HPLC法測定清火梔麥滴丸中脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷的含量

楊其波，丘琴，甄漢深，吳雪嬌

(1.南寧市第八人民醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530003；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001)

HPLC法測定清火梔麥滴丸中脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷的含量

楊其波1，丘琴2，甄漢深2，吳雪嬌2

(1.南寧市第八人民醫(yī)院藥劑科，廣西 南寧 530003；2.廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530001)

目的 采用高效液相色譜法(HPLC)測定清火梔麥滴丸中脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷含量。方法采用高效液相色譜法(HPLC)，以依利特C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)為色譜柱，以甲醇-水(55:45)為脫水穿心蓮內(nèi)酯的流動相，250 nm為脫水穿心蓮內(nèi)酯的檢測波長，以乙腈-水(13:87)為梔子苷的流動相，238 nm為梔子苷的檢測波長對清火梔麥滴丸中脫水穿心蓮內(nèi)酯、梔子苷含量進行測定。結(jié)果經(jīng)HPLC法測定，清火梔麥滴丸中的脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.20～1.26 μg范圍區(qū)間內(nèi)具有良好的線性關系(r=0.999 9)，平均回收率為98.14%。清火梔麥滴丸中的梔子苷在1.59～6.46 μg范圍區(qū)間內(nèi)具有良好的線性關系(r=0.999 9)，平均回收率為97.36%。結(jié)論高效液相色譜法（HPLC）可以快速、簡便、準確地測定清火梔麥滴丸中脫水穿心蓮內(nèi)酯、梔子苷的含量，值得應用。

高效液相色譜法；清火梔麥滴丸；脫水穿心蓮內(nèi)酯；梔子苷；含量；測定

目前，清火梔麥片被廣泛應用于臨床，該藥主要治療咽喉腫痛、發(fā)熱、牙痛等疾病[1-2]。隨著制藥技術水平的提高，清火梔麥滴丸目前正逐步研制形成，該劑型相對于片劑具有諸多優(yōu)點[3]。為測定清火梔麥滴丸中的脫水穿心蓮內(nèi)酯、梔子苷的含量，本研究采用高效液相色譜法(HPLC)進行測定，觀察高效液相色譜法(HPLC)的測定效果。

1 實驗材料

1.1 實驗儀器 高效液相色譜儀為日立L-2000型，DAD檢測器為L-2450型，WT603N電子天平(常州萬泰天平儀器有限公司)，AS10200A超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，TH48SYW690真空干燥箱(北京中西遠大科技有限公司)。

1.2 試劑 色譜純甲醇、乙腈(湖北杜文化工科技有限公司)，分析純甲醇、乙腈(湖北杜文化工科技有限公司)。脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0854-200204)、梔子苷對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：110749-200511)，穿心蓮、梔子、麥冬購于南京同仁堂藥材有限公司。清火梔麥滴丸來源于四川子仁制藥有限公司(批號：140615國藥準字Z20090052)。水為純凈水，其他試劑為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件 脫水穿心蓮內(nèi)酯的色譜條件為：色譜柱為依利特C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(55:45)，檢測波長為250 nm；梔子苷的色譜條件為：色譜柱為依利特C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流動相為乙腈-水(13:87)，檢測波長為238 nm。

2.2 制作標準曲線 采用分析電子天平精密稱取對照品脫水穿心蓮內(nèi)酯適量，使用甲醇將其溶解并定容配為濃度為0.12 mg/ml的脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液，利用0.45 μm的微孔濾膜將脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液加以濾過，分別吸取2 μl、4 μl、6 μl、8 μl、10 μl五個體積梯度進樣，測定脫水穿心蓮內(nèi)酯的線性回歸方程為：y=1 365.4x+10.216(r=0.999 9，x為脫水穿心蓮內(nèi)酯量，y為峰面積)，線性范圍為0.20～1.26 μg。采用分析電子天平精密稱取對照品梔子苷適量，使用甲醇將其溶解并定容配為濃度為0.42 mg/ml的梔子苷對照品溶液，利用0.45 μm的微孔濾膜將梔子苷對照品溶液加以濾過，分別吸取4 μl、6 μl、8 μl、10 μl、12 μl五個體積梯度進樣，測定梔子苷的線性回歸方程為：y= 764.36x-4.229(r=0.999 9，x為梔子苷量，y為峰面積)，線性范圍為1.59～6.46 μg。

2.3 制備清火梔麥滴丸樣品液 將20粒清火梔麥滴丸碾碎混勻，并采用分析電子天平精密稱取約0.125 g置于2 5 ml容量瓶中，加入20 ml甲醇，用超聲提取約1 h，冷卻后用50%甲醇稀釋至容量瓶刻度并搖勻，將清火梔麥滴丸樣品液用0.45 μm的微孔濾膜濾過留存待檢。

2.4 系統(tǒng)適應性考察 在本實驗條件下樣品中梔子苷保留時間約為5.6 min，其理論塔板數(shù)為6 000以上，分離度R=6.8。取缺梔子滴丸樣品按上述條件測定，結(jié)果在色譜中未見梔子苷峰，表明在此條件下，梔子苷的測定不受其他成份的干擾。結(jié)果見圖1、圖2、圖3。在本實驗條件下，樣品中脫水穿心蓮內(nèi)酯保留時間約為7.0 min，其理論塔板數(shù)為10 000以上，分離度R=21.7。取缺穿心蓮滴丸樣品按上述條件測定，結(jié)果在色譜中未見脫水穿心蓮內(nèi)酯峰，表明在此條件下，脫水穿心蓮內(nèi)酯的測定不受其他成份的干擾。結(jié)果見圖4、圖5、圖6。

圖1 梔子苷對照品色譜圖

圖2 清火梔麥滴丸樣品色譜圖

圖3 陰性樣品色譜圖

圖4 脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品色譜圖

圖5 清火梔麥滴丸樣品色譜圖

圖6 陰性樣品色譜圖

2.5 精密度試驗 分別取10 μl脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷對照品溶液進行高效液相色譜法(HPLC)測定，重復進樣測定6次，測得脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷峰面積值的RSD分別為0.81%、0.49%。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取一個批次的待測樣品溶液，分別按照脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷的色譜條件在0 h、1 h、2 h、4 h、8 h取10 μl溶液進行測定，結(jié)果測得脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷峰面積的RSD分別為1.79%、1.40%。結(jié)果說明，脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.7 陰性對照試驗 取10 μl不含穿心蓮及梔子藥材的陰性對照液進行HPLC測定，發(fā)現(xiàn)在脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷的色譜條件下均無峰形出現(xiàn)，說明清火梔麥滴丸中的其他成分對兩種有效成分的測定無明顯影響。

2.8 回收率考察

2.8.1 樣品中脫水穿心蓮內(nèi)酯加樣回收率考察 采用加樣回收實驗法測定，精密稱取已知含量(3.29 mg/g)的同批樣品分別加入脫水穿心蓮內(nèi)酯對照品溶液(0.637 mg/ml)1.2 ml，按上述供試品制備方法、色譜條件測定，見表1。

表1 脫水穿心蓮內(nèi)酯回收率結(jié)果

2.8.2 樣品中梔子苷加樣回收率考察 采用加樣回收實驗法測定，精密稱取已知含量(5.13 mg/g)的同批清火梔麥滴丸樣品分別加入梔子苷對照品溶液(0.36 mg/ml)1.44 ml，按上述供試品制備方法、色譜條件測定，見表2。

表2 梔子苷回收率結(jié)果

2.9 清火梔麥滴丸待測樣品含量測定及結(jié)果 分別取3批清火梔麥滴丸樣品，每批取三份，按照樣品溶液制備方案將其制備為待測樣品測試液，測定脫水穿心蓮內(nèi)酯和梔子苷的含量。測定結(jié)果為：三個批次的清火梔麥滴丸中脫水穿心蓮內(nèi)酯含量分別為：0.181 8 mg/ml，0.190 1 mg/ml，0.187 6 mg/ml；三個批次的清火梔麥滴丸中梔子苷含量分別為：0.904 2 mg/ml，0.849 5 mg/ml，0.884 1 mg/ml。見表3及表4。

表3 脫水穿心蓮內(nèi)酯含量測定結(jié)果

表4 梔子苷含量測定結(jié)果

3 討 論

清火梔麥制劑主要由穿心蓮、梔子、麥冬三味中藥組成，該制劑的主要功效為：清熱解毒、消腫涼血，目前，在臨床上常用于咽喉腫痛、發(fā)熱、牙痛、目赤等疾病的治療，在治療這些疾病中，清火梔麥制劑顯示出了較好的治療效果。目前，在2010年版《中國藥典》中，清火梔麥制劑只收載有清火梔麥片[4-6]。可以看出，清火梔麥制劑的劑型相對較少。然而，劑型與藥物發(fā)揮的效果具有重要關系，清火梔麥片在藥物生產(chǎn)及臨床應用中被發(fā)現(xiàn)有如下弊端。在藥物生產(chǎn)中，生產(chǎn)片劑的藥物損耗率較高，大量片劑生產(chǎn)后的藥物粉末被浪費；藥物生物利用度相對較低，在患者體內(nèi)的溶解度相對較小，導致患者對藥物的吸收效果不太理想。

近年來，隨著社會的快速發(fā)展，醫(yī)療技術水平的提高，醫(yī)學界對藥物的藥效要求越來越高，上世紀劑型不優(yōu)、藥效不好、溶解度低、生物利用度差的藥物已不能滿足目前的醫(yī)療需求。在社會發(fā)展的同時，制藥技術也取得了迅猛發(fā)展，因劑型對藥物的效果影響較大，所以藥物研究在劑型設計技術上取得了不斷突破，新一代的制藥技術為人們的生命健康提供了有力保障。就本研究中的清火梔麥制劑而言，目前清火梔麥滴丸已被各大制藥企業(yè)廣泛生產(chǎn)，被投入臨床應用。清火梔麥滴丸的主要成分仍然為穿心蓮、梔子、麥冬這三味中藥。清火梔麥滴丸是由藥物和固體基質(zhì)經(jīng)加熱熔融成混懸液、溶液或乳濁液后，將藥液滴入至與之不相容的冷凝劑中，因表面張力作用，藥液發(fā)生收縮，經(jīng)冷凝處理后變成滴丸劑[7-8]。清火梔麥滴丸與其他劑型相比更具優(yōu)勢，目前其因具有諸多優(yōu)點而被臨床廣泛應用，其優(yōu)點有：生產(chǎn)工藝較為簡單，要求的生產(chǎn)設備較為簡單，節(jié)約了制藥成本；生產(chǎn)制作流程簡單，避免了多流程造成的藥物損耗及其他藥物混入；藥物損耗小，清火梔麥滴丸的這種融化冷凝生產(chǎn)方法，避免了其他劑型生產(chǎn)過程中的大量藥物粉末浪費，使得藥物生產(chǎn)率大大提高，同時也減少了藥物浪費；清火梔麥滴丸在體內(nèi)的溶解度較高，患者對藥物的吸收好，生物利用度較高，提高了藥效。由此可見，清火梔麥滴丸是一種高效的中藥劑型，正是因為它的使用優(yōu)勢，所以對該制劑內(nèi)的藥物成分進行測定具有重要意義。

清火梔麥滴丸為復方制劑，方中的干擾成分較多。本研究主要對清火梔麥滴丸中的脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷這兩種藥物成分進行測定，對兩種藥物成分均采用依利特C18(4.6 mm×200 mm，5 μm)色譜柱，將甲醇-水(55:45)作為脫水穿心蓮內(nèi)酯的流動相，將250 nm作為其檢測波長；將乙腈-水(13:87)作為梔子苷的流動相，將238 nm作為其檢測波長。對脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷兩種標準品進行精密度實驗測定，發(fā)現(xiàn)精密度較為良好，又對清火梔麥滴丸的待測液進行穩(wěn)定性實驗檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種藥物成分在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。不含這兩種待測藥物成分的藥物陰性對照試驗表明，其他藥物成分對脫水穿心蓮內(nèi)酯及梔子苷的測定無干擾。因清火梔麥滴丸為復方制劑，用乙醇和水的提取效果均較差，所以本實驗中，我們使用50%甲醇并加以超聲震蕩約1 h的提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取較為充分，提取效果較好[9-11]。

為探討采用高效液相色譜法(HPLC)測定清火梔麥滴丸中脫水穿心蓮內(nèi)酯、梔子苷含量的效果，本研究采用高效液相色譜法(HPLC)對這兩種藥物成分進行從檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：清火梔麥滴丸中的脫水穿心蓮內(nèi)酯在0.20～1.26 μg范圍區(qū)間內(nèi)具有良好的線性關系(r=0.999 9)，平均回收率為98.14%；清火梔麥滴丸中的梔子苷在1.59～6.46 μg范圍區(qū)間內(nèi)具有良好的線性關系(r=0.999 9)，平均回收率為97.36%。本研究說明，高效液相色譜法(HPLC)具有操作簡便，檢測快速、檢測準確等優(yōu)點，在清火梔麥滴丸中脫水穿心蓮內(nèi)酯、梔子苷的含量測定中，值得推廣使用。

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Content determination of dehydrated andrographolide and geniposide in QingHuoZhiMai pills by HPLC.

YANG Qi-bo1,QIU Qin2,ZHEN Han-shen2,WU Xue-jiao2.1.Department of Pharmacy,the Eighth People's Hospital of Nanning, Nanning 530003,Guangxi,CHINA;2.Guangxi University of Chinese Medicine,Nanning 530001,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo discuss the content of dehydrated andrographolide,geniposide in QingHuoZhiMai dripping pills by high performance liquid chromatography(HPLC).MethodsThe content of dehydrated andrographolide,geniposide was determined by HPLC,with C18 elite(4.6 mm×200 mm,5 m)as chromatographic column,methanol-water(55:45)as the mobile phase and 250 nm as the detection wavelength for dehydrated andrographolide,acetonitrile-water(13:87)as the mobile phase and 238 nm as the detection wavelength for geniposide.ResultsDehydrated andrographolide in QingHuoZhiMai dripping pill has a good linear relationship in the range of 0.20～1.26 μg(r=0.999 9), and the average recovery rate was 98.14%.Geniposide in QingHuoZhiMai dripping pill has a good linear relationship in the range of 1.59～6.46 μg(r=0.999 9),and the average recovery rate was 97.36%.ConclusionHPLC presents a fast, simple,and accurate way for detecting the content of dehydrated andrographolide,geniposide in QingHuoZhiMai dripping pills,which is worthy of clinical application.

High performance liquid chromatography(HPLC);QingHuoZhiMai dripping pills;Dehydrated andrographolide;Geniposide;Content;Determination

R917

A

1003—6350（2016）05—0756—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.024

2015-08-26)

楊其波。E-mail：8zhen@163.com