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    胃腸道間質瘤臨床病理及c-KIT基因檢測

    2016-03-06 07:03:24司海鵬許紅英李惠陳劼王劍蓉
    海南醫(yī)學 2016年5期
    關鍵詞:梭形密碼子外顯子

    司海鵬,許紅英,李惠,陳劼,王劍蓉

    (南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病理科,江蘇 南京 210029)

    胃腸道間質瘤臨床病理及c-KIT基因檢測

    司海鵬,許紅英,李惠,陳劼,王劍蓉

    (南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院病理科,江蘇 南京 210029)

    目的 探討胃腸道間質瘤(Gastrointestinal stromal tumors,GIST)的臨床病理、免疫組織化學和c-KIT基因突變情況。方法收集我院2010年4月至2012年12月收治的26例經手術切除病理確診的GIST患者,對26例病例采用免疫組織化學行c-KIT蛋白(CD117)、CD34、平滑肌肌動蛋白(SMA)、人S100蛋白(S-100)檢測,以確診為GIST。采用直接測序方法對c-KIT基因11、9、13、17號的外顯子突變進行序列分析。結果26例病例中CD117陽性為22例,共14例(53.8%)檢測到c-KIT突變,第11外顯子是KIT基因最常見的突變位點,檢測到的突變形式主要有缺失突變,點突變和插人突變,均為雜合性突變。結論CD117陽性及c-KIT突變是GIST的普遍現(xiàn)象,突變位點有集中趨勢,以梭形細胞型突變最常見。

    胃腸道間質瘤;病理;c-KIT基因;檢測

    胃腸道間質瘤(Gastrointestinal stromal tumors,GIST)是梭形和或上皮樣細胞組成的的間葉性腫瘤,起源于腸道的起搏細胞、消化道Cajal細胞[1](Intestinal cell of Cajal,ICC)。近年來,隨著對腫瘤疾病機制的分子研究發(fā)現(xiàn)[2],92%~95%的GIST患者CD117 (KIT蛋白)染色陽性,而KIT基因突變會導致酪氨酸激酶持續(xù)激活,被認為與超過90%的惡性GIST發(fā)生發(fā)展相關。而作為一種KIT酪氨酸激酶抑制劑的伊馬替尼(Imatinib mesylate STI-571),又名格列衛(wèi)(Gleevec),已越來越多的應用于轉移性和難于手術切除的病例。在我國,GIST的病例已積累很多,但相關的基因檢測研究還較少,此次我們檢測了我科26例GIST的免疫組化和基因突變情況,并進行總結,以加深GIST分子病理學特點并為患者生物靶向治療提供一定依據。

    1 資料與方法

    1.1 標本及分級 收集我院2010年4月至2012年12月收治的26例GIST患者,經手術切除病理確診。根據Fletcher等[3]推薦標準(依腫瘤直徑、核分裂像將GIST生物學行為)分為4級:腫瘤直徑<2 cm且核分裂像<5/50 HPF為極低度侵襲危險性;直徑2~5 cm且核分裂像<5/50 HPF為低度侵襲危險性;直徑5~10 cm且核分裂像<5/50 HPF或者腫瘤直徑<5 cm但核分裂像6~10/50 HPF為中度侵襲危險性;直徑>5 cm且核分裂像>5/50 HPF或者腫瘤直徑>10 cm或當核分裂像>10/ 50 HPF均為高度侵襲危險性。

    1.2 免疫組化 按常規(guī)組織脫水、包埋方法,將石蠟組織制成4 μm連續(xù)切片,采用Envision兩步法行免疫組化標記,一抗為CD117、CD34、SMA、S-100(均購自Dako公司)。染為棕黃色為陽性,CD117陽性細胞為胞膜著色;S-100陽性細胞定位于胞核和胞質;CD34、SMA為胞質染色,所有病例均經2位病理醫(yī)生一起復查。

    1.3 基因序列和引物 跟據美國國立醫(yī)學圖書館提供的序列,并用Oligo軟件設計PCR引物。c-KIT基因9號外顯子上游:5′-AGTATGCCACATCCCAAGT GT-3′;下游:5′-TGGTAGACAGAGCCTAAACAT-3′。11號外顯子上游:5′-TGATTGGTTTCGTAATCGTAG-3′;下游:5′-AACAAAACAAAGGAAGCCACT-3′。17號外顯子上游:5′-AACATCATT CAAGGCGTACTT-3′;下游:5′-AAATCCTTTGCAGGACTGTCA-3′。

    1.4 基因測序方法 按照Omega公司試劑盒說明書步驟,先提取出腫瘤組織DNA,凝膠電泳系統(tǒng)檢測DNA含量,大于20 ng/μl納入檢測;PCR擴增,體系內包括2 μl的10×PCR Buffer,0.2 μl的HotStar Taq DNA Polymerase(QIAGEN公司),4 μl的5×Q-Solution,2 μl的dNTP,上下游引物各1μl,1 μl模板DNA,8.8 μl的去離子水;PCR產物純化;測序反應和純化,包含1 μl BigDye,1.5 μl BigDye Seq Buffer,3 μl引物,1 μl PCR純化產物,3.5 μl ddH2O經過25個熱循環(huán)后測序反應后純化;先選擇正確的分析模塊,采用3100-Avant分析儀進行基因測序,并進行數據處理和分析。若發(fā)現(xiàn)病例出現(xiàn)缺失或突變的病例,都要進行反向測序進行驗證。用DNA5.1測序分析軟件獲取電泳圖和序列,并與基因庫里的標準序列比對,觀察樣本序列。

    1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件完成數據分析,率的比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    圖1 腫瘤細胞CD117陽性(×400)

    2 結 果

    2.1 患者臨床資料 26例GIST患者中男性10例,女性16例,年齡31~78歲,平均56.54歲。主要癥狀為腹脹、腹痛、腹部包塊、便血。腫瘤原發(fā)部位:食道2例,胃15例,腸8例,盆腔1例,其中1例十二指腸GIST肝轉移。

    2.2 腫瘤特點 依據鏡下組織學形態(tài),將26例GIST分為梭形細胞型20例,上皮樣細胞型2例,兩者混合型4例。腫瘤直徑<2 cm者8例,直徑2~5 cm者7例,直徑5~10 cm者4例,直徑>10 cm者7例。26例GIST的侵襲危險性屬于極低度的有7例、低度的有6例、中度的有4例、高度的有9例。

    2.3 免疫組化結果 26例病例中CD117陽性為22例,CD34陽性為20例,證實為胃腸道間質瘤,SMA及S-100均為陰性或者局灶陽性,排除平滑肌瘤和神經鞘瘤,見圖1。

    2.4 c-KIT基因突變分析 26例GIST中共14例(53.8%)檢測到c-KIT突變,發(fā)現(xiàn)外顯子11突變的有13例,占全部病例的50%以及KIT突變病例的92.9%;外顯子9發(fā)生突變的有1例,占全部病例的3.8%以及KIT突變病例的7.1%;此次未檢出外顯子17的突變。免疫組化CDI17陽性的病例中有14例檢測到KIT突變,有8例未發(fā)生突變;而4例CD117陰性GIST中未能檢測到c-KIT外顯子突變。第11外顯子是KIT基因最常見的突變位點(圖2),檢測到的突變形式主要有缺失突變,點突變和插人突變,均為雜合性突變。缺失突變是外顯子11最常見的突變類型,共檢測出7例(占53.8%),為幾個至幾十個堿基的缺失;其次為點突變4例(占30.8%,其中3例T/A雜合,1例T/C雜合突變)和插人突變1例(7.7%),為第11外顯子583位密碼子第二堿基后插入30個堿基(-AACACAACTTCCTTATGATCACAAATGGGA-);還有1例第11外顯子呈錯義雜合突變,為V569R,并自570密碼子開始缺失24個堿基序列(-TACATAGACCAACACAACTTCCT-),產生截短蛋白。共有8例(61.5%)突變發(fā)生在5端的“熱點”區(qū)域,即第550~560密碼子附近,共檢測出2例發(fā)現(xiàn)第557和558密碼子的缺失,占KIT外顯子突變的14.3%。第9外顯子突變僅見于1例樣本,為第9外顯子GCCTAT6個堿基插入突變。

    圖2 c-KIT第11外顯子突變

    2.5 基因突變與臨床病理聯(lián)系 本研究中腫瘤原發(fā)于食道2例,胃15例,腸8例,盆腔1例,其c-KIT突變例數分別為0、9、5、0例。在梭形細胞型,上皮樣細胞型和兩者混合型GIST中的突變率分別為85.7%(12/20)、50%(1/2)、25%(1/4),組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而在極低、低、中至高度侵襲危險性腫瘤組織的突變率分別為28.6%(2/7)、50% (3/6)、75%(3/4)及66.7%(6/9),不同侵襲危險性之間比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.06,P>0.05)。第9外顯子突變的患者為男性,發(fā)生于小腸腸壁內及漿膜外生物學行為屬高危險度。

    3 討 論

    胃腸道間質瘤(GIST)是最常見的胃腸道間葉組織來源腫瘤,由梭形和或上皮樣細胞組成,現(xiàn)認為起源于腸道的起搏細胞、消化道Cajal細胞(ICC)。據文獻報道,GIST發(fā)生部位:60%~70%在胃,25%在小腸,10%在結直腸,其他膽囊、闌尾、網膜等處偶可發(fā)生[4-5]。本組資料中以胃最多見,其次是腸道,與文獻報道基本一致。腫瘤小者可只位于胃壁內,表面光滑,大者可從胃壁向漿膜外生長。切面灰白、灰紅色,質地中等,可伴有出血、壞死、囊性變。在我們觀察的26例GIST中,發(fā)現(xiàn)梭形細胞型20例:瘤細胞呈長梭形,核呈梭形或桿狀,可見核端空泡,胞漿嗜堿或嗜酸,瘤細胞呈編織狀排列,部分呈柵欄狀。上皮樣細胞型2例:瘤細胞呈圓型或卵圓型,胞漿較豐富,部分呈印戒細胞樣,可見瘤巨細胞,呈巢團或菊形團狀排列。兩者混合型有4例:兼有上述兩種細胞特征。觀察中發(fā)現(xiàn)GIST病例中,部分細胞排列呈器官,間質有粘液樣基質,有的瘤細胞核大、深染、異型明顯,易見核分裂,伴有明顯的出血、壞死,符合肉瘤樣細胞特征[6]。

    1998年Hirota等[7]首次發(fā)現(xiàn)GIST中存在KIT基因功能突變及蛋白產物的表達,定位于人染色體4q12,是一種原癌基因,其蛋白產物CD117為酪氨酸激酶受體,為編碼相對分子質量145 000的跨膜糖蛋白,由4部分結構域組成(膜外區(qū)、跨膜區(qū)、近膜區(qū)和酪氨酸激酶),表達于人體的肥大細胞、造血干細胞、生殖細胞等。在正常情況下,KIT受體在配體SCF的激活下使底物蛋白磷酸化[8],觸發(fā)下游蛋白分子級聯(lián)反應,從而參與細胞重要生理活動的調控如增殖、凋亡等。而KIT基因突變使KIT受體在無配體結合的情況下仍能持續(xù)激活,從而導致腫瘤的發(fā)生。

    根據Fletcher推薦侵襲危險性分級標準,我們此次研究的26例GIST中屬于極低度危險的有7例、低度的有6例、中度的有4例、高度的有9例。根據免疫組化結果分析,26例病例中CD117陽性為22例,CD34陽性為20例。在CD117陽性的病例中有14例檢測到KIT突變,有8例未發(fā)生突變;4例CD117陰性GIST中也未能檢測到c-KIT外顯子突變??赡苡捎跇颖玖枯^少,未檢測到基因突變,今后研究中還需要增加樣本量來驗證。在梭形細胞型,上皮樣細胞型和兩者混合型GIST中的突變率分別為85.7%(12/20)、50%(1/2)、25% (1/4),組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);而在極低、低、中至高度侵襲危險性腫瘤組織的突變率分別為28.6%(2/7)、50%(3/6)、75%(3/4)及66.7%(6/9),不同侵襲危險性之間比較差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.06,P>0.05),與研究結果相同[9]。提示c-KIT突變可能是GIST的普遍現(xiàn)象,其有無與腫瘤侵襲危險性無明顯相關。

    文獻報道GIST患者KIT基因突變較高,突變率為40%~90%[10],最易于發(fā)生突變的四個區(qū)域,即外顯子9、11、13和17。而大多數(約65%)KIT基因突變在近膜域(外顯子11),其次(約9%)在膜外域(外顯子9),最常發(fā)生于外顯子11第550~560密碼子和第570~580密碼子的“熱點區(qū)域”[11]。而外顯子13和外顯子17突變較罕見(1%~2%)。本研究在26例GIST中共檢測到14例(53.8%)c-KIT突變,發(fā)現(xiàn)外顯子11突變的有13例,占全部病例的50%以及KIT突變病例的92.9%;外顯子9發(fā)生突變的有1例,占全部病例的3.8%以及KIT突變病例的7.1%;此次未檢出外顯子17的突變。我們檢測的第11外顯子的突變形式主要有缺失突變,點突變和插人突變,均為雜合性突變。缺失突變是外顯子11最常見的突變類型,共檢測出7例(占53.8%),為幾個至幾十個堿基的缺失;其次為點突變4例(占30.8%,其中3例T/A雜合,1例T/C雜合突變)和插人突變1例(7.7%),為第11外顯子583位密碼子第二堿基后插入30個堿基(-AACACAACTTCCTTATGATCACAAATGGGA-);還有1例第11外顯子呈錯義雜合突變,為V569R,并自570密碼子開始缺失24個堿基序列(-TACATAGACCAACACAACTTCCT-),產生截短蛋白,提示用基因靶向藥物格列衛(wèi)治療可有較好療效。外顯子11突變最常見的是刪除一個或多個密碼子,其中有些(密碼子557-558)會引起不良臨床后果,而錯義點的突變預后較好[12]。Vadakara等[13]研究100多例GIST患者,發(fā)現(xiàn)86%的患者有c-KIT基因第11號外顯子突變,缺失突變會有更差的預后,而點突變比缺失突變更能提示良好的預后,所以可作為獨立的預后因素。類似的近期研究[14]得出與其一致的結果。外顯子9的突變比較少見[4],常見的形式是第502和503密碼子的GCCTAT6個核昔酸串聯(lián)重復插人,研究顯示多發(fā)生在小腸GIST,侵襲性通常較高。本實驗僅發(fā)現(xiàn)1例9號外顯子突變?yōu)檫@種形式,患者男性,發(fā)生于小腸腸壁內及漿膜外生物學行為屬高危險度。

    這些研究結果對提高GIST診斷的準確性以及靶向治療有一定的啟示。隨著靶向藥物越來越多的應用,可提高晚期GIST患者的中位生存時間,也可作為GIST患者預后判斷的有效指標之一,所以從基因水平上研究疾病診斷、預后、治療將有待更多研究證實。

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    Clinicpathological features and c-KIT gene detection of gastrointestinal stromal tumor.

    SI Hai-peng,XU Hong-ying,LI Hui,CHEN Jie,WANG Jian-rong.Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210029,Jiangsu,CHINA

    ObjectiveTo explore the clinicopathological,immunohistochemical features and c-KIT gene mutations of gastrointestinal stromal tumors(GIST).MethodsTwenty-six patients of GIST confirmed pathologically in our hospital from Apr.2010 to Dec.2012 were detected for CD117,CD34,smooth muscle actin(SMA)and S-100 with immunohistochemistry to confirm the diagnosis.Direct sequencing technique was used to identify the mutation of c-KIT (exon 9,11,13,17).ResultsAmong the 26 patients,there were 22 patients with CD117 positive and 14 patients(53.8%) with mutations of c-KIT.Mutations of c-KIT exon 11 were mostly detected,mainly deletion,point mutation and insertion.ConclusionCD117 positivity and c-KIT mutation are common in GIST,and they are mostly detected in spindle-cell GISTs.

    Gastrointestinal stromal tumor;Pathology;c-KIT gene;Detection

    R735

    A

    1003—6350(2016)05—0706—04

    10.3969/j.issn.1003-6350.2016.05.006

    2015-07-31)

    司海鵬。E-mail:mtshp@sina.com

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