精漿8-羥基脫氧鳥苷水平與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系研究

甄錦壯 鄧楊富 黃秀麗

精漿8-羥基脫氧鳥苷水平與不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的關(guān)系研究

甄錦壯 鄧楊富 黃秀麗

目的探討8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)在不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(URM)男性患者精漿中的變化,及其對患者精子DNA氧化損傷的評價(jià)作用。方法78例不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)男性患者作為URM組,50例正常生育男性作為正常生育組,比較兩組研究對象的精漿丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(TAC)、8-OHdG濃度。結(jié)果與正常生育組相比,URM組精漿MDA濃度顯著升高,8-OHdG濃度顯著升高(P＜0.01)；TAC濃度下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)男性患者存在精子DNA氧化損傷,與精漿中存在過量的活性氧自由基(ROS)、抗氧化能力下降、造成氧化應(yīng)激作用有關(guān),精漿MDA、8-OHdG濃度可反映URM男性患者精子氧化應(yīng)激狀態(tài),8-OHdG可對精子DNA氧化損傷準(zhǔn)確評價(jià),是抗氧化治療的依據(jù),從而提高精子質(zhì)量,降低流產(chǎn)的發(fā)生。

不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)；丙二醛；總抗氧化能力； 8-羥基脫氧鳥苷

近年來,隨著社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展,環(huán)境污染日益嚴(yán)重,人們生活壓力加大,復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)發(fā)生率不斷升高,嚴(yán)重影響人們的生育健康。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因復(fù)雜,其具體發(fā)病機(jī)制還不十分清楚,進(jìn)行全面的檢查仍有半數(shù)以上患者原因不明［1］,這類流產(chǎn)被稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(unexplained recurrent miscarriage),發(fā)病率也有逐年增加的趨勢。URM嚴(yán)重?fù)p害患者的身體健康,對于患者的心理也造成重大的傷害。對于URM,不但困惑著廣大的臨床醫(yī)師,而且使患者產(chǎn)生焦慮情緒,對再次妊娠產(chǎn)生恐懼心理。目前RSA的病因?qū)W研究主要集中于女性因素的分析,而對男性因素的研究相對較少。胚胎是由男性精子和女性卵子受精后形成,精子結(jié)構(gòu)和功能的完整性是保證精卵正常受精的重要前提,精子DNA完整性對胚胎發(fā)育至關(guān)重要,而氧化應(yīng)激是造成精子核DNA損傷的重要原因,精子核DNA的異?？赡軐?dǎo)致不良妊娠結(jié)局,如胚胎早期發(fā)育障礙、自然流產(chǎn)及子代疾病等。本研究通過對研究對象精漿氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA、TAC及精子DNA氧化產(chǎn)物8-OHdG定量檢測,以探討與URM的關(guān)系。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取于2015年9月～2016年3月在本院生殖科就診的78例URM男性患者為URM組,年齡22～43歲,平均年齡31.4歲；以近2年正常生育男性50例為正常生育組,年齡23～43歲,平均年齡32.1歲,兩組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),具有可比性。。兩組男性均排除不良生活習(xí)慣、惡劣生活工作環(huán)境及生殖系統(tǒng)解剖異常、精索靜脈曲張、感染、外科手術(shù)、腫瘤、內(nèi)分泌、免疫、高血壓等引致體內(nèi)氧化應(yīng)激作用的疾病。

1.2 不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)診斷標(biāo)準(zhǔn) 自然流產(chǎn)是指妊娠＜28周、胎兒體重＜1000 g而自然終止者。當(dāng)自然流產(chǎn)連續(xù)發(fā)生3次或3次以上時則稱為復(fù)發(fā)性流產(chǎn),經(jīng)全面的檢查仍有未找到原因不明的被稱為不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)［1］。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 兩組精液標(biāo)本均要求禁欲2～7 d后手淫法取得,精液液化后2500 g離心10min分離上層精漿。

1.3.2 試劑和儀器 MDA、TAC以化學(xué)比色法檢測,試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)；8-OHdG以酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA) 檢測,采用美國DSL試劑盒,在NK3酶標(biāo)儀檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

與正常生育組相比,URM組精漿MDA濃度顯著升高,8-OHdG濃度顯著升高(P＜0.01)；TAC濃度下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1 兩組精漿MDA、TAC、8-OHdG水平比較(±s)

表1 兩組精漿MDA、TAC、8-OHdG水平比較(±s)

注：與正常生育組比較,aP＜0.01

組別 例數(shù) MDA(nmol/ml) TAC(U/ml) 8-OHdG(ng/ml) URM組 78 13.66±3.74a 18.52±5.16 21.65±4.54a正常生育組 50 9.17±3.06 19.45±5.71 16.93±3.14

3 討論

環(huán)境因素、污染物和醫(yī)源性措施均可導(dǎo)致精原細(xì)胞受損,精原細(xì)胞本身修復(fù)損傷的能力很低,且對各種損傷因子極為敏感,尤其是ROS等的損害作用,而精子不具備自我修復(fù)的能力,由此所致的損傷是不可逆的。ROS的產(chǎn)生是一種正常生理情況,男性生殖細(xì)胞在不同的分化階段都能產(chǎn)生ROS,存在于生殖道管腔及精液中的ROS,主要由多形核中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,當(dāng)生殖道出現(xiàn)感染等情況時,作為第一道防御機(jī)制的中性粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物,代謝旺盛,產(chǎn)生過多的ROS,細(xì)胞膜上的NADPH氧化酶可由細(xì)菌、免疫復(fù)合物和各種細(xì)胞因子刺激活化而產(chǎn)生ROS；此外,電離輻射、酚類化合物等也會促進(jìn)生殖系統(tǒng)中ROS產(chǎn)生。ROS在生物體內(nèi)扮演著雙重角色,少量適當(dāng)水平的ROS有利于精子活動力、獲能以及頂體反應(yīng),并在生精細(xì)胞的增殖、分化和精子功能調(diào)節(jié)方面具有重要作用；當(dāng)ROS大量存在,遠(yuǎn)超過機(jī)體清除能力時,產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用,最終產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物,損害精子結(jié)構(gòu)和功能。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)和各種抗氧化劑是保護(hù)精子DNA的重要因素,附屬性腺可以分泌超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫(CAT),使體內(nèi)產(chǎn)生的自由基得以及時清除,從而維持生理低水平的自由基水平,保護(hù)精子不受氧化應(yīng)激的損害,這些體內(nèi)酶類和非酶類抗氧化物的總體抗氧化水平稱為TAC,低水平的精漿TAC水平是精子功能失調(diào)的一個重要指標(biāo)。因此,精漿MDA、TAC常用于精子氧化應(yīng)激的評價(jià)。但在臨床上,氧化應(yīng)激的定量仍舊存在問題,因氧化應(yīng)激與各種各樣疾病均密切相關(guān),故缺乏特異性,其量化指標(biāo)難以用于特別指定的疾病。而且,導(dǎo)致精子DNA損傷的潛在誘因多樣,因此要對男性精液中氧化應(yīng)激狀態(tài)評估以及是否是由此所致的精子DNA損傷,僅通過對男性精液中ROS和抗氧化物的檢測評價(jià),并不能完全證實(shí)患者精子DNA損傷只是這兩類物質(zhì)共同作用的結(jié)果,不能排除其他病因所致精子DNA損傷。

近年來,國內(nèi)外有關(guān)專家學(xué)者對精液中的8-OHdG水平與精子質(zhì)量的相關(guān)性進(jìn)行研究,De Iuliis等［2］認(rèn)為人類精子DNA的損傷與8-OHdG的形成密切相關(guān)。8-OHdG是ROS引起DNA氧化損傷的修飾產(chǎn)物之一,其生成原因很多,有學(xué)者認(rèn)為是大量ROS直接攻擊DNA中的鳥嘌呤或由羥基自由基攻擊DNA中的脫氧鳥苷上的C-8位而形成［3］,并導(dǎo)致精子DNA鏈斷裂、片段化的產(chǎn)生,使精子DNA的完整性受到破壞。體液中8-OHdG作為機(jī)體DNA氧化損傷所形成的代謝終產(chǎn)物,在體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在,非DNA氧化途徑無法形成,不受飲食等因素影響,可被機(jī)體特異DNA修復(fù)酶剪切清除并經(jīng)腎臟隨尿排泄,因此其含量可直接反映機(jī)體氧化損傷程度［3］。

本研究中發(fā)現(xiàn)與正常生育組相比,URM組精漿MDA濃度顯著升高,8-OHdG濃度顯著升高(P＜0.01)；TAC濃度下降,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。其生理病理過程是URM男性患者精漿中存在大量ROS,而低水平的抗氧化能力使精漿中ROS清除能力下降,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),精核獨(dú)特緊密結(jié)構(gòu)不足以防御ROS的直接攻擊,引起DNA氧化產(chǎn)物8-OHdG的形成,最終導(dǎo)致精子DNA產(chǎn)生單鏈或雙鏈的斷裂,造成精子DNA損傷,因此精漿中8-OHdG濃度可用于評價(jià)精子DNA氧化損傷,8-OHdG含量與精子DNA氧化損傷程度成正相關(guān)［4］。另外,精子膜中含有高濃度的不飽和脂肪酸(PURA),只含有低濃度的ROS清除酶,精子膜對ROS的攻擊極為敏感,ROS可使PURA發(fā)生脂質(zhì)過氧化(LPO)級聯(lián)反應(yīng),最終產(chǎn)生MDA等脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物,使精子膜的流動性和完整性受到損傷,進(jìn)而破壞精子結(jié)構(gòu)和功能,也會導(dǎo)致DNA單鏈的形成和雙鏈的斷裂,破壞精子核內(nèi)DNA的完整性［5,6］。同時,DNA堿基的過氧化會引起堿基修飾、DNA鏈斷裂以及染色質(zhì)交聯(lián),并加速生殖細(xì)胞凋亡過程。精子DNA損傷后,可引起一系列的不良后果,如降低受精率、破壞植入前的胚胎發(fā)育、增加流產(chǎn)率等。韓士廣等［7］研究也表明早期自然流產(chǎn)患者存在較高的精子DNA損傷,嚴(yán)重影響胚胎品質(zhì)而導(dǎo)致早期自然流產(chǎn)的發(fā)生。

綜上所述,URM男性患者精漿中存在過量的ROS,抗氧化能力消耗性下降,造成氧化應(yīng)激,對精子產(chǎn)生毒性作用,使精子DNA氧化損傷,導(dǎo)致受精能力下降、胚胎染色質(zhì)異常、增加早期流產(chǎn)率；精漿MDA、8-OHdG濃度可反映URM男性患者精子氧化應(yīng)激狀態(tài),8-OHdG可對精子DNA氧化損傷準(zhǔn)確評價(jià),是抗氧化治療的依據(jù),從而改善精子存活環(huán)境,降低精子損傷,提高精子質(zhì)量,提高受精、種植機(jī)會以及持續(xù)妊娠的能力,降低流產(chǎn)的發(fā)生,最終分娩出健康嬰兒。

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10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2016.14.061

2016-04-28］

528300 廣東省順德婦幼保健院