• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PCR產(chǎn)物的高通量測序方法及優(yōu)化

    2016-03-07 01:57:25李桂瀾胥傳來
    關(guān)鍵詞:建庫上機(jī)數(shù)據(jù)量

    李桂瀾, 胥傳來

    (1.北京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,北京100871;2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇 無錫214122)

    PCR產(chǎn)物的高通量測序方法及優(yōu)化

    李桂瀾1, 胥傳來2

    (1.北京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,北京100871;2.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江南大學(xué),江蘇 無錫214122)

    PCR產(chǎn)物的高通量測序被廣泛應(yīng)用于功能基因篩選、腫瘤相關(guān)基因的突變和甲基化檢測等。在高通量測序技術(shù)中,建庫和上機(jī)測序?qū)嶒?yàn)一直是決定最終DNA數(shù)據(jù)質(zhì)量的關(guān)鍵。作者優(yōu)化了PCR產(chǎn)物樣品的DNA文庫制備條件和體系,設(shè)計(jì)了適合PCR產(chǎn)物特點(diǎn)上機(jī)測序方法,將已建庫的PCR樣品中混入一定量的基因組標(biāo)準(zhǔn)品后再上機(jī)測序,由此保證了測序數(shù)據(jù)的高質(zhì)量和低冗余度。為低多樣性DNA樣品高通量測序技術(shù)方法運(yùn)用提供方法上的參考。

    PCR產(chǎn)物;高通量測序技術(shù);樣品文庫制備;上機(jī)測序

    DNA測序是常用的分子生物學(xué)研究技術(shù),通過測序分析能提供最真實(shí)可靠的基因序列信息。從1977年第一代傳統(tǒng) DNA雙脫氧鏈末端終止的sanger測序法問世以來,DNA測序技術(shù)經(jīng)歷了快速發(fā)展[1-2]?,F(xiàn)在基于邊合成邊測序(sequencing by synthesis)為主的第二代高通量測序技術(shù)逐漸被廣泛運(yùn)用于基礎(chǔ)研究、臨床醫(yī)學(xué)診斷和腸道微生物群與營養(yǎng)及代謝研究領(lǐng)域[2-5]。二代測序以單個讀長較短、通量大為特點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了對單個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組細(xì)致全貌分析,也被稱為深度測序或高通量測序[6]。二代測序研究平臺從最初Roche公司的454焦磷酸測序和Illumina公司早先的Solexa測序技術(shù)發(fā)展到目前廣泛使用的Hiseq、Miseq系列,和Life Technoloiges的Ion PGM和Ion Proton的測序,測序技術(shù)無論從速度和通量上得到了前所未有的發(fā)展[7]。目前以Illumina為技術(shù)平臺的Hiseq X 5系統(tǒng)、Hiseq3000/4000最新的測序儀器也相繼發(fā)布,使二代測序樣品建庫更加高效,讀長(reads)更長,通量更高。

    PCR產(chǎn)物測序通過設(shè)計(jì)恰當(dāng)引物探針,運(yùn)用各種PCR技術(shù)將待測序的目的基因片段擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序[8-10]。PCR產(chǎn)物的高通量測序技術(shù)被輔助運(yùn)用于細(xì)胞文庫中功能基因的篩選,腫瘤相關(guān)基因突變及甲基化檢測和微生物菌群的營養(yǎng)及代謝相關(guān)探索研究[11-12]。以Illumina為平臺的高通量測序,對片段大小在150~350 bp的PCR混合物樣品,與基因組 DNA和微量的 ChIP-seq(Chromatin Immuno Precipitation,ChIP)樣品的文庫制備方法不同[13-14]。雖然目前建庫技術(shù)整體一直在被優(yōu)化,測序通量和測序長度也在不斷的進(jìn)行技術(shù)革新使之達(dá)到更高的測序要求,但I(xiàn)llumina的邊合成邊測序技術(shù)核心仍無法改變,也決定了Illumina二代測序的技術(shù)局限性。所以根據(jù)PCR產(chǎn)物樣品自身的特點(diǎn),文庫制備和上機(jī)測序?qū)嶒?yàn)都需要進(jìn)行特別的設(shè)計(jì)和處理。作者主要以Illumina系列的二代測序平臺,在普通的ChIP建庫方法,基于片段已知的DNA樣品通過兩步末端修飾反應(yīng)后加DNA通用接頭的實(shí)驗(yàn)原理,設(shè)計(jì)建立了一種適合PCR混合物樣品性質(zhì)特點(diǎn)的文庫制備及上機(jī)操作實(shí)驗(yàn),以確保高效低成本的建庫技術(shù)及上機(jī)測序中得到最佳的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量。作者以Illumina為代表的高通量測序技術(shù)特點(diǎn)及具體實(shí)驗(yàn)方法,為不同的研究領(lǐng)域中選擇不同測序方法提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試劑與材料

    1.1.1 試劑 ChIP-Seq Sample Prep Master Mix試劑盒:美國 New England Biolabs公司;NEBNext Multiplex Oligos;Agencourt AMPure XP的 DNA純化磁珠:美國BECKMAN COULTER公司;Brilliant SYBR Green QPCR試劑盒:美國Agilent公司;上機(jī)雙端測序試劑 Miseq Reagent Kit V3 (2×150 cycles): 美國 Illumina公司;100 bp plus DNA Marker相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品:北京全式金生物技術(shù)公司;100%乙醇、Tris、Tween20和 NaOH:美國Sigma公司。1.5 mL低DNA吸附(LoBind)微量離心管:美國Eppendorf。

    1.1.2 DNA分子 New England Biolabs公司提供:接頭分子(Adaptor):5’-pGATCGGAAGAGCACACG TCTGAACTCCAGTC/ideoxyU/ACACTCTTTCCCTAC ACGACGCTCTTCCGATCT-3’;上游引物:5’-AATG ATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTA CACGACGCTCTTCCGATCT-3’;下游引物:5’-CAA GCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTG GAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’;下游引物中的下劃線加粗的6個堿基為第10號標(biāo)簽(index)DNA分子。Takara合成熒光定量PCR引物:上游引物P1:5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’;下游引物P2:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACG A-3’。

    1.2 儀器

    Miseq第二代高通量測序儀:美國Illumina公司;美國Bio-Rad核酸電泳儀、凝膠成像儀和PCR核酸擴(kuò)增儀;電子天平和pH計(jì):瑞士METTLER TOLEDO公司;NanoDrop2000超微量分光光度計(jì):美國Thermo Scientific公司;Qubit 2.0熒光定量儀:美國Life Technologies公司;Mx300P熒光定量PCR儀:美國安捷倫公司;Fragment Analyzer全自動毛細(xì)管電泳儀及其配套試劑:美國Advanced Analytical。ThermoMixer恒溫混勻儀:美國Eppendorf。

    1.3 實(shí)驗(yàn)方法

    1.3.1 測序樣品文庫制備 切膠純化回收后的PCR產(chǎn)物樣品T1、T2和T3,瓊脂糖凝膠電泳圖中條帶是分布在200~300 bp寬峰,見圖1。用NanoDrop2000測定質(zhì)量濃度分別為24.2、25.2、26.2 ng/μL;A260/A280的OD值為1.68、1.59和1.76。

    建庫的初始樣品用 Qubit 2.0熒光定量儀對PCR產(chǎn)物樣品準(zhǔn)確定量后各取2 μL(DNA總量在10~50 ng)于1.5 mL的Lobind離心管,準(zhǔn)備第一步的平末端修復(fù)反應(yīng):1 μL末端修復(fù)反應(yīng)聚合酶和5μL的10×末端修復(fù)反應(yīng)緩沖液,用RNase free H2O補(bǔ)足至反應(yīng)終體積50 μL,恒溫混勻儀中30℃反應(yīng)20 min。 結(jié)束后加入80 uL的AMPure XP磁珠純化反應(yīng)后樣品,用44 uL RNase free H2O洗脫。第二步直接向樣品溶液加入1 μL Klenow片段酶和5 μL的10×反應(yīng)緩沖液(含0.2 mmol/L dATP),在37℃反應(yīng)30 min,完成末端加“A”修飾反應(yīng)。同樣用80 μL磁珠純化,19 μL的RNase free H2O洗脫。

    圖1 二代測序的PCR產(chǎn)物樣品T1-T3Fig.1 PCR products T1-T3 for next-generation sequencing

    將DNA接頭分子稀釋到5 μmol/L后取1 μL到樣品溶液中準(zhǔn)備連接反應(yīng),加6 μL的5×快速連接緩沖液和4 μL的快速DNA連接酶,小心混勻,室溫25℃靜置孵育15 min。結(jié)束后加入試劑盒的USER酶2 μL,在37℃反應(yīng)15 min完成接頭開環(huán)剪切。最后用與樣品等倍體積30 μL的磁珠純化兩遍,檢測濃度。取10 μL(總量在5~10 ng)樣品進(jìn)行PCR反應(yīng),循環(huán)數(shù)減少至15次。最后用與樣品等體積的磁珠純化兩遍,30 μL的ddH2O洗脫,檢測濃度。

    1.3.2 建庫后樣品質(zhì)量檢控 將建庫后樣品稀釋至0.5~2 ng/μL,分別用Fragment Analyzer全自動毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行片段分析;用Mx300Ps熒光定量PCR儀對樣品進(jìn)行熒光定量檢測。選用的標(biāo)準(zhǔn)品為已準(zhǔn)確定量并上機(jī)測序后的建庫樣品。用10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0,0.05%Tween 20緩沖液按10倍梯度配制成0.002~20 pmol/L五個不同濃度以獲得定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。建庫樣品再次稀釋 104倍到 0.1~ 2 pmol/L后取2 μL,2×Brilliant SYBR Green Master Mix 5 μL,10 μmol/L引物P1/P2 Mix 0.4 μL,最后ddH2O補(bǔ)足為10 μL的反應(yīng)體系,陰性對照組NTC(No Template Control)和所有樣品及標(biāo)準(zhǔn)品做三組重復(fù)。

    [Final Conc(nmol/L)]=[QPCR]×340×104×10-6/Fragm

    式中,[QPCR]代表儀器根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測出來的平均樣品濃度 (fM);340 bp代表選用的DNA標(biāo)準(zhǔn)品的片段大??;104代表樣品稀釋倍數(shù);Fragm代表建庫后樣品的平均片段大小。

    1.3.3 Illumina Miseq上機(jī)測序 對已建庫樣品T2準(zhǔn)備上機(jī)測序,將T2樣品與Phix基因組標(biāo)準(zhǔn)樣品等摩爾混合,用10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0緩沖液稀釋至終濃度2 nmol/L,取10 μL的上機(jī)混合樣品,加入10 μL 2 mol/L的NaOH充分混勻后室溫變性5 min。用雙端測序試劑盒里的雜交緩沖液將樣品稀釋到18 pmol/L,取600 μL上機(jī)測序。Illumina數(shù)據(jù)收集和分析軟件:Miseq Control Software;Real Time Analysis(RTA);Offline Basecaller(OLB);CASAVA軟件用于進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 建庫后樣品檢測

    PCR產(chǎn)物樣品T1,T2和T3為同一樣本的3個平行生物組重復(fù)。建庫結(jié)束后檢測終質(zhì)量濃度為:22.2、15.3、16.1 ng/μL各30 μL體系。隨機(jī)選取樣品T2的建庫及上機(jī)測序結(jié)果分析。用 Fragment Analyzer分析初始樣品和建庫后樣品片段分布,見圖2-3。樣品建庫后片段的出峰位置出現(xiàn)移動,增加約120 bp,滿足接頭序列成功連接后的片段分布情況。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品所得的熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線其相關(guān)系數(shù)為Rsq:99.9%,計(jì)算得到稀釋后的3個建庫樣品濃度12.46、6.78、7.81 nmol/L,滿足上機(jī)測序要求。T2樣品準(zhǔn)備上機(jī)測序。

    圖2 高通量測序樣品T2的DNA片段分析Fig.2 DNA fragment analysis of sample T2

    圖3 測序樣品T2建庫后的DNA片段分析Fig.3 DNA fragment analysis of final library sample T2

    2.2 上機(jī)測序結(jié)果

    Illumina Miseq測序中最主要指標(biāo)參數(shù)是數(shù)據(jù)質(zhì)量Q30值和測序數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見圖4-5。其中百分比≥Q30代表每輪測序堿基的質(zhì)量不低于99.9%所占的百分比。統(tǒng)計(jì)T2樣品測序最終的Q值分布(橫坐標(biāo))和得到的數(shù)據(jù)量(縱坐標(biāo),單位是million)。統(tǒng)計(jì)得到全部測序總數(shù)據(jù)量為5.8G,數(shù)據(jù)質(zhì)量≥Q30的占94.3%。最終統(tǒng)計(jì)得到的T2樣品原始測序數(shù)據(jù)量(Raw Data)為3.725 G。進(jìn)一步生物信息過濾處理得有效可用數(shù)據(jù)(clean data)為3.705 G,數(shù)據(jù)有效率為99.46%,Q20值為94.09%,Q30值為92.85%;GC含量比例為48.19%。結(jié)果滿足后續(xù)對T2測序樣品的生物學(xué)研究分析的基本要求。

    圖4 樣品T2在Miseq上機(jī)測序得到的全部數(shù)據(jù)Q值(Quality Score)分布統(tǒng)計(jì)Fig.4 Statistic of the QScore distribution on illumina Miseq

    圖5 Hiseq2000的測序芯片 (flowcell)中第4條測序通道(lane 4)里所有樣品都只是PCR產(chǎn)物樣品測序時的數(shù)據(jù)Q30分布統(tǒng)計(jì)Fig.5 Statistic of the Qscore distribution without the phix standard mixture on lane 4 at Hiseq 2000

    2.3 上機(jī)測序?qū)嶒?yàn)優(yōu)化分析

    當(dāng)前二代高通量測序正突飛猛進(jìn)地不斷進(jìn)行技術(shù)革新,但以Illumina為平臺的邊合成邊測序的核心技術(shù)原理保持不變[2]。在上機(jī)測序過程中前25個堿基測序循環(huán)(cycle)結(jié)果質(zhì)量的統(tǒng)計(jì)方法無法改變,依舊決定了整個測序的數(shù)據(jù)質(zhì)量。測序中監(jiān)測參數(shù)Cluster PF(Pass Filter)仍是重要的上機(jī)質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)測序的前25個堿基低質(zhì)量的數(shù)據(jù)有兩個以上(即PF<60%),測序儀器將判定這條讀長質(zhì)檢不通過。而PCR產(chǎn)物樣品DNA多樣性差,在測序中極易引起兩個堿基的識別可靠性低于60%,從而減損最終測序的Q30值和判定合格測序數(shù)據(jù)總量,見圖6。圖4為Illumina Hiseq2000測序中的第5測序通道(Lane 5)標(biāo)準(zhǔn)基因組樣品測序監(jiān)測的%Base正常分布情況,Cluster PF(%)為95.23±1.15,可獲得的數(shù)據(jù)量約34 G;圖7為同時測序中第4通道(Lane 4)的樣品當(dāng)全為PCR產(chǎn)物時%Base分布情況,Cluster PF(%)為21.24±14.83。使最終得到的合格數(shù)據(jù)量和Q30的統(tǒng)計(jì)值降低,測序通道Lane 4里全部測序數(shù)據(jù)質(zhì)量≥Q30僅為52.9%,最終獲得的測序數(shù)據(jù)量降低到4.5 G。

    作者嘗試將待測的PCR產(chǎn)物樣品T2中混合了等摩爾的Phix基因組標(biāo)準(zhǔn)品后進(jìn)行Miseq測序,監(jiān)測得到的Cluster PF(%)為89.81±0.72。最終目的樣品T2占整個有效測序數(shù)據(jù)量的61.77%,大大改善了PCR混合物測序樣品的數(shù)據(jù)質(zhì)量和有效數(shù)據(jù)總量。對于多樣性差的其它待測序DNA樣品,比如RRBS 樣 品 (Reduced Representation Bisulfite Sequencing,簡化的表觀亞硫酸氫鹽測序),由于含有固定的酶切位點(diǎn)序列降低了樣品的多樣性,但通過混入一定量比例的多樣性好的基因組標(biāo)準(zhǔn)品,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示得到的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可提高約50%。

    圖6 在Illumina Hiseq2000測序儀器中監(jiān)測的第5條測序通道標(biāo)準(zhǔn)基因組樣品的堿基分布圖Fig.6 Base distribution of genomic DNA sequencing on lane 5 of Illumina Hiseq 2000

    目前還可以嘗試降低待測序樣品上樣量的方法改善低多樣性樣品引起的低數(shù)據(jù)質(zhì)量的情況。但研究表明至少要降低一半的PCR樣品量才可能達(dá)到略微的效果,也大大折損了測序數(shù)據(jù)總量,并非經(jīng)濟(jì)有效的方案。而選擇將多樣性好的基因組樣品摻入到多樣性差的樣品中上機(jī)測序的方法,實(shí)驗(yàn)操作簡單,能改善整個測序通道的樣品多樣性表現(xiàn),從而提高測序質(zhì)量,同時也能保證得到的最終有效的測序數(shù)據(jù)總量損失最少。

    圖7 第4條測序通道為全部PCR產(chǎn)物樣品測序時的堿基分布圖Fig.7 Base distribution of all PCR samples sequencing on lane 4 of Illumina hiseq 2000

    3 結(jié)語

    作者研究探索了一套對普通PCR產(chǎn)物樣品的高通量測序建庫和上機(jī)實(shí)驗(yàn)方法,對低多樣性樣品的高通量測序方法做了探索研究,通過對樣品的上機(jī)測序數(shù)據(jù)監(jiān)測,證實(shí)所建立的方法保證樣品制備的高效經(jīng)濟(jì)和測序質(zhì)量的穩(wěn)定可靠。

    [1]MARDIS E R.A decade’s perspective on DNA sequencing technology[J].Nature,2011,470(7333):198-203.

    [2]METZKER M L.Sequencing technologies-the next generation[J].Nat Rev Genet,2010,11(1):31-46.

    [3]NIEDRINGHAUS T P,Milanova D,Kerby M B,et al.Landscape of next-generation sequencing technologies[J].Anal Chem,2011,83(12):4327-4341.

    [4]王興春,楊致榮,王敏,等.高通量測序技術(shù)及其應(yīng)用[J].中國生物工程雜志,2012,32(1):109-114. WANG Xingchun,YANG Zhirong,WANG Min,et al.High-throughput sequencing technology and its application[J].China Biotechnology,2012,32(1):109-114.(in Chinese)

    [5]MCCANN J C,WICKERSHAM T A,Loor J J,et al.High-throughput methods redefine the rumen microbiome and its relationship with nutrition and metabolism[J].Bioinformatics and Biology Insights,2014,8:109-125.

    [6]MOROZOVA O,MARRA M A.Applications of next-generation sequencing technologies in functional genomics[J].Genomics,2008,92(5):255-264.

    [7]MARDIS E R.Next-generation sequencing platforms[J].Annu Rev Anal Chem(Palo Alto Calif),2013(6):287-303.

    [8]YU C,ZHANG Y,YAO S,et al.A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in Zebrafish[J].PLoS One,2014,9(6):e98282.

    [9]NELSON M C,MORRISON H G,BENJAMINO J,et al.Analysis,optimization and verification of Illumina-generated 16S rRNAgene amplicon surveys[J].PLoS One,2014,9(4):e94249.

    [10]BOUTIN S,SEVELLEC M,Pavey S A,et al.A fast,highly sensitive double-nested PCR-based method to screen fish immunobiomes[J].Mol Ecol Resour,2012,12(6):1027-1039.

    [11]ZHOU Y,ZHU S,CAI C,et al.High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells[J]. Nature,2014,509(7501):487-491.

    [12]CAPORASO J G,LAUBER C L,WALTERS W A,et al.Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms[J].ISME J,2012,6(8):1621-1624.

    [13]AMIR A,ZEISEL A,ZUK O,et al.High-resolution microbial community reconstruction by integrating short reads from multiple 16S rRNA regions[J].Nucleic Acids Res,2013,41(22):e205.

    [14]BOWMAN S K,SIMON M D,DEATON A M,et al.Multiplexed Illumina sequencing libraries from picogram quantities of DNA [J].BMC Genomics,2013,14:466.

    Methods and Optimization of High Throughput Sequencing Technologies on PCR Products

    LI Guilan1, XU Chuanlai2
    (1.School of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China;2.State Key Laboratory of Food Science &Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

    The development of the new generation sequencing technology extends the application field of gene sequencing.High throughput sequencing of PCR products has been widely used in functional gene screening,mutation and methylation detection of tumor related genes,etc.In the high throughput sequencing technology,database and computer sequencing experiments are the key factor to decide the quality of DNA data.Based on Illumina sequencing instruments,the sample preparation method and sequencing running for PCR products were optimized,the results make us clearly understand the primary features of high-throughput sequencing techniques,and provide us important references of sequencing methods for low diversity DNA samples to address biological questions of interest.

    PCR products,high-throughput sequencing,sample library preparation,sequencing runs

    Q 523.8

    A

    1673—1689(2016)12—1317—06

    2015-02-03

    國家“十二五”科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAC01B071)。

    李桂瀾(1980—),女,重慶人,理學(xué)博士,工程師,主要從事DNA測序技術(shù)的應(yīng)用及生物分子相互作用方面的研究。E-mail:liglan@pku.edu.cn

    猜你喜歡
    建庫上機(jī)數(shù)據(jù)量
    周金應(yīng)
    基于大數(shù)據(jù)量的初至層析成像算法優(yōu)化
    計(jì)算Lyapunov指數(shù)的模糊C均值聚類小數(shù)據(jù)量法
    標(biāo)準(zhǔn)化護(hù)理程序?qū)w外膜肺氧合術(shù)患者上機(jī)各階段用時的影響
    高刷新率不容易顯示器需求與接口標(biāo)準(zhǔn)帶寬
    寬帶信號采集與大數(shù)據(jù)量傳輸系統(tǒng)設(shè)計(jì)與研究
    電子制作(2019年13期)2020-01-14 03:15:18
    面向建庫與制圖一體化的規(guī)則研究
    中文期刊回溯建庫的實(shí)踐與思考——以貴州省圖書館為例
    建設(shè)用地節(jié)約集約利用評價數(shù)據(jù)庫建庫流程:以西安市為例
    河南科技(2014年5期)2014-02-27 14:08:42
    基于數(shù)據(jù)字典的空間數(shù)據(jù)庫通用建庫技術(shù)
    9191精品国产免费久久| 蜜桃在线观看..| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 日韩av在线免费看完整版不卡| 麻豆av在线久日| 欧美精品国产亚洲| 不卡av一区二区三区| 久久精品国产亚洲av天美| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久亚洲国产成人精品v| 2018国产大陆天天弄谢| 免费高清在线观看日韩| www.av在线官网国产| 国产av码专区亚洲av| 交换朋友夫妻互换小说| 搡女人真爽免费视频火全软件| 91久久精品国产一区二区三区| 伦理电影免费视频| 超碰成人久久| 熟妇人妻不卡中文字幕| 精品人妻在线不人妻| 色94色欧美一区二区| 日韩av不卡免费在线播放| 国产 一区精品| 性少妇av在线| 高清av免费在线| 男男h啪啪无遮挡| 成年人午夜在线观看视频| 晚上一个人看的免费电影| 三上悠亚av全集在线观看| 午夜福利乱码中文字幕| 看免费成人av毛片| 国产免费福利视频在线观看| 中文欧美无线码| 亚洲内射少妇av| 午夜91福利影院| 一级a爱视频在线免费观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 国产精品一区二区在线观看99| 国产极品天堂在线| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久国产精品人妻一区二区| videos熟女内射| 九草在线视频观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久久久视频综合| xxxhd国产人妻xxx| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | 男女边摸边吃奶| 亚洲av成人精品一二三区| 成人影院久久| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲精品国产av成人精品| 超碰97精品在线观看| 精品视频人人做人人爽| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲综合色惰| 日日爽夜夜爽网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 乱人伦中国视频| 热99久久久久精品小说推荐| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 高清黄色对白视频在线免费看| 日本色播在线视频| 国产成人91sexporn| 国产一区二区 视频在线| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 9热在线视频观看99| 亚洲成人一二三区av| 欧美成人午夜免费资源| 午夜福利一区二区在线看| 在线天堂中文资源库| 免费观看在线日韩| 视频在线观看一区二区三区| 日韩不卡一区二区三区视频在线| av又黄又爽大尺度在线免费看| 久久影院123| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 久久久精品区二区三区| 久久久欧美国产精品| 这个男人来自地球电影免费观看 | 亚洲精品成人av观看孕妇| h视频一区二区三区| 电影成人av| √禁漫天堂资源中文www| 少妇人妻精品综合一区二区| 日本黄色日本黄色录像| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 97精品久久久久久久久久精品| 18禁国产床啪视频网站| 制服诱惑二区| 午夜老司机福利剧场| 丁香六月天网| 亚洲精品视频女| 久久综合国产亚洲精品| 老汉色∧v一级毛片| 久久狼人影院| 国产1区2区3区精品| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 又黄又粗又硬又大视频| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲第一青青草原| 美女大奶头黄色视频| 亚洲人成电影观看| 亚洲内射少妇av| av女优亚洲男人天堂| 国产亚洲精品第一综合不卡| 不卡视频在线观看欧美| 男女免费视频国产| 少妇人妻久久综合中文| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲情色 制服丝袜| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久久久人人人人人| 亚洲人成网站在线观看播放| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲精品,欧美精品| 国产精品欧美亚洲77777| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产成人午夜福利电影在线观看| 麻豆av在线久日| 久久久久人妻精品一区果冻| 久久精品夜色国产| 国产不卡av网站在线观看| 亚洲av国产av综合av卡| 搡老乐熟女国产| 欧美成人午夜精品| 宅男免费午夜| 两性夫妻黄色片| 校园人妻丝袜中文字幕| 欧美 日韩 精品 国产| 不卡视频在线观看欧美| 中文字幕人妻熟女乱码| 国产精品女同一区二区软件| a 毛片基地| 美女中出高潮动态图| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产麻豆69| 久久精品久久精品一区二区三区| 人妻系列 视频| 一区福利在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲成av片中文字幕在线观看 | av一本久久久久| 又黄又粗又硬又大视频| 男人舔女人的私密视频| 午夜影院在线不卡| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 亚洲av男天堂| www.精华液| 久久久久久久久免费视频了| av国产久精品久网站免费入址| 另类精品久久| 亚洲三级黄色毛片| 国产毛片在线视频| 久久99一区二区三区| 国产一区二区在线观看av| 久久ye,这里只有精品| 99久国产av精品国产电影| 久久久久久久国产电影| 成人午夜精彩视频在线观看| 日本免费在线观看一区| 免费在线观看黄色视频的| 午夜免费鲁丝| 亚洲精品第二区| 精品国产一区二区三区四区第35| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产一区二区三区av在线| 精品一区在线观看国产| 亚洲色图综合在线观看| www日本在线高清视频| 涩涩av久久男人的天堂| 在线观看免费视频网站a站| 叶爱在线成人免费视频播放| 69精品国产乱码久久久| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲欧美清纯卡通| 乱人伦中国视频| 夫妻性生交免费视频一级片| 看非洲黑人一级黄片| 多毛熟女@视频| 嫩草影院入口| 欧美日韩精品网址| 国产亚洲精品第一综合不卡| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美在线黄色| 精品一区二区免费观看| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲av日韩在线播放| 黑人欧美特级aaaaaa片| 欧美在线黄色| 日本vs欧美在线观看视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久女婷五月综合色啪小说| 夫妻午夜视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 中文欧美无线码| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 99香蕉大伊视频| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 午夜激情久久久久久久| 自线自在国产av| 日韩一本色道免费dvd| 国精品久久久久久国模美| 国产成人精品一,二区| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲综合精品二区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 欧美国产精品一级二级三级| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 18+在线观看网站| 亚洲经典国产精华液单| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 热re99久久国产66热| 国产一级毛片在线| 久久久久国产网址| 精品国产乱码久久久久久小说| 日本爱情动作片www.在线观看| 丝袜在线中文字幕| 久久亚洲国产成人精品v| 一区二区三区精品91| 我的亚洲天堂| 在线观看www视频免费| 蜜桃在线观看..| freevideosex欧美| 成人影院久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| 久久久久久久国产电影| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久久久精品性色| av有码第一页| 人妻 亚洲 视频| 国产极品粉嫩免费观看在线| 国产乱来视频区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产一区二区 视频在线| 国产日韩欧美在线精品| 女人精品久久久久毛片| 三上悠亚av全集在线观看| 永久网站在线| 午夜福利视频精品| 亚洲久久久国产精品| 一边亲一边摸免费视频| 久久久国产欧美日韩av| 精品久久久久久电影网| 国产精品蜜桃在线观看| av在线观看视频网站免费| 亚洲欧美清纯卡通| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产免费视频播放在线视频| 伦精品一区二区三区| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 国产精品久久久久久av不卡| 国产日韩欧美视频二区| 亚洲精品一区蜜桃| 女人久久www免费人成看片| 国产97色在线日韩免费| www日本在线高清视频| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲av成人精品一二三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久欧美国产精品| 国产国语露脸激情在线看| 我的亚洲天堂| 一级爰片在线观看| 午夜日本视频在线| 男男h啪啪无遮挡| 国产精品久久久av美女十八| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 美女视频免费永久观看网站| 十八禁网站网址无遮挡| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美另类一区| a级毛片黄视频| 在线观看人妻少妇| 亚洲男人天堂网一区| 18在线观看网站| 午夜久久久在线观看| 亚洲成人一二三区av| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 色哟哟·www| 国产亚洲一区二区精品| 在线天堂中文资源库| 国产一区二区在线观看av| 老司机亚洲免费影院| 久热这里只有精品99| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产成人av激情在线播放| 亚洲av在线观看美女高潮| 成人亚洲欧美一区二区av| √禁漫天堂资源中文www| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 永久免费av网站大全| 亚洲情色 制服丝袜| 日本91视频免费播放| 日本免费在线观看一区| 制服人妻中文乱码| 在线观看www视频免费| 久久鲁丝午夜福利片| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 亚洲成人手机| 欧美在线黄色| 母亲3免费完整高清在线观看 | 观看美女的网站| 少妇精品久久久久久久| 日韩一本色道免费dvd| 天美传媒精品一区二区| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产精品 国内视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 少妇精品久久久久久久| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产1区2区3区精品| www.自偷自拍.com| 国产av精品麻豆| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 老司机亚洲免费影院| 久久久精品免费免费高清| 国产黄频视频在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 免费大片黄手机在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日本欧美视频一区| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 精品亚洲成a人片在线观看| 国产熟女午夜一区二区三区| 久久久久久免费高清国产稀缺| 国产福利在线免费观看视频| 精品久久久精品久久久| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲av福利一区| 最近2019中文字幕mv第一页| 精品一品国产午夜福利视频| 天天操日日干夜夜撸| 99久久中文字幕三级久久日本| 9191精品国产免费久久| 精品一区二区三卡| 大香蕉久久成人网| 国产成人av激情在线播放| 婷婷色av中文字幕| 国产在线视频一区二区| 美女主播在线视频| av电影中文网址| 天天影视国产精品| 久久99一区二区三区| 国产精品免费大片| 美女国产高潮福利片在线看| 丁香六月天网| 人体艺术视频欧美日本| 少妇人妻久久综合中文| 国产精品久久久久成人av| h视频一区二区三区| 亚洲美女黄色视频免费看| 啦啦啦在线免费观看视频4| 男女午夜视频在线观看| a级毛片在线看网站| 国产综合精华液| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 成人漫画全彩无遮挡| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产精品 国内视频| 不卡av一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久| 91在线精品国自产拍蜜月| 午夜福利,免费看| 亚洲欧洲日产国产| 人妻 亚洲 视频| 2018国产大陆天天弄谢| 国产淫语在线视频| 国产精品免费大片| 日韩一区二区视频免费看| 一本色道久久久久久精品综合| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 成人手机av| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 欧美日韩av久久| 另类亚洲欧美激情| 欧美bdsm另类| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲欧美色中文字幕在线| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 涩涩av久久男人的天堂| 制服丝袜香蕉在线| 午夜福利视频精品| 精品人妻在线不人妻| 亚洲综合色惰| 九九爱精品视频在线观看| 国产黄频视频在线观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 免费在线观看完整版高清| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 女性被躁到高潮视频| videosex国产| 亚洲精品国产色婷婷电影| 91成人精品电影| 国产精品无大码| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲,欧美精品.| 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产 精品1| 久久女婷五月综合色啪小说| 精品第一国产精品| 美女中出高潮动态图| 性少妇av在线| 飞空精品影院首页| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 成人国语在线视频| 激情视频va一区二区三区| 成人毛片60女人毛片免费| 卡戴珊不雅视频在线播放| 免费在线观看完整版高清| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产深夜福利视频在线观看| 国产成人精品久久二区二区91 | 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 成年人午夜在线观看视频| 精品国产露脸久久av麻豆| 国产综合精华液| 热99久久久久精品小说推荐| 国产成人91sexporn| 秋霞在线观看毛片| 日韩人妻精品一区2区三区| 亚洲国产最新在线播放| 国产成人精品福利久久| 多毛熟女@视频| 在线观看一区二区三区激情| 两性夫妻黄色片| 男人爽女人下面视频在线观看| 最近中文字幕2019免费版| 亚洲成人手机| 欧美日本中文国产一区发布| 2018国产大陆天天弄谢| 男女午夜视频在线观看| 69精品国产乱码久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 午夜福利网站1000一区二区三区| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲欧美色中文字幕在线| 欧美bdsm另类| 老司机影院成人| 性高湖久久久久久久久免费观看| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 青春草视频在线免费观看| 2018国产大陆天天弄谢| 老女人水多毛片| 国产成人欧美| 国产精品av久久久久免费| 美女福利国产在线| 伦理电影大哥的女人| 91精品国产国语对白视频| 国产在线视频一区二区| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品视频人人做人人爽| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 赤兔流量卡办理| 久久久精品94久久精品| 久久精品国产a三级三级三级| 人人妻人人澡人人看| 九九爱精品视频在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲四区av| 边亲边吃奶的免费视频| 9热在线视频观看99| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美精品亚洲一区二区| 午夜日本视频在线| 久久精品久久久久久久性| av免费观看日本| 国产精品久久久久久久久免| 午夜av观看不卡| 不卡av一区二区三区| 我要看黄色一级片免费的| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲精品乱久久久久久| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 哪个播放器可以免费观看大片| 蜜桃国产av成人99| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲精品视频女| 亚洲欧美精品综合一区二区三区 | av免费观看日本| 中文字幕制服av| 搡女人真爽免费视频火全软件| 伊人久久国产一区二区| 七月丁香在线播放| 国产野战对白在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产一级毛片在线| 成人黄色视频免费在线看| 欧美成人午夜精品| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美日韩精品网址| 成人亚洲精品一区在线观看| 在线观看免费高清a一片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 精品一区在线观看国产| 天天影视国产精品| av免费在线看不卡| 亚洲少妇的诱惑av| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 精品人妻在线不人妻| 亚洲精品,欧美精品| 在线免费观看不下载黄p国产| 成人毛片a级毛片在线播放| 亚洲一区中文字幕在线| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 男女免费视频国产| 人妻少妇偷人精品九色| 电影成人av| 99热全是精品| 97在线视频观看| 国产成人精品一,二区| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 秋霞伦理黄片| 久久ye,这里只有精品| 国产毛片在线视频| 色视频在线一区二区三区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久久久久久久免费视频了| 91精品三级在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩在线高清观看一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 国产午夜精品一二区理论片| 激情五月婷婷亚洲| 尾随美女入室| 一区二区三区四区激情视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 一区二区三区乱码不卡18| 免费观看在线日韩| 国产片特级美女逼逼视频| av网站免费在线观看视频| 欧美成人午夜精品| 波多野结衣一区麻豆| 自线自在国产av| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 成人影院久久| 老汉色av国产亚洲站长工具| 热re99久久国产66热| 日本免费在线观看一区| 曰老女人黄片| 久久99精品国语久久久| 热re99久久精品国产66热6| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 热99久久久久精品小说推荐| 美国免费a级毛片| 国产一区二区三区av在线| 日日啪夜夜爽| 一边亲一边摸免费视频| 免费在线观看完整版高清| 9色porny在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久99热这里只频精品6学生| 大香蕉久久网| videossex国产| av网站免费在线观看视频| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 日韩欧美一区视频在线观看| www.熟女人妻精品国产| 18禁国产床啪视频网站| 91在线精品国自产拍蜜月| 精品国产乱码久久久久久男人| www日本在线高清视频| 超色免费av| 男人舔女人的私密视频| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 精品亚洲成a人片在线观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 在线观看国产h片| 国产成人一区二区在线| 看免费av毛片| 亚洲成色77777| 五月天丁香电影| 大香蕉久久成人网| 欧美成人午夜免费资源| 久久久久国产一级毛片高清牌| 国产精品国产av在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 老熟女久久久| 夫妻午夜视频| 久久久久国产网址| 亚洲四区av| 国产精品偷伦视频观看了| 99久久人妻综合| 有码 亚洲区| 精品少妇黑人巨大在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久久亚洲精品成人影院|