)典PCR、RT-PCR、巢式PCR的敏感性較定量PCR和多重PCR好；梅毒患者皮損拭子Tp陽(yáng)性率高達(dá)60%以上，除了胎傳梅毒外，血液Tp陽(yáng)性率不超過(guò)60%，且二期梅毒血液陽(yáng)性率高于一期梅毒，耳垂血檢測(cè)Tp是潛伏梅毒較有價(jià)值取材途徑，腦脊液中Tp檢測(cè)為臨床診斷神經(jīng)梅毒提供重要的補(bǔ)充手段，至于PCR引物候選基因，tpp47、polA兩個(gè)基因檢測(cè)Tp效能基本相似，但polA基因陽(yáng)性似然比高于tpp47基因。驅(qū)梅治療后Tp陽(yáng)性率可以下降，但HIV感染狀態(tài)不影響血液或潰瘍拭子中Tp的檢測(cè)。巢式PCR和定量PCR結(jié)合是否可以提高PCR檢測(cè)TP DNA的敏感性值得關(guān)注。

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Application of polymerase chain reaction in detection ofTreponema Pallidium:an update

Ye Xingdong*,Lin Hongda,Dai Xiangnong,Ren Zefang.*Department of Dermatology,Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou 510095,China

Syphilis is a chronic and systemic sexually transmitted disease caused byTreponema pallidium（TP）.Early diagnosis and treatment are helpful in reducing spread of syphilis and in attenuating systemic damage.Direct detection of TP by dark-field microscopy （DFM）and serological tests for antibodies have been the main diagnostic means for syphilis,but they both have limitations.Polymerase chain reaction（PCR） techniques are currently applied in the diagnosis of syphilis by amplifying target sequences of TP,andpolAandtpp47genes are the commonest target sequences for the detection of TP with PCR.Reverse transcription PCR and nested PCR show higher sensitivity than other PCR techniques.The sensitivity of PCR techniques is above 60%for detection of TP DNA in swab samples from primary syphilis lesions,less than 60%in blood and cerebrospinal fluid samples （up to 83%in samples from patients with congenital syphilis）.However,the specificity of PCR techniques is usually above 93%for the detection of TP.HIV status does not influence the sensitivity of PCR techniques.

Syphilis;Treponema pallidum;Polymerase chain reaction;Diagnosis;Genes

Ye Xingdong,Email:xingdongye@21cn.com

2015-02-25）

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012B031800014）；廣州市科技攻關(guān)項(xiàng)目（201300000166）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目（20121A031001）

Fund programs:Science and Technology Planning ProjectofGuangdong Province ofChina（2012B031800014）;Guangzhou Program forScienceand TechnologyDevelopment （201300000166）;Guangzhou Science and Technology Program for Medicine and Health （20121A031001）

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2016.01.006

葉興東，Email:xingdongye@21cn.com