急性冠脈綜合征患者血小板反應(yīng)蛋白-1基因多態(tài)性分析

高磊，何國(guó)平，錢億超，戚傳平

· 論著 ·

急性冠脈綜合征患者血小板反應(yīng)蛋白-1基因多態(tài)性分析

高磊1，何國(guó)平1，錢億超1，戚傳平2

目的研究中國(guó)人群血小板反應(yīng)蛋白-1（TSP-1）基因A2210G（N700S）多態(tài)性與急性冠脈綜合征（ACS）的相關(guān)性。方法采用病例-對(duì)照研究，入選2005年6月～2010年11月在江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院和江蘇省人民醫(yī)院住院的412例ACS患者及同期337例非冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┱咦鳛閷?duì)照組，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析的方法檢測(cè)TSP-1 A2210G多態(tài)性，采用logistics回歸分析TSP-1基因多態(tài)性分布與ACS的相關(guān)性。結(jié)果TSP-1基因A2210G多態(tài)性AG基因型在ACS組和對(duì)照組的分布無顯著性差異（1.5% vs. 0.6%，P=0.43），未檢測(cè)到GG純合子。G等位基因頻率在ACS組和對(duì)照組分別為0.7%、0.3%（P=0.43）。多元Logistic回歸分析顯示，TSP-1基因AG基因型與ACS無顯著相關(guān)性（OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46）。結(jié)論TSP-1基因700N→S變異在中國(guó)人群中發(fā)生頻率低，且與ACS的發(fā)病無顯著相關(guān)性。

血小板反應(yīng)蛋白；基因多態(tài)性；急性冠脈綜合征

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┑囊环N嚴(yán)重類型，是一組由急性心肌缺血引起的臨床綜合征，包括急性ST段抬高型心肌梗死、急性非ST段抬高型心肌梗死及不穩(wěn)定型心絞痛。ACS最主要的發(fā)病機(jī)制是不穩(wěn)定斑塊破裂或糜爛和繼發(fā)血栓形成。在被AHA評(píng)為當(dāng)年十大研究進(jìn)展之一的GeneQuest研究中，Topol等[1]發(fā)現(xiàn)血小板反應(yīng)蛋白-1（thrombospondin-1，TSP-1）基因多態(tài)性A2210G（N700S）在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊形成過程中起著重要的作用，與急性心肌梗死的危險(xiǎn)性顯著相關(guān)。本研究旨在探討TSP-1 N700S多態(tài)性與中國(guó)人群ACS的可能關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象入選病例來源于2005年6月～2010年11月在江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院和江蘇省人民醫(yī)院的心內(nèi)科住院患者。其中ACS組412例，疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)為2002年AHA/ACC關(guān)于ACS的診斷指南，其中男性298例，女性114例，平均年齡（65.24± 10.95）歲。對(duì)照組337例，其中男性232例，女性105例，平均年齡（63.66±11.76）歲，經(jīng)檢查排除冠心病。所有病例均為中國(guó)人群，并排除惡性腫瘤、心肌病、先心病及嚴(yán)重肝病和腎病等。

1.2 研究方法采集外周靜脈血約2 ml，分離出白細(xì)胞，以酚-氯仿法提取基因組DNA。PCR擴(kuò)增體系總體積為50 μl，包括10×緩沖液5 μl、上下游引物各20 pmol、4種dNTP終濃度為0.2 mmol/ L、Mg2+終濃度為2.0 mmol/L、DNA模板100 ng和Taq DNA酶1.25 U。上游引物為5′-AAGAACGC CAAGTGCAACTAC-3′，下游引物為5′-AGAGCTAGCCCTGTTCATGTT-3′。PCR反應(yīng)條件：先95℃預(yù)變性5 min，然后按95℃ 40 s、59℃ 30 s、72℃ 40 s進(jìn)行33個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，UVI自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BsrⅠ于65℃消化約12 h，酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。進(jìn)一步抽取部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，使用t檢驗(yàn)比較。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，使用χ2檢驗(yàn)比較。關(guān)聯(lián)程度用優(yōu)勢(shì)比（OR）和95%可信區(qū)間（CI）表示，使用logistic回歸分析計(jì)算。以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般臨床資料比較ACS組和對(duì)照組在年齡、性別、舒張壓（DBP）、總膽固醇（TC）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）等方面比較，差異無顯著性意義（P＞0.05）。ACS組吸煙率、高血壓和糖尿病比例、空腹血糖（FPG）、收縮壓（SBP）及三酰甘油（TG）水平明顯高于對(duì)照組，而低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

2.2 TSP-1基因型分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為360 bp的片段，如果存在等位基因G，當(dāng)用內(nèi)切酶BsrⅠ酶切后可產(chǎn)生240和120 bp 兩條片段。本研究檢測(cè)到兩種基因型（圖1）：AA基因型（360 bp）和AG基因型（360，240和120 bp），未檢測(cè)到GG基因型。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證（圖2）。

圖1 TSP-1不同基因型PCR產(chǎn)物酶切電泳圖 [1：DNA Marker；2、3、4、6：AA基因型（360 bp）；5：AG基因型（360、240和120 bp）]

圖2 PCR產(chǎn)物測(cè)序圖（A部分顯示為AA基因型，箭頭提示該位點(diǎn)呈A/A單峰；B部分顯示為AG基因型，箭頭示該位點(diǎn)呈A/G雙峰）

2.3 TSP-1基因多態(tài)性分布及其與ACS的關(guān)系研究結(jié)果顯示，TSP-基因AG基因型頻率在ACS組和對(duì)照組分別為1.5%和0.6%（P=0.43），G等位基因頻率在兩組間的分布也無顯著性差異（0.7% vs. 0.3%，P=0.43）（表2）。Logistic回歸分析顯示，調(diào)整吸煙、高血壓、糖尿病、TG及HDL-C等因素后，TSP-1基因AG基因型與ACS無顯著相關(guān)性（OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46）。

3 討論

TSP-1是一種多結(jié)構(gòu)域及多功能的細(xì)胞外基質(zhì)糖蛋白，可由激活的血小板α顆粒、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等合成分泌，參與調(diào)節(jié)平滑肌增值與遷移、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、血小板聚集、血栓形成及血管新生等生物學(xué)過程[2-5]。TSP-1在ACS動(dòng)脈粥樣硬化的形成及損傷過程中發(fā)揮重要作用，其遺傳多態(tài)性對(duì)動(dòng)脈壁中的重要事件具有潛在意義[6,7]。

TSP-1基因定位于15號(hào)染色體q15，編碼1170個(gè)氨基酸，包括21個(gè)外顯子。其多態(tài)性位點(diǎn)A2210G位于第13外顯子，該位點(diǎn)上發(fā)生A→G堿基改變，從而導(dǎo)致蛋白鏈的第700位氨基酸由天冬酰胺變?yōu)榻z氨酸（700N→S）。GeneQuest研究中，Topol等[1]發(fā)現(xiàn)TSP-1 N700S多態(tài)性與早發(fā)心肌梗死的危險(xiǎn)性顯著相關(guān)。有學(xué)者進(jìn)一步研究表明，TSP-1蛋白第700位氨基酸N→S替代可引起其鈣結(jié)合域?qū)︹}離子的親活力下降，進(jìn)而增加了TSP-1致血小板聚集和釋放功能，這可能是其促進(jìn)心肌梗死發(fā)生的可能機(jī)制[8]。而之后日本、荷蘭等人群的研究卻未能重復(fù)GeneQuest研究結(jié)果，TSP-1 N700S變異在不同種族人群中的分布差異很大[9-12]。本研究表明TSP-1 N700S不是中國(guó)人群常見的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，700N→S變異頻數(shù)明顯低于西方人群（0.3% vs. 11%）[5]，且未發(fā)現(xiàn)其與ACS的發(fā)生顯著相關(guān)。各研究報(bào)道不一致可能與以下因素有關(guān)，如研究人群種族不同、遺傳背景差異、對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)差異以及環(huán)境因素影響等。當(dāng)然，本研究的設(shè)計(jì)和方法亦有一些局限性，如樣本量偏小，且未進(jìn)行TSP-1功能學(xué)研究。

表2 TSP-1 A2210G基因型和等位基因頻率的分布

綜上所述，不同種族人群的TSP-1 N700S多態(tài)性分布差異較大，中國(guó)人群700N→S變異發(fā)生率明顯低于西方人群，且與ACS發(fā)病無顯著相關(guān)性。本研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充了冠狀動(dòng)脈疾病TSP-1基因數(shù)據(jù)庫信息。TSP-1 N700S多態(tài)性與ACS的確切聯(lián)系尚需從多個(gè)不同的大規(guī)模人群進(jìn)一步探討。

[1] Topol EJ,McCarthy J,Gabriel S,et al. Single nucleotide polymorphisms in multiple novel thrombospondin genes may be associated with familial premature myocardial infarction [J]. Circulation, 2001, 104(22): 2641-4.

[2] Desai P,Stein JJ,Siddiqui SA,et al. Dyslipidemia regulates thrombospondin-1-induced vascular smooth muscle cell chemotaxis[J]. Mol Cell Biochem,2015,410:85-91.

[3] Esemuede N,Lee T,Pierre-Paul D,et al. The role of thrombospondin-1 in human disease[J]. J Surg Res,2004,122:135-42.

[4] Taraboletti G,Roberts D,Liotta LA,et al. Platelet thrombospondin modulates endothelial cell adhesion, motility, and growth: a potential angiogenesis regulatory factor[J]. J Cell Biol,1990,111:765-72.

[5] Adams JC,Lawler J. The thrombospondins[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004,36:961-8.

[6] Choi KY,Kim DB,Kim MJ,et al. Higher plasma thrombospondin-1 levels in patients with coronary artery disease and diabetes mellitus[J]. Korean Circ J,2012,42:100-6.

[7] Stenina OI,Byzova TV,Adams JC,et al. Coronary artery disease and the thrombospondin single nucleotide polymorphisms[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36: 1013-30.

[8] Blue-leaf A,Hannah,Tina M,et al. A polymorphism in thrombospondin-1 associated with familial premature coronary artery disease alters Ca2+binding [J]. J Biol Chem,2004,279:51915-22.

[9] Zhou XY,Huang JF,Chen JH,et al. Genetic association analysis of myocardial infarction with thrombospondin-1 N700S variant in a Chinese population [J]. Thromb Res, 2004, 113: 181-6.

[10] Boekholdt SM,Trip MD,Peters RJ,et al. Thrombospondin-2 polymorphsim is associated with a reduced risk of premature myocardial infarction[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22: e24-7.

[11] 戴健,楊志健,馬繼政,等. 急性心肌梗死患者血小板反應(yīng)素-1單核苷酸多態(tài)性[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2006,5:422-5.

[12] Yamada Y,Izawa H,Ichihara S,et al. Prediction of the risk of myocardial infarction from polymorphisms in candidate genes[J]. N Engl J Med,2002,347(24):1916-23.

本文編輯：劉璐鑫，田國(guó)祥

Polymorphism of thrombospondin-1 gene in patients with acute coronary syndrome

GAO Lei*, HE Guoping, QIAN Yi-chao, QI Chuan-ping.*Department of Cardiology, Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University, Changzhou 213002, China.

GAO Lei; E-mail: gaolei801201@sina.com

ObjectiveTo analyze the correlation between polymorphism of the thrombospondin-1 (TSP-1) gene A2210G (N700S) and acute coronary syndrome (ACS) in the Chinese population.MethodsA case-control study was conducted. By polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis, the TSP-1 A2210G polymorphism was analyzed in 412 patients with ACS (ACS group) and 337 control subjects free from coronary artery disease (control group) from Affiliated Wujin Hospital of Jiangsu University between June 2005 and November 2010.ResultsThe frequencies of AG genotype were 1.5% and 0.6% in ACS group and control group, respectively (P=0.43). None of the homozygotes were detected for the G allele. The prevalence of the G allele was not significantly different between ACS group and control group (0.7% vs. 0.3%, P=0.43). Result of multivariate logistic regression analysis showed that AG genotype of TSP-1 gene had no significant correlation with ACS (OR=2.36；95%CI：0.46～12.48；P=0.46).ConclusionThe TSP-1 N700S variant shows a low prevalence in the Chinese population and fails to associate with an altered risk of ACS.

Thrombospondin; Genetic polymorphism; Acute coronary syndrome

R541.4

A

1674-4055(2016)12-1449-03

常州市衛(wèi)生局重大科研項(xiàng)目(ZD200601)

1213002 常州,江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院心內(nèi)科;2213002 常州,江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院檢驗(yàn)科

高磊,E-mail:gaolei801201@sina.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.12.10