堿性羥胺、弱堿和乙酸水解奇異變形桿菌LPS抗原及其活性的影響

楊文腰， 王 瀛， 王 琦， 修雪亮， 戴澤文， 張 建， 周荔葆

(遼寧成大生物股份有限公司,遼寧 沈陽 110179)

堿性羥胺、弱堿和乙酸水解奇異變形桿菌LPS抗原及其活性的影響

楊文腰， 王 瀛， 王 琦， 修雪亮， 戴澤文， 張 建， 周荔葆

(遼寧成大生物股份有限公司,遼寧 沈陽 110179)

采用堿性羥胺、弱堿、乙酸水解奇異變形桿菌LPS抗原，研究不同方式對小鼠活性的影響。檢測結(jié)果表明，與水解前對比三種方式均能降低LPS抗原內(nèi)毒素含量，即從2 500×104EU/mL降低至(250～2.5)×104EU/mL；熱源性檢測表明對家兔體溫幾乎無影響；但免疫原性結(jié)果表明ED50 LPS

奇異變形桿菌；LPS抗原；內(nèi)毒素；熱源性；免疫原性；毒性

奇異變形桿菌屬于革蘭陰性桿菌，是引起尿路感染的主要病原菌之一，其感染率僅次于大腸埃希菌。2004年林茂虎等[1]對1999年12月至2001年3月采集的165例UTIs患者樣本進行分離、鑒定，結(jié)果變形桿菌屬高達39%。鄧晶榮[2]對某院2011至2014年278株標本來源進行分離，鑒定出138株奇異變形桿菌(49.61%)、70株普通變形桿菌(25.14%)和其他變形桿菌屬62株(25%)，它們能夠產(chǎn)生多種β-內(nèi)酰胺酶，給臨床治療帶來了極大的困難，已受到臨床普遍關(guān)注。奇異變形桿菌潛在的致病因子和感染過程及相關(guān)疾病所涉及的細菌行為包括：遷徙性[3]、生長速度、鞭毛、溶血素、外膜蛋白[4]、脂多糖(LPS)等。胞膜蛋白及多糖成分可能介導(dǎo)了病原體的致病過程以及抵御宿主的免疫攻擊，其中LPS是奇異變形桿菌一個潛在的毒力因子，在抵抗抗菌肽過程中扮演了一個顯著的角色[5-6]。由于細菌LPS對哺乳類動物有顯著的致熱性，注射人體和動物后可使機體發(fā)熱，甚至導(dǎo)致休克。近些年化學(xué)法修飾脂多糖抗原的方法越來越受到研究者的關(guān)注，文獻報道堿性羥胺法[7]、堿法[8]、乙酸水解法[9]等能夠有效處理脂多糖的毒性和熱源性，但是對其抗原性研究的報道差異較大，因此本文通過上述三種方法對奇異變形桿菌LPS抗原進行水解，降低LPS抗原內(nèi)毒素含量和致熱性，檢測其對免疫原性的影響，以期建立有效的奇異變形桿菌LPS候選疫苗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源Proteusmirabilis13(PM13)菌株由中國醫(yī)科大學(xué)盛京醫(yī)院分離。

1.1.2 實驗動物 小鼠來自湖南斯萊克景達、SPF級，家兔來自中檢院動物所、SPF級。

1.1.3 試劑及儀器 酪蛋白、酵母浸粉等購自北京奧博星生物技術(shù)公司，葡萄糖、鹽酸羥胺類無機鹽等購自國藥控股有限公司，鱟制劑購自湛江安度斯生物有限公司，鋁佐劑購自丹麥Brenntag Biosector公司；15 L BIOSTAT C PLUS發(fā)酵罐購自貝朗公司，XX42P0080超濾膜包、77410-10蠕動泵購自MILLIPORE公司，離心機J26-XPI 購自BECKMAN COULTER公司，PL1502-S電子天平購自梅特利-托利多。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 以半合成培養(yǎng)基為原料高密度培養(yǎng)奇異變形桿菌， 條件為pH 7.2，250 r/min，8 L/min通氣量，培養(yǎng)至對數(shù)生長后期或靜止期。

1.2.2 奇異變形桿菌LPS抗原純化 發(fā)酵液經(jīng)鹽酸羥胺消化后進行下述純化：8 L消化液12 000 r/min離心10 min，收集可溶性上清液進行超濾，透析1 000倍后濃縮樣品至600 mL。① 堿性羥胺水解法(HA-LPS): 堿性羥胺化法[7]處理LPS組分。具體如下：向LPS組分中加入終濃度為2%(體積分數(shù))鹽酸羥胺溶液，然后用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH為8～9和10～11，搖勻后分別放置于37 ℃和55 ℃孵箱中孵育，選擇2、4、6、8和10 d取樣，4 ℃、10 000 r/min離心10 min后取上清液，測定內(nèi)毒素含量。確定上述條件，制備一系列不同內(nèi)毒素含量HA-LPS組分。② 弱堿水解法(Alkaline-LPS): 參照Rupesh等[8]報道的方法，使用0.05、0.1和0.15 mol/L NaOH溶液水解法處理LPS組分終濃度為2%(體積分數(shù))，分別置于37、50、70、100 ℃，在6、12、18、24 h取樣，4 ℃、10 000 r/min離心10 min后取上清液，測定樣品內(nèi)毒素含量。根據(jù)上述測定結(jié)果確定堿濃度、溫度及時間，制備Alkaline-LPS組分。③ 乙酸水解法(Acid-LPS): 采用乙酸水解法[9]處理LPS組分，通過加入體積分數(shù)為2%乙酸后，置于50、70和100 ℃進行孵育，在2、4、6、8、10 d分別取樣4 ℃、10 000 r/min離心10 min后取上清液(100 ℃孵育120 min)，測定不同時間樣品內(nèi)毒素含量。確定上述條件制備Acid-LPS組分。根據(jù)上述堿性羥胺法、弱堿法及乙酸法確定的試驗條件制備樣品，按照1∶2.5比例加入體積分數(shù)為95%的冷乙醇，使用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)其pH至5.0～6.0，4 ℃下沉淀2 h。4 000 r/min離心10 min，收獲沉淀，加入冷乙醇充分洗滌3次，離心收集的抗原用注射用水完全溶解后，調(diào)節(jié)pH至7.2，低溫冷凍法凍干上述LPS、HA-LPS、Alkaline-LPS、Acid-LPS組分，殘留水分不高于5%(質(zhì)量分數(shù))，進一步開展熱源性、毒性及免疫原性等動物試驗檢測。

1.2.3 內(nèi)毒素檢測 取上述步驟LPS、HA-LPS、Alkaline-LPS、Acid-LPS凍干品，用無熱源水逐級稀釋至101～108， 主要測定105、106、107、108四個數(shù)量級樣品，按《中國藥典》2010版三部附錄Ⅻ E細菌內(nèi)毒素檢查法中凝膠限度法進行檢查。

1.2.4 家兔熱原試驗 用無熱源水將LPS(2 500×104EU/mL)和HA-LPS((25～2.5)×104EU/mL)抗原凍干品稀釋至50～60 μg/mL。選擇2～3 kg家兔3～6只/組，按《中國藥典》2010版三部附錄Ⅻ D注射劑量按家兔體重每1 kg注射1.25～1.5 μg抗原，在規(guī)定時間內(nèi)，觀察家兔體溫升高的情況。

1.2.5 免疫原性測定 選取體重12～14 g 健康清潔級小鼠若干只， 隨機分組， 每組10只，抗原凍干品用生理鹽水稀釋，稀釋度為300、30、3、0.3 μg/mL，每只小鼠腹腔注射0.5 mL，對照組分別注射生理鹽水和0.5 mg/mL氫氧化鋁佐劑。7 d后注射3～5 LD50奇異變形桿菌懸液，觀察5～7 d記錄及統(tǒng)計結(jié)果，計算ED50。

1.2.6 毒性測定 選取體重12～14 g健康清潔級小鼠若干只， 隨機分組， 每組10只，抗原凍干品用生理鹽水稀釋，稀釋度為4、2、1、0.5 mg/mL，每只腹腔注射體積為0.5 mL，對照組注射生理鹽水，觀察5～7 d記錄及統(tǒng)計結(jié)果，計算LD50。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)毒素測定

2.1.1 堿性羥胺水解法 2%(體積分數(shù))堿性羥胺處理奇異變形桿菌LPS抗原內(nèi)毒素結(jié)果見表1所示， LPS抗原內(nèi)毒素含量經(jīng)LAL法測定高于2.5×107EU/mL。

表1 溫度和pH對奇異變形桿菌LPS抗原堿性羥胺法水解的影響

結(jié)果表明，在37 ℃時， pH 8～9及10～11對奇異變形桿菌LPS抗原內(nèi)毒素含量幾乎沒有影響，但在56 ℃時，不同pH對奇異變形桿菌LPS抗原內(nèi)毒素含量在數(shù)量級上出現(xiàn)遞減趨勢，在pH 10～11范圍內(nèi)，孵育6 d即可達到限度值，隨著孵育時間的延長，內(nèi)毒素含量不再發(fā)生變化，然而pH在8～9時，內(nèi)毒素在(2.5～25)×104EU/mL區(qū)間時約需要10 d。

2.1.2 弱堿水解法 奇異變形桿菌LPS抗原在0.15 mol/L弱堿溶液，終濃度為2%(體積分數(shù))條件下，考察37、50、70、100 ℃下孵育2 h，內(nèi)毒素是否發(fā)生變化，測定結(jié)果見表2。奇異變形桿菌LPS抗原在37和50 ℃時，經(jīng)過2 h孵育后，內(nèi)毒素含量結(jié)果相當，均在(250～25)×104EU/mL范圍內(nèi)，與原液對照組(>2.5×107EU/mL)相比，變化不是很明顯；但是經(jīng)過70 ℃或沸水浴后，內(nèi)毒素含量降低顯著，兩者均小于2.5×104EU/mL。因此進一步考察37 ℃下，不同堿溶液濃度及對奇異變形桿菌LPS抗原內(nèi)毒素影響，取樣檢查6、12、18、24 h內(nèi)毒素含量，結(jié)果見表3。結(jié)果所示，堿液濃度在0.05 mol/L，經(jīng)過24 h孵育后，組分內(nèi)毒素含量沒有發(fā)生變化；堿液濃度為0.1 mol/L和0.15 mol/L時，經(jīng)過孵育6～12 h，與原液相比內(nèi)毒素含量降低10倍，再經(jīng)18～24 h后內(nèi)毒素含量減至(2.5～25)×104EU/mL，基本保持不變。

表2 溫度對奇異變形桿菌LPS抗原弱堿水解的影響

2.1.3 乙酸水解法 奇異變形桿菌LPS抗原采用2%(體積分數(shù))乙酸處理，不同溫度及時間下測定內(nèi)毒素結(jié)果見表4。50 ℃孵育8～10 d基本達到25×104EU/mL，可以有效去除LPS抗原中內(nèi)毒素部分，然后采用沸水浴孵育120 min可快速有效去除內(nèi)毒素，但可能會使有效成分失去活性。

表3 弱堿濃度對奇異變形桿菌LPS抗原水解的影響

2.2 熱源測定結(jié)果

采用藥典法測定奇異變形桿菌LPS和 HA-LPS抗原致熱性反應(yīng)，從12只家兔中初步篩選6只合格家兔進行樣品熱源性測定，結(jié)果見表5。LPS組3只家兔溫度分別上升1.40、1.10和0.78 ℃，而HA-LPS組3只家兔溫度僅上升0.21、0.53和0.25 ℃。按藥典結(jié)果判定，HA-LPS組為陰性， LPS組為陽性，具有一定的致熱性。

2.3 免疫原性(ED50)測定結(jié)果

奇異變形桿菌LPS抗原經(jīng)過堿性羥胺法、弱堿法及乙酸法水解后分別獲得HA-LPS、Alkaline-LPS、Acid-LPS 抗原，選擇內(nèi)毒素含量范圍在(25～2.5)×104EU/mL的抗原進行免疫原性測定，分為4組：陽性對照組(LPS)、不含佐劑組(HA-LPS、Alkaline-LPS、Acid-LPS)、含有佐劑組(HA-LPS、Alkaline-LPS、Acid-LPS+Al(OH)3)及陰性對照組(生理鹽水、Al(OH)3)，見表6。數(shù)據(jù)經(jīng)過軟件分析：陽性對照組 ED50為2.869 μg/mL，不含佐劑組無法統(tǒng)計，佐劑組ED50依次為64.183、7.541和4.466 μg /mL，總體上得出結(jié)論：①ED50LPS

表4 溫度對奇異變形桿菌LPS抗原乙酸水解的影響

注：* 單位為min

表5 奇異變形桿菌LPS和HA-LPS抗原致熱反應(yīng)結(jié)果

2.4 毒性(LD50)測定

對奇異變形桿菌LPS、Acid-LPS、Alkaline-LPS及HA-LPS進行毒性測定，結(jié)果見表7。經(jīng)軟件分析LD50分別為1.599 mg/mL 、Max、1.148 mg/mL和0.744 mg/mL。 結(jié)果表明與陽性對照相比，經(jīng)過堿性羥胺水解法、弱堿水解法及乙酸水解法處理后，奇異變形桿菌LPS抗原毒性均降低，其中乙酸水解法降低幅度較大。

表6 奇異變形桿菌 LPS、HA-LPS、Alkaline-LPS和Acid-LPS 抗原ED50測定結(jié)果

3 討 論

本研究使用PM13菌株來自醫(yī)院分離株，以半合成培養(yǎng)基為生產(chǎn)培養(yǎng)基，建立了具有穩(wěn)定性、可重復(fù)性的LPS提取工藝。細菌脂多糖一般由類脂A、核心寡聚糖和O-抗原側(cè)鏈構(gòu)成，其中類脂A是LSP的毒性和生物活性中心，由葡萄胺、磷酸鹽和脂肪酸構(gòu)成，是LPS中心最穩(wěn)定的部分，無種屬特異性。

奇異變形桿菌LPS抗原經(jīng)過堿性羥胺法、弱堿法和乙酸法水解后能夠降低LPS的致熱反應(yīng)，上述方法主要基于堿性羥胺法[7]發(fā)生氨解反應(yīng)從類脂A上脫去整個脂肪酸；弱堿法[8]是在堿性條件下，從類脂A上斷裂鏈接脂肪酸的O-酯鍵，使脂肪酸脫離除去；而乙酸法[9]主要通過乙酸水解，斷裂LPS鏈上KDO和類脂A之間的鍵，形成O-SP部分。目前，乙酸水解法已廣泛應(yīng)用于結(jié)合疫苗脂多糖成分的研究，趙志強等[10]采用乙酸水解法獲取甲型副傷寒沙門菌O-SP組分，通過CDAP對O-SP活化、ADH衍生、EDAC縮合等步驟結(jié)合至破傷風(fēng)類毒素TT上形成甲型副傷寒結(jié)合疫苗；謝茂超等[11]采用乙酸水解法制備銅綠假單胞菌O-SP抗原，通過化學(xué)結(jié)合破傷風(fēng)類毒素形成O-SP-TT疫苗，結(jié)果表明與O-SP相比，其能夠刺激小鼠產(chǎn)生高效的IgG抗體。

小鼠免疫原性檢測表明奇異變形桿菌LPS抗原ED50為2.869 μg/mL，經(jīng)過堿性羥胺法、弱堿法和乙酸法水解LPS抗原ED50均無法計算，進一步研究向抗原中加入氫氧化鋁佐劑，有利于增強機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力，提高LPS抗原水解后的免疫活性，試驗結(jié)果表明與無Al(OH)3組相比較， HA-LPS/Al(OH)3、Alkaline-LPS/Al(OH)3和Acid-LPS/Al(OH)3組免疫原性較好，為進一步研究奇異變形桿菌LPS疫苗以及由其引起感染的預(yù)防提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

[1] 林茂虎，魯鴻，賈寧.變形菌屬引發(fā)導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染的研究[J]. Chin J Nosocomiol，2004，14 (4)：468-470.

[2] 鄧晶榮.某院2011-2014年變形桿菌病原菌分布及耐藥性變遷分析[J].淮海醫(yī)藥，2016，34 (1)：90-91.

[3] Harry L.T.，Mobley，Belas R. Swarming and pathogenicity ofProteusmirabilisin the urinary tract[J]. Trends Microbiol，1995，3(7)：280-284.

[4] Nicole M.，Collins C.M.，O’Hanley P. Efficacy of aProteusmirabilisOuter Membrane Protein Vaccine in Preventing ExperimentalProteusPyelonephritis in a BALB/c Mouse Model[J]. Infection and Immunity，1991，59(10)：3778-3786.

[5] Rozalski A.，Sidorczyk Z.，Kotelko K. Potential virulence factors ofProteusbacilli[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews，1997，61(1)：65-89.

[6] Mccoy A. J.，Liu H. J.，F(xiàn)alla T. J.，et al. Identifications ofProteusmirabilismutants with increased sensitivity to antimicrobial peptides[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2001，45(7)：2030-2037.

[7] McIntire F.C.，Sievert H.W.，Barlow G.H.，et al. Chemical，Physical，and Biological Properties of a Lipopolysaccharide fromEscherichiacoliK-235[J].Biochemistry，1967，6 (8)：2363-2372.

[8] Rupesh K. M.，F(xiàn)abien R. P.，Sylvain R.，et al. β-Hydroxymyristic acid as a chemical marker to detect endotoxins in dialysis water[J]. Analytical Biochemistry，2015，(470)：71-77.

[9] Michael D.J.，Evgeny V.，John F.N.，et al. The core and Opolysaccharide structure of the Caulobacter crescentus lipopolysaccharide[J].Carbohydrate Research，2015，(402)：111-117.

[10]趙志強，楊朝暉，計永莉，等.甲型副傷寒結(jié)合疫苗的制備及其免疫原性研究[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志，2006，26(11)：1048-1052.

[11]謝茂超 ，陳明拓，姜曉，等. 銅綠假單胞菌3型O-特異性多糖-破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫苗的制備及其免疫特性分析[J].中國生物制品學(xué)雜志，2012，25 (12):1565-1568.

Effect of Alkaline Hydroxylamine, Mild Alkaline and Acetic Acid Hydrolysis LPS Antigen and Activity ofProteusmirabilis

YANG Wen-yao, WANG Ying, WANG Qi, XIU Xue-liang, DAI Ze-wen, ZHANG Jian, ZHOU Li-bao

(LiaoningChengdaBio-Tech.Co.Ltd.,Shenyang110179)

ProteusmirabilisLPS antigen was hydrolyzed adopting alkaline hydroxylamine, mild alkaline and acetic acid to study the effect of its activity on mice. The determination results showed that as compared with the pre-treatment, three methods could reduce endotoxin levels of LPS antigen from 2 500×104EU/mL to (250～2.5)×104EU/mL. Pyrogenic properties showed almost no significant effects on the rabbit body temperature. However, immunogenicity results showed that ED50 LPS

Proteusmirabilis; LPS antigen; endotoxin; pyrogenic properties; immunogenicity; toxicity

遼寧省沈陽市渾南新區(qū)科學(xué)技術(shù)計劃項目(20111014)

楊文腰 男，碩士研究生。主要從事疫苗方面研究工作。E-mail：yangwenyao1982@sina.com

2015-12-15；

2016-04-26

Q936

A

1005-7021(2016)06-0088-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.015