1型CRISPR位點間區(qū)序列分析在嗜熱鏈球菌菌株分型中的應用

張璐璐， 嚴 興， 趙 勇*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306;2.中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學重點實驗室，上海 201306;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海)，上海 201306)

1型CRISPR位點間區(qū)序列分析在嗜熱鏈球菌菌株分型中的應用

張璐璐1,3， 嚴 興2*， 趙 勇1,3*

(1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306;2.中國科學院上海生命科學研究院植物生理生態(tài)研究所合成生物學重點實驗室，上海 201306;3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風險評估實驗室(上海)，上海 201306)

為了建立適用于嗜熱鏈球菌菌株資源多樣性調(diào)查的菌株分型方法，嘗試將1型CRISPR位點間區(qū)序列分析用于嗜熱鏈球菌的菌株分型，并與常用ERIC-PCR指紋圖譜方法進行了比較。結(jié)果表明，1型CRISPR位點間區(qū)序列分析可以把30株從三個不同樣品中分離的嗜熱鏈球菌分成三種差異明顯的類型：不同類型菌株之間沒有相同的間區(qū)序列；而同一類型菌株之間，間區(qū)序列的組成和排列則基本一致，并且上述分型的結(jié)果與用ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)獲得的結(jié)果完全一致。因此，1型CRISPR位點間區(qū)序列分析是嗜熱鏈球菌分型鑒定的可靠方法，并適用于大量菌株的分型鑒定和多樣性調(diào)查。

嗜熱鏈球菌；1型CRISPR位點；間區(qū)序列分析；ERIC-PCR指紋圖譜；菌株分型

嗜熱鏈球菌是發(fā)酵乳品工業(yè)中最為重要的乳酸菌之一，可以產(chǎn)生風味物質(zhì)如乳酸、乙醛和丁二酮來調(diào)節(jié)酸奶風味[1]。同時，嗜熱鏈球菌可以縮短酸奶的凝乳時間，增加酸奶制品的黏度，改善酸奶的后酸化現(xiàn)象[2]。此外，其益生特性可以增強酸奶的保健功能[3]。人們已經(jīng)從傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品分離了大量的嗜熱鏈球菌，對這些菌株進行分型，可以為乳品發(fā)酵工業(yè)提供更多菌株資源。目前，基于指紋圖譜的分析方法是嗜熱鏈球菌分型研究中最為常用的方法[4-6]，例如，隨機擴增DNA多態(tài)性(random amplification of polymorphic DNA，RAPD)和擴增片段長度多態(tài)性(amplified fragment-length polymorphism，AFLP)等指紋圖譜方法都已經(jīng)被用于嗜熱鏈球菌的菌株分型等。但是這些基于指紋圖譜的分析方法具有很大的局限性。首先，指紋圖譜的分析方法容易受到實驗條件的影響，不同實驗室得到的指紋圖譜相互之間很難進行比較；其次，指紋圖譜的分型方法也不易于對大量的菌株信息進行存儲和比較[7]。多位點序列分型(Multiple loci sequence typing，MLST)是近些年出現(xiàn)的菌株分型的新方法。MLST通過對菌株的多個保守基因進行測序進而達到分型的目的，這是一種準確度高、重復性好的分型方法，但是因為需要對多個位點進行測序所以成本比較高。Yu等利用MLST的方法對從蒙古國和中國的18個地區(qū)發(fā)酵乳制品中分離的239株嗜熱鏈球菌進行了分型。雖然通過MLST獲得了可靠的分型結(jié)果，但是這種方法需要同時對嗜熱鏈球菌的10個持家基因(carB、clpX、dnaA、murC、murE、pepN、pepX、pyrG、recA和rpoB)進行測序，然后再進行分型分析[8]，顯得十分繁瑣。規(guī)律成簇的間隔短回文重復(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPRs)是一類廣泛分布于細菌和古細菌基因組中的重復結(jié)構(gòu)[10-11]。CRISPR的結(jié)構(gòu)特點是包括一段由不連續(xù)的同向重復序列(direct repeat，DR)間隔著28～32 bp的非重復間區(qū)序列(spacer)組成的區(qū)域。一般來說，同一個菌種CRISPR位點的同向重復序列絕大多數(shù)非常保守[12]， RNA穩(wěn)定性預測證明同向重復序列傾向于形成短的回文結(jié)構(gòu), 該結(jié)構(gòu)可能是CAS蛋白的識別標記[13]。Barrangou等發(fā)現(xiàn)CRISPR中的間區(qū)序列來源于侵染宿主的噬菌體[14]，因此間區(qū)序列具有很高的特異性，即使在同一物種的不同菌株間，間區(qū)序列也往往不同[15]，間區(qū)序列的高度變異性使它適用于同一菌種不同菌株分型的分子標記，它實際上反映了不同菌株對應環(huán)境的適應過程。在嗜熱鏈球菌中發(fā)現(xiàn)了三種類型的CRISPR位點，其中類型1的CRISPR位點是所有嗜熱鏈球菌都具有的。Bolotin等[16]、Horvath等[17]針對嗜熱鏈球菌的1型CRISPR位點序列設(shè)計了保守引物，可以用于1型CRISPR位點的PCR擴增。由于CRISPR中間區(qū)序列的高度可變性，因此可以作為對嗜熱鏈球菌進行菌株分型的理想分子標記。ERIC-PCR是一種基于長引物的隨機擴增DNA多態(tài)性指紋圖譜技術(shù)(LP-RAPD)，由于其引物比較長且PCR退火溫度比較高，因此具有比RAPD指紋圖譜更高的穩(wěn)定性和重復性[18]。這一技術(shù)已經(jīng)廣泛用于包括Corynebacteriumpseudotuberculosis、Salmonella、Listeria、Lactobacilluscasei和Lactobacillusacidophilus等多種微生物菌種的分型[19-22]。本研究將同時利用1型CRISPR位點間區(qū)序列分析和ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)對從三個家庭手工發(fā)酵酸奶中分離獲得的30株嗜熱鏈球菌進行分型，并對它們之間的分析結(jié)果和優(yōu)缺點進行比較分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原材料和菌株 家庭手工制作的酸奶樣品采集自陜西省；嗜熱鏈球菌分離培養(yǎng)基采用M17固體培養(yǎng)基(英國Oxiod公司)。

1.1.2 材料與試劑rTaqDNA聚合酶和LATaqDNA聚合酶購自日本TaKaRa公司；Dpx高保真DNA聚合酶購自上海吐露港生物科技有限公司；三菱AnaeroPackSystem-Anaero厭氧產(chǎn)氣袋購自日本Mitsubishi Gas化學公司；細菌基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；其他生化試劑購自上海生物工程公司。

1.1.3 主要儀器 Mastercycler?pro s梯度PCR儀(德國eppendorf公司)，Tanon-EPS 300電泳儀(上海天能科技有限公司)，Bio-rad凝膠成像分析系統(tǒng)(美國伯樂公司)。

1.2 方法

1.2.1 嗜熱鏈球菌的分離 按常規(guī)方法分離酸奶樣品中的嗜熱鏈球菌，具體步驟如下：將酸奶樣品利用滅菌的生理鹽水進行梯度稀釋并涂于M17平板培養(yǎng)基上，置于厭氧罐中43 ℃培養(yǎng)48 h。挑取單克隆于盛有M17液體培養(yǎng)基的96孔板中，置于厭氧罐中43 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.2 分離菌株基因組DNA的提取 使用天根細菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的基因組DNA，具體操作按說明書進行。

1.2.3 分離菌株的鑒定與分型 ①分離菌株的16S rRNA基因鑒定：以分離菌的基因組DNA為模板，引物采用27F(5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，并利用rTaqDNA聚合酶擴增分離菌株的16S rRNA基因，并用引物27F進行測序，通過序列比對確定分離菌株種屬。②分離菌株的ERIC-PCR 指紋圖譜分析：以分離菌株的基因組DNA為模板，利用LATaqDNA聚合酶進行擴增。反應體系如下： 25 μL反應體系中包含2.5 μL 10×LA buffer(Mg2+free)，2 μL 25 mmol/L MgCl2溶液，2 μL 2.5 mmol/L dNTP, 20 μmol/L E1(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′)和E2(5′-AAGTAAGTgACTGGGGTGAGCG-3′)引物各0.5 μL ，模板DNA 40～80 ng，2.5 ULATaqDNA聚合酶，用雙蒸餾水補足反應體系。PCR擴增程序：95 ℃預變性7 min(預變性之后加入LATaqDNA聚合酶)； 94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min, 65 ℃ 8 min，共30 個循環(huán);最后 65 ℃退火 16 min。用Quantity One軟件分析ERIC-PCR指紋圖譜，結(jié)果導入到Past軟件中，使用Dice相似性系數(shù)進行指紋圖譜之間相似性的計算，在此基礎(chǔ)上使用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)算法構(gòu)建聚類矩形圖。③分離菌株的1型CRISPR位點PCR擴增： 以分離菌的基因組DNA為模板，利用Dpx高保真DNA聚合酶進行擴增。 50 μL反應體系中包括5 μL 10×Dpx Buffer，5 μL 2 mmol/L dNTP，嗜熱鏈球菌1型CRISPR位點特異性引物YC70(5′-TGCTGAGACAACCTAGTCTCTC-3′)和CR1-rev (5′-TAAACAGAGCCTCCCTATCC-3′)各0.5 μL，5 U Dpx DNA聚合酶，模板DNA 30～50 ng，用雙蒸水補足體系到50 μL。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的長度，然后用引物YC70和CR1-rev對PCR產(chǎn)物進行測序，并最終測通。④分離菌株的1型CRISPR位點間區(qū)序列分析： 將分離菌株的CRISPR測序結(jié)果提交CRISPR Finder(http://crispr.u-psud.fr/Server/)鑒定其中的間區(qū)序列。序列不同的間區(qū)分別用不同的方格圖案染色表示，并按照在CRISPR位點中的順序進行排列。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱鏈球菌的分離

使用M17培養(yǎng)基從樣品SX1、SX2和SX3中分別分離了8株、8株和14株菌，通過16S rRNA基因序列測定，與標準菌株S.thermophilesATCC 19258的相似性在99.5%～100%之間，表明它們都屬于嗜熱鏈球菌。

圖1 分離菌株的ERIC-PCR指紋圖譜(每種亞型至少選擇一個菌株，見圖2)Fig.1 ERIC-PCR fingerprints of S. thermophiles isolates (At least one strain was selected from each subtype in Fig.2)M：DNA分子標記M：DNA marker

2.2 嗜熱鏈球菌的ERIC-PCR指紋圖譜分析

ERIC-PCR指紋圖譜分析是常規(guī)的菌株分型方法，首先用這一常規(guī)方法對分離獲得的30株嗜熱鏈球菌進行了菌株分型，如圖1所示，這些菌株的指紋圖譜在1.3 kb處共有一條主帶，這條共有的優(yōu)勢條帶可能是嗜熱鏈球菌所特異性擁有的。在樣品SX1中，可以明顯觀察到8號菌株與其他3株菌的差異，即在1.5 kb以上比其他菌株多了3條微弱卻單一的條帶；在樣品SX2中1、3號和2、5號菌株的差異則在2 kb左右的條帶上；樣品SX3中，10號菌株與其他3株相比缺少了在900 bp左右處的條帶。對這些指紋圖譜進行聚類分析，結(jié)果表明從3個樣品中分離到的嗜熱鏈球菌分別聚為3個cluster，表明這些乳酸菌可以根據(jù)分離的樣品分為3種類型。同一類型中的乳酸菌具有比較高的相似度，指紋圖譜的相似性都在80%以上(圖2)。同一類型的樣品內(nèi)部又可以分為2種亞型，共6種亞型，即Type1-1、Type1-2、Type2-1、Type2-2、Type3-1和Type3-2，每個亞型的指紋圖譜是完全相同的。

圖2 30株嗜熱鏈球菌ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析結(jié)果Fig.2 Clustering analysis of ERIC-PCR fingerprintings for 30 S. thermophiles isolates

2.3 嗜熱鏈球菌1型CRISPR位點的擴增及間區(qū)序列分析

首先利用嗜熱鏈球菌特異性引物對分離獲得的30株菌的1型CRISPR位點進行了PCR擴增。如圖3所示，這30株嗜熱鏈球菌均可擴增出單一的條帶，且條帶大小都在2 kb到3 kb之間，通過瓊脂糖凝膠電泳很難分辨出它們大小的差異。所以，根據(jù)ERIC-PCR 聚類結(jié)果選出16個代表菌株(包含了所有的亞型)并對其1型CRISPR位點的PCR產(chǎn)物進行了測序。

隨后通過CRISPR Finder對16株嗜熱鏈球菌的CRISPR位點進行序列分析，找出每個菌株CRISPR位點內(nèi)的間區(qū)序列。其中，為了更加直觀地比較CRISPR片段中間區(qū)序列的差異，不同的間區(qū)序列采用不同的圖案來表示(圖4)。從圖4可以看出，從樣品SX2中分離的4株菌的1型CRISPR位點均含有27個間區(qū)序列且間區(qū)序列的組成和排列完全相同；從樣品SX1中分離的6株菌的1型CRISPR位點均含有20個間區(qū)序列且間區(qū)序列的組成和排列完全相同；從樣品SX3中分離的6株菌的1型CRISPR位點均含有27到28個間區(qū)序列，菌株SX3-5和SX3-8的CRISPR位點比其他4個菌株缺少一個間區(qū)，除此之外6個菌株CRISPR位點間區(qū)序列的組成和排列完全相同。因此根據(jù)CRISPR位點間區(qū)序列的比對情況，所有不同分離來源的菌株可以明顯分為3種類型(圖4)：不同類型菌株間沒有相同的間區(qū)序列；而同一類型菌株間，間區(qū)序列的組成和排列則基本一致。通過對同一菌株的CRISPR位點進行分析，發(fā)現(xiàn)有些間區(qū)序列重復出現(xiàn)了幾次，例如從樣品SX2分離的4株菌中，每個菌株均含有5對重復的間區(qū)序列，分別為S12和S20、S13和S21、S14和S22、S15和S23、S16和S24；而從樣品SX1分離的6株菌中，每個菌株均含有1對重復的間區(qū)序列，即S14和S17，類似的現(xiàn)象也曾出現(xiàn)在S.thermophilesDGCC 6297的1型CRISPR位點中[17]。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是菌株被相似的噬菌體侵染過，或者是CRISPR序列自我復制形成的。

圖3 30株嗜熱鏈球菌CRISPR位點PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products obtained from CRISPR1 locus for 30 S. thermophiles isolates

圖4 16株代表菌株的CRISPR中間區(qū)序列的排布示意圖Fig.4 Arrangement of spacers across the CRISPR locus for S. thermophiles strains序列不同的間區(qū)序列用不同圖案的方塊表示Each spacer is represented by a combination of one select character in a particular font color, on a particular background color

2.4 兩種分型方法的結(jié)果比較

用1型CRISPR位點間區(qū)序列分析對30株嗜熱鏈球的分型結(jié)果與常規(guī)的ERIC-PCR指紋圖譜技術(shù)獲得的結(jié)果基本一致，說明1型CRISPR位點間區(qū)序列分析是嗜熱鏈球菌分型鑒定的可靠方法。但是研究發(fā)現(xiàn)兩種分析方法獲得的結(jié)果之間也存在一些差異，ERIC-PCR指紋圖譜分析似乎對于菌株間基因組的變異更為敏感，可以把同一類型的菌株分為更多的亞型。

3 討 論

由于CRISPR位點的間區(qū)序列來源于侵染宿主的噬菌體，所以CRISPR位點間區(qū)序列反映了噬菌體與宿主之間的相互識別，同時CRISPR位點間區(qū)序列的排列也反映了菌株對環(huán)境適應性進化的結(jié)果，這可能是CRISPR位點間區(qū)序列能夠應用菌株分析的原因。

由于不適用于大量的菌株信息的存儲和比較，所以包括ERIC-PCR在內(nèi)的、基于指紋圖譜的方法在對大量菌株進行分型時存在明顯的劣勢。而基于CRISPR位點間區(qū)序列分析的分型方法正可以彌補這一缺陷，可以將不同菌株的間區(qū)序列及其排序存儲在數(shù)據(jù)庫中并進行相互比較。而與需要對多個位點進行測序的MLST技術(shù)相比較，CRISPR位點間區(qū)序列分析的分型方法只需要測定一個CRISPR位點(一般小于4 kb)，所以分型速度更快、成本更低。根據(jù)本研究的結(jié)果，甚至只需要測定CRISPR位點兩頭的序列就可以達到相同的分型效果。因此基于CRISPR位點間區(qū)的序列分析可能會在包括嗜熱鏈球菌等普遍含有CRISPR位點的微生物菌株分型中有廣泛應用前景。

[1] 白娜, 于潔, 王宏梅, 等. 發(fā)酵乳后熟期間嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌產(chǎn)乙醛特性[J]. 乳業(yè)科學與技術(shù), 2014, 37(1): 1-5.

[2] Beal C, Skokanova J, Latrille E, et al. Combined effects of culture conditions and storage time on acidification and viscosity of stirred yogurt[J]. Journal of Dairy Science, 1999, 82(4): 673-681.

[3] 郜洪濤, 呂嘉櫪，閆肅, 等.嗜熱鏈球菌對酸奶發(fā)酵的影響及應用前景[J]. 中國釀造, 2010, 29(11): 5-8.

[4] Lazzi, Bove C G, Sgarbi E, et al. Application of AFLP fingerprint analysis for studying the biodiversity ofStreptococcusthermophilus[J]. Journal of microbiological methods, 2009, 79(1): 48-54.

[5] Moschetti G, Blaiotta G, Aponte M, et al. Random amplified polymorphic DNA and amplified ribosomal DNA spacer polymorphism: powerful methods to differentiateStreptococcusthermophilusstrains[J]. Journal of Applied Microbiology, 1998, 85(1): 25-36.

[6] O’Sullivan T F, Fitzgerald G F. Comparison ofStreptococcusthermophilusstrains by pulse field gel electrophoresis of genomic DNA[J]. FEMS microbiology letters, 1998, 168(2): 213-219.

[7] Grissa I, Bouchon P, Pourcel C,et al. On-line resources for bacterial micro-evolution studies using MLVA or CRISPR typing[J]. Biochimie, 2008, 90(4): 660-668.

[8] Yu J, Sun Z, Liu W, et al. Multilocus sequence typing ofStreptococcusthermophilusfrom naturally fermented dairy foods in China and Mongolia[J]. BMC microbiology, 2015, 15(1): 236.

[9] Lindstedt B A. Multiple-locus variable number tandem repeats analysis for genetic fingerprinting of pathogenic bacteria[J]. Electrophoresis, 2005, 26(13): 2567-2582.

[10]Jansen R, Embden J, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular Microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575.

[11]Sorek R, Kunin V, Hugenholtz P. CRISPR-a widespread system that provides acquired resistance against phages in bacteria and archaea[J]. Nature Reviews Microbiology, 2008, 6(3): 181-186.

[12]Jansen R, Embden J, Gaastra W, et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J]. Molecular microbiology, 2002, 43(6): 1565-1575.

[13]Kunin V, Sorek R, Hugenholtz P. Evolutionary conservation of sequence and secondary structures in CRISPR repeats[J]. Genome Biol, 2007, 8(4): R61.

[14]Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes[J]. Science, 2007, 315(5819): 1709-1712.

[15]崔玉軍, 李艷君，顏焱鋒, 等.規(guī)律成簇的間隔短回文重復: 結(jié)構(gòu), 功能與應用[J]. 微生物學報, 2008, 48(11): 1549-1555.

[16]Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, et al. Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin[J]. Microbiology-Sgm, 2005, 151: 2551-2561.

[18]Gillings M, Holley M. Amplification of anonymous DNA fragments using pairs of long primers generates reproducible DNA fingerprints that are sensitive to genetic variation[J]. Electrophoresis, 1997, 18(9): 1512-1518.

[19]Dorneles E M S, Santana J A, Andrade G I, et al. Molecular characterization ofCorynebacteriumpseudotuberculosisisolated from goats using ERIC-PCR[J]. Genetics and Molecular Research, 2012, 11(3): 2051-2059.

[20]游勇來.沙門氏菌的分離鑒定及 PCR 快速分型的研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2013.

[21]Laciar A, Vaca L, Lopresti R, et al. DNA fingerprinting by ERIC-PCR for comparingListeriaspp. strains isolated from different sources in San Luis, Argentina[J]. Revista Argentina de microbiologia, 2006, 38(2): 55.

[22]孫志宏. 自然發(fā)酵酸馬奶中乳桿菌的 DNA 多態(tài)性研究[D]. 呼和浩特: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學, 2006.

Application of Spacers of CRISPR 1 Locus to TypingStreptococcusthermophilesStrains

ZHANG Lu-lu1, 3, YAN Xing2, ZHAO Yong1, 3

(1.Coll.ofFoodSci. &Technol.,ShanghaiOceanUni.,Shanghai201306; 2.KeyLab.ofSynth.Biol.,ShanghaiInst.ofPlantPhysiol. &Ecol.,ChineseAcad.ofSci.,Shanghai201306; 3.Lab.ofQual. &SafetyRiskAssessm’tforAquaticProd.onStorage&Preserv’n(Shanghai),MinistryofAgric.Shanghai201306)

In order to establish a strain typing method suitable for investigating the diversity ofStreptococcusthermophilesresources based on spacers of CRISPR 1 locus attempted to analyze the strain typing ofS.thermophilesand compared with the routine ERIC-PCR finger print spectrum method. The results showed that the spacers CRISPR 1 locus sequence analyses could divide 30 strains isolated from three different samples into three types with obvious differences: there were no similar spacer among different type of strains; and the component and arrangement among the same type of strain were basically consistent, and furthermore the results of the above mentioned typing totally accorded with the results obtained by ERIC-PCR finger print spectrum technology. Therefore, analyses on spacers of CRISPR1 locus was a reliable method for typing characterization of strains ofS.thermophilesand was especially suitable for typing classification and diversity investigation at large amount of strains.

Streptococcusthermophiles; CRISPR1 locus; spacer sequence analysis; ERIC-PCR finger print spectrum; strain typing

中國科學院科技服務網(wǎng)絡(luò)計劃(STS計劃)項目(KFJ-EW-STS-029)

張璐璐 女，碩士研究生。研究方向為食品微生物學。E-mail:llzhang0907@163.com

* 通訊作者。嚴興 男，副研究員，博士。研究方向為工業(yè)微生物收集與保藏。Tel:021-54924049, E-mail:yanxing@sibs.ac.cn

2016-01-06；

2016-03-14

Q93-31;TS252.42

A

1005-7021(2016)06-0029-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2016.06.005

趙勇 男，教授，博士。研究方向為食品安全風險評估。Tel:021-61900503, E-mail: yzhao@shou.edu.cn