微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究新進(jìn)展

修志龍， 姜莉莉，2， 傅宏鑫， 周瑾潔， 權(quán)春善

(1.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.營(yíng)口理工學(xué)院 化學(xué)與材料工程系，遼寧 營(yíng)口 115014；3.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

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微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-丙二醇的研究新進(jìn)展

修志龍1， 姜莉莉1，2， 傅宏鑫1， 周瑾潔1， 權(quán)春善3

(1.大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024；2.營(yíng)口理工學(xué)院 化學(xué)與材料工程系，遼寧 營(yíng)口 115014；3.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物技術(shù)與生物資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116600)

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一種重要的化工原料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化工、食品及化妝品等行業(yè),同時(shí)1,3-PD 是合成聚對(duì)苯二甲酸丙二酯(PTT)的重要單體，市場(chǎng)需求量逐年增多?；谏鷳B(tài)友好型、生產(chǎn)安全和可持續(xù)發(fā)展的要求，利用微生物轉(zhuǎn)化可再生資源來(lái)生產(chǎn)1,3-PD受到了人們的廣泛重視。綜述了微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD的菌株、代謝途徑、發(fā)酵和下游分離工藝及其新進(jìn)展，并對(duì)工業(yè)生產(chǎn)中利用生物技術(shù)生產(chǎn)1,3-PD的未來(lái)前景和挑戰(zhàn)進(jìn)行了探討。

1,3-丙二醇；微生物發(fā)酵；代謝途徑；下游分離工藝

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一種無(wú)色、無(wú)味的黏稠液體，可溶于水、醇、醚等多種有機(jī)溶劑，是一種重要的化工原料?？捎糜谌軇⒖箖鰟?、增塑劑、乳化劑、防腐劑、洗滌劑和潤(rùn)滑劑等領(lǐng)域，在食品、醫(yī)藥、化妝品和有機(jī)合成中也有著重要應(yīng)用[1]。此外，1,3-PD還可以作為單體合成聚酯、聚醚、聚氨酯和雜環(huán)化合物如吲哚和喹啉。以1,3-PD為單體合成的新型聚酯材料—PTT(聚對(duì)苯二甲酸丙二酯)，具有優(yōu)異的回彈性、易染性、抗污性，并且具有可生物降解特性[2]。近年來(lái)，我國(guó)科技部已將PTT列入“十三五”科技規(guī)劃中，隨著PTT等新型生物可降解塑料的市場(chǎng)需求量不斷擴(kuò)大，1,3-PD作為PTT生產(chǎn)的重要原料市場(chǎng)需求量將逐年增多。傳統(tǒng)的商品化1,3-PD由化學(xué)法合成，如杜邦公司(DuPont)的丙烯醛法和殼牌公司(Shell)的環(huán)氧乙烷法。杜邦公司的路線是先通過(guò)水合作用將丙烯醛轉(zhuǎn)換成3-羥基丙醛(3-HPA)，再通過(guò)加氫作用生成1,3-PD[3]。殼牌公司先將環(huán)氧乙烷通過(guò)甲?；饔眉託湫纬?-HPA，再通過(guò)加氫作用生成1,3-PD[4]。化學(xué)合成法生產(chǎn)1,3-PD的缺點(diǎn)是在甲?；^(guò)程和加氫過(guò)程中需要高壓、高溫的條件并使用昂貴的催化劑，而且反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生有毒的中間化合物3-HPA。目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD主要有兩種途徑：一是由杜邦公司(DuPont)和杰能科公司(Genencor)聯(lián)合研發(fā)的利用重組大腸埃希菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1,3-PD[5];二是通過(guò)自然界微生物轉(zhuǎn)化甘油來(lái)成產(chǎn)1,3-PD[6]。早在1881年，August Freund就發(fā)現(xiàn)了在含有Clostridiumpasteurianum的甘油混合發(fā)酵過(guò)程中有1，3-PD的產(chǎn)生[7]，但是人們對(duì)其關(guān)注一直較少。直到近年來(lái)，石油資源日益枯竭，環(huán)境污染嚴(yán)重，與此同時(shí)生物柴油產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，其副產(chǎn)物甘油不斷過(guò)剩，使得微生物發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PD又重新受到了人們的重視[8]。盡管微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD需要面對(duì)化學(xué)合成法的激烈競(jìng)爭(zhēng)，但由于其潛在的巨大經(jīng)濟(jì)效益，具有生產(chǎn)成本低、綠色環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展等特點(diǎn)，使該方法引起了國(guó)內(nèi)外相關(guān)企業(yè)和研究單位的高度重視，并不斷涌現(xiàn)出新的方法和技術(shù)。

1 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD

1.1 菌種

1.1.1 天然菌株 自然界中具有轉(zhuǎn)化甘油生成1,3-PD能力的微生物，主要包括克雷伯氏菌屬(Klebsiella)[9-10]、梭菌屬(Clostridia)[11-14]、腸桿菌屬(Enterobacter)[7]、檸檬酸菌屬(Citrobacter)[15-16]和乳酸桿菌屬(Lactobacilli)[17](表1)，其中肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)和丁酸梭菌(Clostridiabutyricum)由于具有較好的底物耐受性、高的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度等特點(diǎn)，而受到更多的關(guān)注和研究。C.butyricum是一種典型的嚴(yán)格厭氧菌，生長(zhǎng)較慢，但副產(chǎn)物較少；而K.pneumoniae在有氧、微氧或厭氧的條件下都能以甘油為底物較快速地生長(zhǎng)，但副產(chǎn)物較多。

表1 利用不同微生物菌株發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD

注：FB：批次流加發(fā)酵；B：間歇發(fā)酵

1.1.2 基因工程菌株 杜邦公司(DuPont)和杰能科公司(Genencor)研發(fā)重組大腸埃希菌可以將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1,3-PD，在基因工程菌構(gòu)建領(lǐng)域做出了里程碑性的工作，并已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)[5]。出于保護(hù)商業(yè)價(jià)值的需要，杜邦公司已通過(guò)專利申請(qǐng)將相關(guān)的技術(shù)和工藝進(jìn)行了嚴(yán)密的保護(hù)，菌株構(gòu)建的細(xì)節(jié)也較少報(bào)道，使得該技術(shù)形成了高度壟斷，導(dǎo)致其他研究單位不得不放棄相關(guān)的科學(xué)研究。Liang等[17]報(bào)道在Escherichiacoli中構(gòu)建了一個(gè)從葡萄糖生產(chǎn)1,3-PD的脅迫誘導(dǎo)途徑，獲得的1,3-PD質(zhì)量濃度較低(12.1 g/L)。更多的基因工程菌開(kāi)發(fā)則用于改變菌株代謝途徑，降低副產(chǎn)物的形成[18-20]，如Xu等[18]從高產(chǎn)乳酸的菌株中篩選出一株D-乳酸缺陷的突變菌株KlebsiellapneumoniaeHR526，通過(guò)敲除該突變菌株中編碼D-乳酸脫氫酶的ldhA基因，可以產(chǎn)生質(zhì)量濃度高達(dá)102 g/L的1,3-PD，轉(zhuǎn)化率為0.52 mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度可以達(dá)到2.13 g/L/h，但是在降低乳酸的同時(shí)其余副產(chǎn)物如2,3-丁二醇、琥珀酸、乙醇的產(chǎn)量均有所增加。還有一些研究試圖增加工程菌株對(duì)高濃度的1,3-PD或者中間產(chǎn)物(3-HPA)的耐受性，如Otte等[21]利用基因組重排法來(lái)篩選高產(chǎn)1,3-PD和耐受有機(jī)酸的Clostridiumdiolis菌株。

1.2 代謝途徑

在厭氧條件下，甘油擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后除了為自身生長(zhǎng)提供能量和原料外，還沿著氧化途徑和還原途徑進(jìn)行代謝[1]。氧化途徑為菌體生長(zhǎng)提供必要的能量，同時(shí)也為還原途徑提供還原力，而還原途徑消耗還原力，保證了整個(gè)代謝過(guò)程N(yùn)AD+/NADH2的平衡。

在氧化支路上，甘油在甘油脫氫酶(glycerol dehydrogenase, GDH)的作用下氧化生成二羥丙酮(dihydroxyacetone, DHA)，同時(shí)將NAD+還原成NADH，然后在二羥丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase, DhaK)的作用下消耗ATP，磷酸化生成磷酸二羥丙酮(dihydroxyacetonephosphate, DHAP)，進(jìn)入糖酵解途徑產(chǎn)生各種副產(chǎn)物。不同菌株在氧化途徑中生成的副產(chǎn)物不一樣，如：丁酸和正丁醇只在梭菌屬中才產(chǎn)生，而2,3-丁二醇僅由腸桿菌屬產(chǎn)生，所有產(chǎn)生菌中最常見(jiàn)的副產(chǎn)物是乙酸和乙醇。常用的C.butyricum副產(chǎn)丁酸和乙酸，而K.pneumoniae則副產(chǎn)2,3-丁二醇、乙酸、乙醇以及乙偶姻(3-羥基-2-丁酮)、乳酸、琥珀酸等。副產(chǎn)物的合成消耗大量的底物并降低了轉(zhuǎn)化率，同時(shí)也給1,3-PD的分離提取帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[22]。

在還原支路中，甘油在甘油脫水酶(glycerol dehydratase, GDHt)作用下脫水生成3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA)，然后在1,3-PD氧化還原酶(1,3-propanediol oxidoreductase, PDOR)作用下消耗還原力NADH形成1,3-PD。底物限制條件下，GDHt是產(chǎn)物生成的限速酶；底物過(guò)量時(shí)，PDOR是限速酶[23]，此時(shí)溢出的3-HPA抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝。

2 發(fā)酵工藝

2.1 一步發(fā)酵法

一步發(fā)酵法通常指利用天然微生物菌株發(fā)酵甘油生產(chǎn)1,3-PD，或者利用基因工程菌株直接以葡萄糖為底物生產(chǎn)1,3-PD的發(fā)酵過(guò)程。為了降低原料成本，許多學(xué)者嘗試?yán)么指视突蛘哂闷咸烟?、蔗糖、麥芽糖、木糖、半纖維素水解液等作為共底物來(lái)生產(chǎn)1,3-PD。近年來(lái)一些研究表明，來(lái)自生物柴油的粗甘油中所存在的各種雜質(zhì)并沒(méi)有對(duì)Clostridiumbutyricum(VPI 1718) 和Klebsiellapneumoniae生產(chǎn)1,3-PD產(chǎn)生抑制作用[9，24-25]。在K.pneumoniae的批次流加發(fā)酵過(guò)程中，使用粗甘油比純甘油生產(chǎn)1,3-PD的效率更高[9]。在K.pneumoniae中對(duì)甘油和葡萄糖的共底物發(fā)酵進(jìn)行了化學(xué)計(jì)量分析表明，在厭氧條件下當(dāng)葡萄糖與甘油的摩爾比為0.32時(shí)，甘油可以100%轉(zhuǎn)化為1，3-PD[26]。在批次流加發(fā)酵中，利用甘油和半纖維素水解液作為共底物進(jìn)行發(fā)酵，K.pneumoniae生產(chǎn)1,3-PD的濃度和轉(zhuǎn)化率分別增加17.8%和25%[27]；木質(zhì)纖維素水解液能使Clostridumdiolis的1, 3-PD得率由0.62 mol/mol提高到0.82 mol/mol[28]。

2.2 兩步發(fā)酵法和多階段發(fā)酵法

兩步發(fā)酵法指的是將兩個(gè)不同微生物在不同的條件下進(jìn)行發(fā)酵的過(guò)程，其目的是為了每一步都獲得最大的生長(zhǎng)速率。Hartlep等[29]利用耐滲酵母Pichiafarinose或重組E.coli和K.pneumoniae進(jìn)行兩步發(fā)酵，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為1,3-PD，但1,3-PD的轉(zhuǎn)化率僅為0.17 g/g。另外，Mendes等[30]也進(jìn)行了兩步發(fā)酵法的研究，它們利用兩個(gè)重組微生物SaccharomycescerevisiaeHC42和ClostridiumacetobutylicumDG1轉(zhuǎn)化葡萄糖和糖蜜生產(chǎn)1,3-PD。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)葡萄糖的初濃度為103 g/L時(shí)，1,3-PD的質(zhì)量濃度最高達(dá)到25.5 g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為0.16 g/L/h,甘油的轉(zhuǎn)化率為0.56 g/g，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率為0.24 g/g。兩步發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率比杜邦公司的一步發(fā)酵的轉(zhuǎn)化率(0.51 g/g)低得多。

不同于兩步發(fā)酵法轉(zhuǎn)化糖生成1,3-PD，多階段發(fā)酵法的目的是在利用甘油作為唯一碳源的連續(xù)發(fā)酵中提高1,3-PD的濃度、生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率。兩階段連續(xù)發(fā)酵法最初用于Citrobacterfreundii[31]：第一階段發(fā)酵通過(guò)限制基質(zhì)來(lái)增加生物量；第二階段通過(guò)降低稀釋速率來(lái)增加1,3-PD的產(chǎn)量。1,3-PD的最高濃度可達(dá)41.42 g/L，此時(shí)生產(chǎn)強(qiáng)度為1.38 g/L/h。之后，Papanikolaou等[32]利用新篩選的Clostridiumbutyricum來(lái)進(jìn)行兩階段連續(xù)發(fā)酵，并獲得了更高的生產(chǎn)強(qiáng)度3.4 g/L/h。第一階段利用高稀釋速率來(lái)提高1，3-PD的生產(chǎn)強(qiáng)度，第二階段利用較低的稀釋速率來(lái)增加1,3-PD的濃度。

3-羥基丙醛(3-HPA)是1,3-PD發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中一個(gè)關(guān)鍵的中間產(chǎn)物，該物質(zhì)具有毒性會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并降低目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[33]。為了消除3-HPA的毒性并維持高的1,3-PD的產(chǎn)量，利用K.pneumoniae研究了兩階段批次流加策略。第一階段進(jìn)行批次發(fā)酵甘油的初濃度為40 g/L，攪拌速率為250 r/min；第二階段利用新鮮的甘油進(jìn)行流加，攪拌速率為300 r/min，最終1,3-PD的濃度、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強(qiáng)度分別達(dá)到了74.07 g/L、0.62 mol/mol、3.09 g/L/h[34]。

2.3 共培養(yǎng)發(fā)酵法

共培養(yǎng)發(fā)酵法是指在一定條件下混合培養(yǎng)特定的不同微生物菌株的發(fā)酵方法。由于淀粉或葡萄糖與甘油相比更為廉價(jià)，但是自然界中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)可以直接轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)1,3-PD的菌株，因此共培養(yǎng)發(fā)酵策略被用于直接利用葡萄糖生產(chǎn)1,3-PD的研究。Ma等[35]利用ZygosacharomycesrouxiiJL2011 和KlebsiellapneumoniaeS6兩種菌共培養(yǎng)直接轉(zhuǎn)化葡萄糖生產(chǎn)1,3-PD。在7 L的反應(yīng)器中，1,3-PD的最高濃度達(dá)到了15.2 g/L。然而在共培養(yǎng)條件下，葡萄糖生成1,3-PD的轉(zhuǎn)化率要比兩步發(fā)酵法的轉(zhuǎn)化率低很多，可能的原因是在一個(gè)反應(yīng)器中很難控制并同時(shí)滿足兩種菌不同的生長(zhǎng)需求，如基質(zhì)、需氧條件和pH等。

在利用微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)1,3-PD的過(guò)程中，由于需要平衡反應(yīng)過(guò)程中的還原力，常伴隨乙酸、乳酸、琥珀酸等有機(jī)酸和其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生。有機(jī)酸的積累常常抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并且降低基質(zhì) (甘油) 轉(zhuǎn)化為1,3-PD的收率，副產(chǎn)物的存在也給下游產(chǎn)品的分離純化帶來(lái)了困難[22]。Bizukojc等[36]利用甲烷生產(chǎn)菌(Methanosarcinamazei)和1,3-PD生產(chǎn)菌(Clostridiumbutyricum)共培養(yǎng)來(lái)轉(zhuǎn)化1,3-PD生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物如有機(jī)酸成為甲烷。另外，Szymanowska-Powalowska等[37]分離篩選出了AlcaligenesfaecalisJP1可以利用ClostridiumbutyricumDSP1產(chǎn)生的副產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)表明通過(guò)共培養(yǎng)兩種菌株1，3-PD的生產(chǎn)強(qiáng)度和轉(zhuǎn)化率分別提高到1.07 g/L/h和0.53 g/g。與此同時(shí)，乳酸和乙酸幾乎全部被AlcaligenesfaecalisJP1利用，而且丁酸的濃度也降到1 g/L以下。

2.4 微生物菌群發(fā)酵

目前，微生物法發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的研究主要是以微生物純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)。微生物純培養(yǎng)技術(shù)需要嚴(yán)格的無(wú)菌操作、使用的原料具有一定的純度，而且生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生有機(jī)酸和醇類等副產(chǎn)物，這些都增加了生產(chǎn)成本。為了克服純培養(yǎng)技術(shù)的缺點(diǎn)，進(jìn)一步降低生物法生產(chǎn)1,3-PD的成本，微生物菌群發(fā)酵法近年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。與傳統(tǒng)純種發(fā)酵相比，微生物菌群發(fā)酵的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在：可以使用更為廉價(jià)和復(fù)雜的基質(zhì)作為原料；通過(guò)協(xié)調(diào)菌群組成既可以利用不同微生物的代謝途徑獲得多個(gè)目標(biāo)產(chǎn)物，又可以使產(chǎn)物范圍變窄，利于下游物質(zhì)分離純化；微生物菌群具有很高的生物多樣性，可以在不滅菌的條件下操作，抗噬菌體感染能力和生產(chǎn)操作上的安全性得以提升[38]。

Temudo等[39]從酒廠廢水和土豆淀粉加工廠的污泥中篩選出了可以利用甘油生產(chǎn)1,3-PD的混合菌群。該菌群的甘油利用濃度為4～25 g/L，主產(chǎn)物為乙醇，1,3-PD的轉(zhuǎn)化率僅為0.16 mol/mol。雖然該研究的產(chǎn)業(yè)化價(jià)值不大，但是為工業(yè)生產(chǎn)1,3-PD提供了一種新的思路，也是對(duì)純種發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD的一種新的突破和挑戰(zhàn)。

近年來(lái)，我們課題組從大連海岸海泥中篩選出了一組兼性微生物菌群 (GenBank Accession No.：SRP066989)。該菌群可以將甘油轉(zhuǎn)化為1,3-PD，并且具有良好的底物耐受性，間歇發(fā)酵甘油的初始濃度可達(dá)200 g/L，1,3-PD產(chǎn)量達(dá)到81.40 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率為0.63 mol/mol；且發(fā)酵產(chǎn)物中副產(chǎn)物較少，尤其是不含2,3-丁二醇，有利于主產(chǎn)物1,3-PD的分離[40]。另外，我們還從厭氧活性污泥中篩選出一組天然微生物菌群C2-2M，可以高效轉(zhuǎn)化粗甘油為1,3-PD。經(jīng)16S rRNA基因檢測(cè)，C2-2M以丁酸梭菌為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌 (97.34%)，同時(shí)含雙酶梭菌 (0.81%)、谷糠乳桿菌 (0.01%) 及未鑒定梭菌屬 (1.82%)。批式流加發(fā)酵結(jié)果表明，連續(xù)補(bǔ)料能生成85.21 g/L 1,3-PD，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到 0.73 mol/mol，生產(chǎn)強(qiáng)度為1.73 g/L/h，副產(chǎn)物為8.52 g/L乙酸及16.11 g/L丁酸。微生物菌群發(fā)酵克服了單一菌株底物耐受性差、副產(chǎn)物多的缺點(diǎn)，提高了生產(chǎn)效率，為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD的工業(yè)化提供了簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)的發(fā)酵工藝。

2.5 微生物電池

微生物電合成(microbial electrosynthesis，MES)也稱微生物電解池(microbial electrolysis cells，MEC)，是近年來(lái)新興的微生物學(xué)與電化學(xué)相結(jié)合的交叉技術(shù)。甘油在微生物細(xì)胞中代謝屬于歧化反應(yīng)：在氧化途徑中生成醇類和有機(jī)酸等副產(chǎn)物，伴隨生物質(zhì)、生物能 ATP 及還原當(dāng)量NADH2的生成。在還原途徑中合成 1,3-PD，并消耗還原當(dāng)量 NADH2。胞內(nèi)氧化還原水平是限制1,3-PD 產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，而 MES 可打破胞內(nèi)氧化還原平衡，促進(jìn)還原力 NADH2再生，進(jìn)而提高了1,3-PD 的產(chǎn)量，并且降低氧化途徑中副產(chǎn)物的產(chǎn)生。因此，MES 偶聯(lián) 1,3-PD 發(fā)酵受到人們的關(guān)注[41]。

已有研究表明，以甘油為底物電化學(xué)驅(qū)動(dòng)Clostridiumpasteurianum， 代謝流流向還原支路，提高NADH2/NAD+比例，進(jìn)而使1,3-PD 產(chǎn)量由 60 mmol/L提高至 92 mmol/L[42]。在微生物菌群結(jié)合MES 條件下，1,3-PD 濃度可增至 42 g/L，已接近傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)量[43]。但也有研究顯示，外源電子的引入并未導(dǎo)致Klebsiellapneumoniae顯著提高 1,3-PD 產(chǎn)量，推測(cè)原因是當(dāng)外源電子進(jìn)入細(xì)胞后NAD+并非是外源電子受體，因此外源電子的引入對(duì) 1,3-PD 的產(chǎn)量影響不大，反而提高了氧化支路中乳酸及乙醇的產(chǎn)量[44]。外源電子引入后電子流向及具體機(jī)制還需要深入研究。

3 下游分離工藝

1,3-PD發(fā)酵液的成分十分復(fù)雜，除了1,3-PD外(濃度約為5%～15%)，還包括2,3-丁二醇、乙醇、乙酸、丁酸、乳酸、琥珀酸等副產(chǎn)物，無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)鹽類和殘留的葡萄糖或甘油等小分子物質(zhì)，以及蛋白質(zhì)、多糖、核酸等大分子物質(zhì)。因此，從發(fā)酵液中分離1,3-PD面臨很大的技術(shù)挑戰(zhàn)。一般而言，1,3-PD下游分離工藝大體依照如下步驟：發(fā)酵液經(jīng)絮凝或膜過(guò)濾去除菌體和部分大分子物質(zhì)，然后再通過(guò)醇沉、電滲析、離子交換、吸附、萃取來(lái)去除發(fā)酵液中的雜質(zhì)，最后通過(guò)精餾操作得到1,3-PD。生物法生產(chǎn)1,3-PD，下游分離成本占總成本的50%以上，成為其工業(yè)化生產(chǎn)亟需解決的瓶頸性問(wèn)題[22]。

3.1 發(fā)酵液的預(yù)處理技術(shù)

1,3-PD濃縮提純前需要對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，去除其中的菌體、蛋白和鹽類，否則精餾高溫過(guò)程會(huì)使蛋白變性、鹽結(jié)晶析出，降低蒸發(fā)效率和產(chǎn)品收率。絮凝是指向發(fā)酵液中添加絮凝劑(如殼聚糖和聚丙烯酰胺)，促使菌體和生物大分子物質(zhì)形成絮團(tuán)，從而加快其沉降速度，達(dá)到固液分離的目的。該方法具有過(guò)程簡(jiǎn)單、操作費(fèi)用低的優(yōu)點(diǎn)，但是雜質(zhì)脫除效果較膜過(guò)濾而言較差。膜過(guò)濾常采用微濾(0.2 μm)、超濾(1 000～50 000 Da)和納濾(200～400 Da)中的一種或多種組合實(shí)現(xiàn)，該方法對(duì)菌體和大分子物質(zhì)去除效果好，但存在膜污染、操作成本高等問(wèn)題。醇沉是通過(guò)向發(fā)酵液中添加醇類有機(jī)溶劑，從而使蛋白質(zhì)、多糖、核酸和鹽類沉淀析出[45]。本課題組考察了超濾-醇沉工藝對(duì) 1,3-PD發(fā)酵液的除雜效果，添加2倍體積乙醇可使?jié)饪s發(fā)酵液中蛋白、核酸和鹽的去除率分別達(dá)到97.4%、89.7%和95.8%，并指出發(fā)酵液在低含水量、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿條件下醇沉效果顯著，但該方法存在有機(jī)溶劑用量大、溶劑揮發(fā)損耗等問(wèn)題[46]。電滲析是指在電場(chǎng)作用下，溶液中的離子選擇性的通過(guò)膜而遷移，從而使某些離子在一側(cè)富集而得到去除，該技術(shù)可用于發(fā)酵液中鹽類的去除。Gong等[47]首先對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行絮凝去除發(fā)酵液中的大分子物質(zhì)，然后采用電滲析除去小分子鹽類，使有機(jī)酸鹽去除率達(dá)到90%，但是電滲析操作造成產(chǎn)品損失，且膜易污染，成本高。離子交換法也可用于發(fā)酵液中鹽分的去處，但是樹(shù)脂容易達(dá)到飽和，需要頻繁再生，同時(shí)產(chǎn)生大量的廢水[48]。

3.2 1,3-PD的分離技術(shù)

通過(guò)吸附、萃取和反應(yīng)萃取等方式也可以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵液中1,3-PD的選擇性分離。Anand 等[49]考察了不同樹(shù)脂對(duì) 1,3-PD的吸附能力，其中包括 DEAE-纖維素、Amberlite 和 Dowex Monosphere 離子交換樹(shù)脂以及硅樹(shù)脂。結(jié)果顯示，硅樹(shù)脂在不同 pH條件下的分離效果均好于離子交換樹(shù)脂，這主要?dú)w因于羥基與硅表面存在較強(qiáng)的相互作用力。選用氯仿和甲醇混合溶液進(jìn)行梯度洗脫，最終1,3-PD收率達(dá)到89%。Cho等[50]同樣使用硅樹(shù)脂并將其應(yīng)用于乙酸乙酯相中 1,3-PD與 1,2-PD的分離，作為最終的提純工藝，1,3-PD的純度和收率分別達(dá)到98%和 82%。由于樹(shù)脂吸附量較小，需要頻繁再生，而且洗脫后1,3-PD的濃度明顯降低，使得后續(xù)分離能耗增加。Malinowski[51]使用UNIFCA基團(tuán)貢獻(xiàn)法對(duì)潛在的萃取劑進(jìn)行了初步篩選，最終選取了醇類和醛類溶劑，并考察了其對(duì) 1,3-PD的萃取效果。但是，1,3-PD在所選萃取劑中的分配系數(shù)均小于 0.3。由于1,3-PD的極性較強(qiáng)，采用物理萃取和絡(luò)合萃取很難實(shí)現(xiàn)高效的分離，該作者又提出了反應(yīng)萃取工藝[52]。1,3-PD與乙醛可以形成 2-甲基-1,3-二氧六環(huán)，而后者可以被芳香烴類有機(jī)溶劑萃取，隨后通過(guò)有機(jī)相中 2-甲基-1,3-二氧六環(huán)的水解反應(yīng)就能獲得 1,3-PD。其中，2-甲基-1,3-二氧六環(huán)的得率和萃取率分別達(dá)到91%～94%和70%～75%[52]。然而，真實(shí)發(fā)酵液中的雜質(zhì)容易使催化劑失活，并且可以和乙醛反應(yīng)從而降低反應(yīng)效率，同時(shí)醛類物質(zhì)的殘留也會(huì)對(duì)后續(xù)聚酯(PTT)的制備產(chǎn)生不良影響。最近，Kaur等[53]考察了使用乙酸乙酯用于1,3-PD原位分離的可行性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示1,3-PD的產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度均得到了顯著的提升，但是對(duì)后續(xù)的分離純化未作報(bào)道。1,3-PD在離子液體/磷酸鹽雙水相體系中的分配系數(shù)介于1.5～22.7，但是該技術(shù)仍有許多問(wèn)題需要解決，包括成相物質(zhì)的回收、產(chǎn)品的分離純化、發(fā)酵液成分對(duì)萃取效果的影響等[54]。

3.3 鹽析萃取和糖析萃取技術(shù)

近些年，本課題組對(duì)鹽析萃取(Salting-out extraction,SOE)技術(shù)在生物基化學(xué)品下游分離純化方面的應(yīng)用開(kāi)展了深入的研究[55-60]。鹽析萃取是以有機(jī)溶劑作萃取劑、無(wú)機(jī)鹽作鹽析劑，在兩者的綜合作用下從水相中萃取親水性目標(biāo)產(chǎn)物的一種分離方法，具有成相物質(zhì)廉價(jià)且易于回收、分相速度快、易于連續(xù)化操作等優(yōu)點(diǎn)[55-61]。Li等[62]利用乙醇/硫酸銨鹽析萃取體系分離發(fā)酵液中的1,3-PD，分配系數(shù)和回收率分別達(dá)到4.77和93.7%。同時(shí)副產(chǎn)物2,3-丁二醇分配在上相，殘留底物甘油和無(wú)機(jī)鹽富集于下相，菌體和蛋白質(zhì)聚集于中間相(去除率達(dá)到了99.7%和79%),表明該技術(shù)可以直接應(yīng)用于發(fā)酵液且可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)固液分離、目標(biāo)產(chǎn)物的分離和部分純化，減少了分離步驟，有助于提高產(chǎn)品收率并降低分離成本。隨后，乙醇/磷酸氫二鉀[63]和甲醇/磷酸氫二鉀[64]體系也成功應(yīng)用于1,3-PD發(fā)酵液，其回收率均達(dá)到98%，菌體和蛋白質(zhì)的去除率也都大于 90%。在甲醇/磷酸氫二鉀鹽析萃取體系中，上相甲醇和1,3-PD可通過(guò)精餾的方式得到回收，下相中的磷酸鹽通過(guò)pH 調(diào)節(jié)、甲醇溶析結(jié)晶的方式使其收率達(dá)到95%[64]。值得一提的是，乙醇/碳酸鈉鹽析萃取體系還可以整合發(fā)酵與分離過(guò)程，萃取結(jié)束后的下相(碳酸鈉溶液)可用于發(fā)酵過(guò)程中 pH 值的調(diào)節(jié)，發(fā)酵結(jié)果顯示 1,3-PD和乳酸的量均得到了提高，同時(shí)副產(chǎn)物乙酸和甲酸的濃度有所下降。此外，下相鹽溶液還可以用來(lái)回收發(fā)酵過(guò)程中排放的二氧化碳，同時(shí)碳酸鈉被轉(zhuǎn)換為溶解度較低的碳酸氫鈉而得到回收，在降低生產(chǎn)成本的同時(shí)也減少了溫室氣體的排放[65]。隨后，Song 等[66]通過(guò)兩步鹽析萃取 (異丙醇/碳酸鉀和乙醇/碳酸鉀體系) 實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵液中 1,3-PD和乳酸的選擇性分離，回收率分別達(dá)到92.4%和73.8%。此外，F(xiàn)u等[67]考察了填料萃取塔對(duì)發(fā)酵液中1,3-PD的連續(xù)萃取效果，設(shè)備連續(xù)運(yùn)行11 h，1,3-PD回收率達(dá)到90.30%。因此，鹽析萃取工藝有助于簡(jiǎn)化分離過(guò)程，提高目標(biāo)產(chǎn)物收率，且具有工業(yè)放大的可行性。

在此基礎(chǔ)上，為了避免鹽析萃取體系中高濃度無(wú)機(jī)鹽的添加和回收，本課題組又提出了糖析萃取技術(shù)。該方法是向發(fā)酵液中加入糖或糖和少量可溶性無(wú)機(jī)鹽來(lái)萃取1,3-PD，萃取后的下相經(jīng)稀釋后直接用于發(fā)酵從而實(shí)現(xiàn)下相的重復(fù)利用，實(shí)現(xiàn)了分離與發(fā)酵的耦合，減少了廢水的排放，降低了分離能耗[68]。如選取葡萄糖/異丙醇體系，1,3-PD回收率可達(dá)80%，發(fā)酵液中菌體、無(wú)機(jī)鹽和蛋白的去除率分別為99%、99.5%和87%。當(dāng)向體系中額外添加一定質(zhì)量硫酸銨(可作為發(fā)酵氮源)，1,3-PD的回收率可升至89.9%。糖析萃取結(jié)束后，上相異丙醇可通過(guò)減壓蒸餾回收并循環(huán)使用，而下相高濃度糖溶液可經(jīng)稀釋用于種子培養(yǎng)和發(fā)酵，表明該技術(shù)是一種很有工業(yè)應(yīng)用前景的新型分離方法[68]。

4 展 望

利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)1,3-PD是適應(yīng)可持續(xù)發(fā)展的必然要求，建立成功的1,3-PD生物法生產(chǎn)途徑以下三點(diǎn)尤為重要：一是利用低成本基質(zhì)；二是有較高的產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率；三是開(kāi)發(fā)一條經(jīng)濟(jì)、高效的下游分離工藝。近幾年，關(guān)于微生物生產(chǎn)1,3-PD的研究大多數(shù)集中于前兩個(gè)方面。目前，利用更為廉價(jià)的基質(zhì)——粗甘油(生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物)重新獲得了人們的重視。為了解決廉價(jià)原料難以利用、底物轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物多、發(fā)酵和分離成本高等產(chǎn)業(yè)化難題，微生物菌群發(fā)酵有望勝任廉價(jià)原料的工業(yè)化生產(chǎn)。這種基于粗甘油和低成本的新發(fā)酵工藝，增加了微生物法生產(chǎn)1,3-PD的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。微生物菌群發(fā)酵仍然需要進(jìn)行許多研究，如微生物群落的相互作用和種群動(dòng)力學(xué)，創(chuàng)新性的生物反應(yīng)器和發(fā)酵技術(shù)(如共固定或區(qū)域劃分)等。另外，控制和匹配不同菌種的生長(zhǎng)速率和代謝以及確保過(guò)程的穩(wěn)定性是問(wèn)題的關(guān)鍵。相信隨著微生物組學(xué)等科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及不同領(lǐng)域?qū)W者的協(xié)同合作，微生物法生產(chǎn)1,3-丙二醇會(huì)取得更大的發(fā)展和應(yīng)用。

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New progress in microbial fermentation of 1,3-propanediol

XIU Zhi-long1, JIANG Li-li1,2, FU Hong-xin1, ZHOU Jin-jie1, QUAN Chun-shan3

(1.SchoolofLifeScienceandBiotechnology,DalianUniversityofTechnology,Dalian116024；2.DepartmentofChemicalandMaterialsEngineering,YingkouInstituteofTechnology,Yingkou115014；3.KeyLaboratoryofBiotechnologyandBioresourcesUtilization,CollegeofLifeScience,DalianMinzuUniversity,Dalian116600)

1,3-Propanediol (1,3-PD) is an important raw material which is widely used in pharmaceutical, chemical, food and cosmetic industries. As a promising monomer for the synthesis of poly(trimethylene terephthalate) (PTT), its market demand is increasing linearly. Based on the demand of safe and eco-friendly production process and sustainable development, microbial conversion of renewable resources into 1,3-PD has been paid more and more attention. In this paper, we will discuss 1,3-PD producers with relation to their metabolism and fermentation technologies, as well as the downstream processing of biologically produced 1,3-PD. The prospects and challenges for the industrial production of bio-based 1,3-PD are also presented.

1,3-propanediol; microbial fermentation; metabolic pathway; downstream processing

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21476042)；國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(KF2015006)

修志龍 男，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事生物基化學(xué)品發(fā)酵及分離研究。 E-mail: zhlxiu@dlut.edu.cn

2016-11-20；

2016-11-30

修志龍，教授，大連理工大學(xué)，博士生導(dǎo)師。1987年畢業(yè)于清華大學(xué)化工系，1990年碩士畢業(yè)留大連理工大學(xué)工作。1997年晉升副教授，2002年晉升教授。主要從事生物催化轉(zhuǎn)化與生物分離方面的研究工作，承擔(dān)了20余項(xiàng)科研項(xiàng)目，包括5項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金、5項(xiàng)“863”計(jì)劃項(xiàng)目、1項(xiàng)“十五”科技攻關(guān)項(xiàng)目、3項(xiàng)“973”子課題等。在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文368篇(SCI收錄200多篇)，獲授權(quán)中國(guó)發(fā)明專利53項(xiàng)、國(guó)際專利4項(xiàng)、美國(guó)專利1項(xiàng)，獲遼寧省技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)1項(xiàng)、自然科學(xué)三等獎(jiǎng)2項(xiàng), 主編、主譯、參編國(guó)內(nèi)外教材和專著10部。2003年評(píng)為遼寧省骨干青年教師，2005年教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才基金獲得者，2006年獲得大連市優(yōu)秀專家稱號(hào)，2007年獲寶鋼教育基金優(yōu)秀教師獎(jiǎng)，2007年遼寧省百千萬(wàn)人才工程百人層次人選，2009年遼寧省教學(xué)名師。連續(xù)兩年(2014、2015年)入選中國(guó)高被引學(xué)者榜單。任教育部高等學(xué)校生物技術(shù)與生物工程專業(yè)教學(xué)指導(dǎo)委員會(huì)委員、遼寧省高校生物工程專業(yè)教學(xué)指導(dǎo)委員會(huì)主任委員，生物工程省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、大連海洋生物化工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任、生物化工學(xué)科點(diǎn)長(zhǎng)等技術(shù)負(fù)責(zé)人，《過(guò)程工程學(xué)報(bào)》、《Engineering in Life Science》等6種學(xué)術(shù)期刊編委。

Q939.97

A

1005-7021(2016)06-0001-09

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.001