嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP蛋白的胞外可調(diào)控分泌及序列分析

郭雙雙, 畢春霞, 楊 麗, 劉興雨, 秦江楠, 朱元祺, 王 斌, 閆志勇*

(1.青島大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071； 2.青島大學(xué) 附屬青島市立醫(yī)院，山東 青島 266071；3.青島大學(xué) 附屬青島婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266071； 4. 青島大學(xué) 附屬醫(yī)院，山東 青島 266071)

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP蛋白的胞外可調(diào)控分泌及序列分析

郭雙雙1, 畢春霞2, 楊 麗3, 劉興雨1, 秦江楠1, 朱元祺4, 王 斌1, 閆志勇1*

(1.青島大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071； 2.青島大學(xué) 附屬青島市立醫(yī)院，山東 青島 266071；3.青島大學(xué) 附屬青島婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266071； 4. 青島大學(xué) 附屬醫(yī)院，山東 青島 266071)

為了觀察和探討嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP蛋白胞外可調(diào)控分泌現(xiàn)象及其機(jī)制，將收集到的環(huán)境株菌D2株及9株臨床株在含不同成分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)液上清利用SDS-PAGE電泳觀察SMP蛋白分泌情況；提取各菌株基因組DNA，PCR擴(kuò)增其smp基因并進(jìn)行克隆和序列測定；將獲得的SMP氨基酸序列用Blastp、Megalign等進(jìn)行分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，不同來源的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌胞SMP蛋白分泌均存在可調(diào)控現(xiàn)象，酵母提取物可抑制該蛋白的分泌，而適宜濃度的麥芽糖則具有促進(jìn)作用。序列對比及系統(tǒng)發(fā)育樹分析顯示，SMP的氨基酸序列具有種屬的特異性，且臨床株和環(huán)境株中存在一定的差異，臨床株中該蛋白的氨基酸序列高度保守，而環(huán)境株則序列差異相對明顯的，但不同來源的菌株SMP均含有保守的信號肽；提示該蛋白可能與其致病性相關(guān)，其胞外分泌的可調(diào)控機(jī)制值得進(jìn)一步深入探究。

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌；蛋白分泌；調(diào)控分泌；序列分析

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)是革蘭陰性需氧菌，在自然界分布廣泛，不同水源、土壤、植物根系等外界環(huán)境及動物和人體內(nèi)均可分離到該菌[1]。研究發(fā)現(xiàn)，該菌可以降解某些有害有機(jī)物、吸附重金屬離子、抵御植物病害、促進(jìn)植物生長[2-4]，并能夠合成分泌氧化酶、堿性磷酸酶、酪氨酸酶、纖溶酶等多種生物活性物質(zhì)[5-7]。此外，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌也是臨床常見的條件致病菌,且對多種抗菌藥物天然耐藥[8]，因此，對該菌的深入研究具有重要意義。在前期研究中我們從海洋生物雙齒圍沙蠶的消化道中曾分離出一株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(D2株，保藏號CGMCC No.1868)，可大量胞外分泌某種蛋白(protein ofS.maltophilia，SMP)，并已經(jīng)證實(shí)其分泌機(jī)制與Ⅱ型分泌系統(tǒng)(T2SS)有關(guān)[9]；同時還發(fā)現(xiàn)該蛋白的胞外分泌具有可調(diào)控性，在某些培養(yǎng)基中可大量分泌，而在另外一些培養(yǎng)基中則分泌受抑制。為了探討該現(xiàn)象，本文在前期研究基礎(chǔ)上又收集了部分嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌臨床株，觀察了其SMP的調(diào)控分泌現(xiàn)象，對其編碼基因進(jìn)行了序列測定，并對其氨基酸序列進(jìn)行了對比分析，以期為深入研究該蛋白的可調(diào)控胞外分泌機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株分離自海洋生物雙齒圍沙蠶消化道；9株臨床株采集自青島大學(xué)各附屬醫(yī)院。

1.1.2 培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù),%) ① LB液體培養(yǎng)基； ②蛋白胨液體培養(yǎng)基:蛋白胨1，NaCl 0.5； ③酵母蛋白胨液體培養(yǎng)基: 蛋白胨1， NaCl 0.5，酵母提取物0.5；④胰蛋白胨液體培養(yǎng)基: 胰蛋白胨1，NaCl 0.5； ⑤ ALB培養(yǎng)基: 胰蛋白胨1，NaCl 0.5，酵母提取物0.5，瓊脂1.5，氨芐青霉素(Amp)終濃度100 μg/mL。

1.1.3 主要試劑 實(shí)驗(yàn)所用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司，TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、限制性核酸內(nèi)切酶(EcoRⅠ和Hind Ⅲ )、pMD18-T均購自TaKaRa公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司。

1.2 方法

1.2.1 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP蛋白的可調(diào)控分泌觀察 將收集到的不同來源的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌菌株接種到含不同成分的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后觀察SMP蛋白的胞外分泌情況，具體操作如下。將D2菌株和9株臨床株接種于LB平板培養(yǎng)基30 ℃過夜培養(yǎng)，取單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至OD600值約為0.6，以1∶100的體積比例將各菌株分別接種于酵母蛋白胨液體培養(yǎng)基、蛋白胨液體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、胰蛋白胨液體培養(yǎng)基和0.25%、0.5%、1.0%麥芽糖的蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h，調(diào)整OD600值為1.5，吸取等量菌液，12 000 r/min離心10 min后，直接吸取上清液進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察并分析蛋白分泌情況。

1.2.2 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌smp基因的PCR擴(kuò)增 細(xì)菌基因組DNA提取采用基因組DNA的試劑盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)參照說明書進(jìn)行操作。參照文獻(xiàn)[10]設(shè)計(jì)擴(kuò)增SMP蛋白基因(smp)的引物，正向引物為5′-CATGCCCTGCCACTGATAGAC-3′，反向引物為5′-GGCGTGTAGTGAGCCGTTCCTC-3′，由上海生工生物工程公司合成。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：模板2.0 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，10×PCR緩沖液5.0 μL，dNTPs(2.5 mmol/each)8.0 μL，引物(10 μmol/L)各2.0 μL。擴(kuò)增條件：94 ℃ 5 min后，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，然后72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆及測序 PCR擴(kuò)增片段使用OMEGA公司生產(chǎn)的切膠回收試劑盒(E.Z.N.A.Gel Extraction Kit)純化后，分別在16 ℃低溫循環(huán)儀中與pMD18-T載體過夜連接，TSS法轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌JM109中，接種ALB平板過夜培養(yǎng)，藍(lán)白斑法篩選重組克隆。取陽性克隆接種ALB液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，用OMEGA公司質(zhì)粒提取試劑盒(Plasmid Mini Kit I)提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定后，送上海生工生物工程公司測序。

1.2.4 SMP蛋白氨基酸序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 用DNAStar軟件分析獲得的各基因序列，尋找完整的開放讀碼框架(ORF)，并將其翻譯成氨基酸序列。用NCBI的Blast比較各菌株SMP的氨基酸序列，用DNAstar之Megalign軟件進(jìn)行多序列比較，分析序列中的保守性,使用SignalP 4.1 分析SMP蛋白的信號肽剪切位點(diǎn)。從GenBank中選取收錄的與SMP氨基酸相似度較高且來源明確的相關(guān)蛋白的氨基酸序列，用MEGA5.1軟件以N-J法分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap法(重復(fù)數(shù)25 000)進(jìn)行檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP蛋白的可調(diào)控分泌現(xiàn)象的觀察與分析

圖1 4種培養(yǎng)基中嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2株和臨床株MY1胞外分泌蛋白SDS-PAGEFig.1 Results of protein SDS-PAGE of S. maltophilia strain D2 and clinical strain MY1 in four kinds of culture medium

SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)臨床收集的9株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌臨床株及D2株在蛋白胨液體培養(yǎng)基和胰蛋白胨液體培養(yǎng)基中均可大量分泌胞外蛋白，而在酵母蛋白胨液體培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基中則未見明顯分泌(圖1示D2株和臨床株MY1，其余臨床株蛋白分泌結(jié)果與MY1完全一致，略，下同)，提示酵母提取物抑制嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌蛋白的胞外分泌。此外，適量的麥芽糖可以提高蛋白胞外分泌的產(chǎn)量，其中在濃度為0.5%麥芽糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中蛋白分泌量最多(圖2)。

圖2 不同濃度麥芽糖蛋白胨培養(yǎng)基中嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌D2和臨床株MY1胞外分泌蛋白SDS-PAGEFig.2 Results of protein SDS-PAGE of S. maltophilia strain D2 and clinical strain MY1 in peptone medium with different concentration maltose

2.2 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌smp基因的PCR擴(kuò)增及克隆鑒定

PCR擴(kuò)增9株嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌基因組所得到的產(chǎn)物長度約為1 377 bp，與設(shè)計(jì)相符。純化產(chǎn)物后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化得陽性克隆后酶切鑒定。部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3，部分重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果見圖4。

圖3 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌smp基因的PCR擴(kuò)增Fig.3 Gel electrophoresis results of PCR production of smp gene

圖4 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.4 Identification of the recombinant plasmids by restriction enzyme

2.3 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP氨基酸序列的分析

所有測序序列均獲得GenBank收錄號(KX419559、KX419560、KX419561、KX419562、KX419563、KX419564、KX419565、KX419566、KX419567)。經(jīng)分析，9株臨床株smp基因的PCR產(chǎn)物序列內(nèi)，均能找到一個完整的ORF，將其翻譯均可獲得一個長度為391氨基酸的序列，比此前我們獲得的D2株 SMP氨基酸序列少19個氨基酸，這與蛋白電泳結(jié)果相符(圖1)。對該蛋白序列進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，都含有1個腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)超家族保守結(jié)構(gòu)域；SignalP 4.1 分析則顯示臨床株蛋白氨基酸序列在前端均存在一個長度為24氨基酸的信號肽序列，且與D2株信號肽序列一致。

經(jīng)NCBI的Blastp比較發(fā)現(xiàn)，9株臨床株與GenBank中嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌臨床來源株K279a的堿性磷酸酶氨基酸序列相似度為96.2%～99.7%，與植物來源的R551-3株相比為78.6%～79.3%，而D2株與K279a和R551-3該氨基酸的相似度依次為68.5%和73.6%。此外，9株臨床株與親緣關(guān)系較近的假單胞菌屬的銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌及P.koreensis存在相似度為50%～45%的氨基酸序列。

2.4 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP蛋白氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌SMP蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.5 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of SMP protein of Stenotrophomonas maltophilia

從GenBank中收集部分與SMP相似度較高的序列，與9株臨床株、D2株用MEGA5.1構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖5所示，臨床株SMP氨基酸序列與分離于血液的K279a、D457等親緣較近，而與D2株和R551-3株的進(jìn)化距離相對較遠(yuǎn)，而假單胞菌屬中的銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌及P.koreensis則在一個更遠(yuǎn)的獨(dú)立分枝上，提示該氨基酸序列有顯著的種屬特異性，且與菌株分離來源有關(guān)。

3 討 論

嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種分布廣泛的環(huán)境菌，同時也是現(xiàn)在醫(yī)院感染的常見條件致病菌，研究發(fā)現(xiàn)不同菌株具有多種不同生物學(xué)活性，且各種物質(zhì)代謝活躍[11-12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，分離自海洋生物雙齒圍沙蠶體內(nèi)的D2株能大量胞外分泌一種SMP蛋白，且其分泌受培養(yǎng)基成分的影響差異較大。本文對該現(xiàn)象進(jìn)行了進(jìn)一步的研究，以期能為探討嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌蛋白分泌、致病及耐藥機(jī)制提供新的線索。

首先觀察了SMP蛋白分泌的影響因素，結(jié)果顯示，臨床分離株及來源于環(huán)境的D2株均可在蛋白胨培養(yǎng)基中大量胞外分泌該蛋白(研究中采用的是將未經(jīng)濃縮的不含菌細(xì)胞的細(xì)菌培養(yǎng)液上清直接進(jìn)行蛋白電泳)，而當(dāng)培養(yǎng)基中含有酵母提取物時(如LB培養(yǎng)基)則未見分泌，提示酵母提取物中的某種或某些成分對嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌該蛋白的分泌有較強(qiáng)的抑制作用。此外，在0.5%的麥芽糖中，蛋白的分泌較其他濃度稍高，而多種其他碳水化合物對該蛋白的分泌無明顯影響。我們的其他研究已證明，SMP蛋白的分泌是通過T2SS進(jìn)行的，T2SS廣泛存在于革蘭陰性細(xì)菌中，是該類細(xì)菌的主要代謝途徑之一，參與胞外酶、蛋白酶、毒力因子的分泌，其在嗜麥芽窄食單胞菌發(fā)病機(jī)制中起重要作用[13-14]。那么可以推測，酵母提取物的蛋白分泌抑制作用可能是通過作用于T2SS中某個環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn)的，這一現(xiàn)象非常值得深入研究。我們計(jì)劃利用高效液相色譜分析法(HPLC)分離酵母提取物，然后再測試各分離組分對SMP表達(dá)的影響，以進(jìn)一步明確該成分。

通過對臨床來源株和非臨床來源株(以下稱為環(huán)境株)SMP氨基酸序列的分析，也發(fā)現(xiàn)了比較有趣的現(xiàn)象：臨床株的SMP蛋白具有很高的保守性，氨基酸序列同源性在96%以上，而環(huán)境株的同源性卻僅在70%左右。以氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，①臨床株大多在一個進(jìn)化枝上，環(huán)境株(D2、R551-3)則與之有一定的進(jìn)化距離；②SMP有一定種屬的保守性，與近緣的假單胞菌屬(嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌曾經(jīng)在分類學(xué)上屬于該屬)的細(xì)菌進(jìn)化距離相對較遠(yuǎn)，序列同源性低至50%以下。該現(xiàn)象提示，SMP的序列變化可能與對人的致病性相關(guān)，亦或因?yàn)椴煌梭w內(nèi)環(huán)境差異較小，導(dǎo)致其序列在進(jìn)化過程中保持穩(wěn)定。

此外，臨床株、環(huán)境株的SMP序列前端均含有較為保守的sec信號肽，再次提示其分泌可能與T2SS相關(guān)。對SMP蛋白氨基酸序列的分析還顯示，該蛋白應(yīng)該為一種堿性磷酸酶，此前的研究已表明其具有明顯的堿性蛋白酶活性[15]，因此SMP可能是一種具有多種生物學(xué)活性的蛋白。

綜上所述，本研究所涉及的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌均可以可調(diào)控地胞外分泌一種SMP蛋白，且分泌受酵母提取物中成分的抑制；臨床株SMP的氨基酸序列具有較高的保守性，而環(huán)境株保守性相對較低；SMP是一種具有多種生物學(xué)活性的蛋白，對該菌的致病可能發(fā)揮著一定作用。因此，SMP及其胞外分泌的可調(diào)控機(jī)制值得進(jìn)一步深入探究。

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百分濃度:務(wù)必注明是重量百分濃度,還是體積百分濃度。

面積:公頃用hm2,不用ha,畝或公畝,換算因數(shù)為 1hm2=15畝。

旋轉(zhuǎn)速度：用r/min，×g,不用rpm。

蒸汽壓力：用Pa或kPa、MPa表示,不用大氣壓at,kg/m2或kg/cm2等。

光密度：用OD(斜體)表示。

生物大分子的分子量：蛋白質(zhì)用u或ku，核酸用bp或kb表示。

Extracellular Regulatable Secretion and Sequence Analysis of SMP Protein ofStenotrophomonasmaltophilia

GUO Shuang-shuang1, BI Chun-xia2, YANG Li3, LIU Xing-yu1, QIN Jiang-nan1, ZHU Yuan-qi4, WANG Bin1, YAN Zhi-yong1

(1.Coll.ofBasicMed., 2.Affil.QingdaoMuni.Hosp., 3.Affil.QingdaoWom. &Child.Hosp., 4.AffilHosp.,ofQingdaoUni.,Qingdao266071)

In order to observe and investigate the regulatable SMP protein extracellular secretion phenomenon and its mechanism inStenotrophomonasmaltophilia, environmental strain D2 and nine strains collected from clinic were cultured in media containing different ingredients. The secretion of SMP protein in supernatant was observed using SDS-PAGE. Thesmpgene was amplified from genomes extracted from all strains. PCR products were cloned and sequenced to analyze amino acid sequences of SMP with Blastp and Megalign etc, and build phylogeny tree. The results showed that SMP secretion from different sources ofS.maltophilliaall have regulatable phenomenon. Yeast extract can inhibit the secretion of SMP protein and maltose of suitable concentration possessed enhancement. Amino acid sequence comparison and phylogenetic tree analysis showed that amino acid sequence of SMP has species specificity, and there are a certain differences between clinical and environmental strains. The amino acid sequence of SMP protein was highly conserved, while the difference was relatively significant in environmental strains. However, SMP of strains from different sources contains conserved signal peptide; Suggested that SMP protein probably correlated to the pathogenicity of the protein. The regulatable mechanism of SMP secretion is worthy for further deepening study.

Stenotrophomonasmaltophilia; protein secretion; regulative secretion; sequence analysis

山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金項(xiàng)目(BS2011SW005)；山東省科技公關(guān)基金項(xiàng)目(2007GG3WZ05009)

郭雙雙 女，碩士研究生。研究方向?yàn)獒t(yī)學(xué)微生物學(xué)。E-mail:15264260038@163.com

2016-06-29；

2016-08-06

Q939.93；R378

A

1005-7021(2016)06-0082-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.014

畢春霞 女，副主任技師。研究方向?yàn)榕R床檢驗(yàn)診斷學(xué)。前兩位作者對本文有同等貢獻(xiàn)，均為第一作者。

* 通訊作者。男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)椴≡⑸飳W(xué)。Tel:0532-83780059，E-mail:yanzhiyong@qdu.edu.cn