泛素-蛋白酶體通路在男性生殖領(lǐng)域的研究進(jìn)展

趙昍朋(綜述)，張　媛，肖　瑞(審校)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

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·綜述·

泛素-蛋白酶體通路在男性生殖領(lǐng)域的研究進(jìn)展

趙昍朋(綜述)，張媛，肖瑞*(審校)

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，內(nèi)蒙古自治區(qū)分子病理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059)

[關(guān)鍵詞]生殖；泛素；精子發(fā)生；綜述文獻(xiàn)

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.07.032

泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin proteasome pathway，UPP)介導(dǎo)的蛋白降解是機(jī)體內(nèi)一個(gè)主要的調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白水平的過程。泛素化是指泛素在一些特殊的酶(泛素激活酶、泛素結(jié)合酶、泛素連接酶等)作用下，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白進(jìn)行靶向分類及特異性修飾的過程[1]。而蛋白酶體系統(tǒng)可以識別已泛素化的蛋白并加以降解。因此，UPP在調(diào)節(jié)體內(nèi)蛋白的定位和功能等方面都起著十分重要的作用。男性精子的生成是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程，據(jù)調(diào)查UPP在生精細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器的降解中發(fā)揮著重要作用[2]?，F(xiàn)將UPP在男性生殖系統(tǒng)研究領(lǐng)域的相關(guān)進(jìn)展以及UPP異常對男性不育的影響綜述如下。

1　UPP介紹

UPP由泛素、泛素啟動(dòng)酶系統(tǒng)和蛋白酶體系統(tǒng)組成[3]。

1.1泛素泛素是細(xì)胞核和細(xì)胞漿中的高度保守的小分子蛋白，它廣泛存在于真核生物的細(xì)胞表面[4]，是由76種氨基酸組成的低分子量熱穩(wěn)定蛋白，相對分子質(zhì)量大約為8 500 000。在泛素酶的催化下，泛素的C-末端甘氨酸與靶蛋白的賴氨酸側(cè)鏈相連, 而后其他泛素分子以甘氨酸殘基連接到先前結(jié)合的泛素分子的賴氨酸側(cè)鏈上而形成多泛素化鏈[5]。泛素也可以標(biāo)記跨膜蛋白，參與蛋白質(zhì)的膜泡運(yùn)輸。非典型泛素鏈在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、內(nèi)吞，以及DNA損傷修復(fù)、調(diào)控哺乳動(dòng)物的轉(zhuǎn)錄因子通路中起著重要作用。

1.2泛素啟動(dòng)酶系統(tǒng)蛋白質(zhì)的泛素化是一個(gè)或多個(gè)泛素分子的底物蛋白的共價(jià)連接，這一系列活動(dòng)共包括3種泛素啟動(dòng)酶，即泛素激活酶(ubiquitin activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(ubiquitin protein ligase，E3)[6]。E1將泛素分子激活后，泛素途徑得以啟動(dòng)，泛素再通過硫酯鍵轉(zhuǎn)移到E2，而E3又與E2相互作用，將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白的殘基上[7]。具體為一個(gè)泛素分子在基底膜上連結(jié)賴氨酸殘基，剩下的泛素分子則通過賴氨酸殘基形成串聯(lián)而完成一次單泛素化，這一過程共連結(jié)了7個(gè)賴氨酸殘基(Lys 6、Lys 11、 Lys 27、 Lys 29、Lys 33、Lys 48和 Lys 63)，從而形成泛素鏈[8]。然而，一種泛素鏈也可以有不同的結(jié)果，如Lys 11-泛素鏈可以通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或蛋白酶體促進(jìn)靶蛋白的降解[9]。這一過程不斷反復(fù)，靶蛋白即被綁上一批泛素分子，被泛素標(biāo)記的靶蛋白再在蛋白酶體中進(jìn)行降解。

1.3蛋白酶體系統(tǒng)從結(jié)構(gòu)上看，蛋白酶體是一個(gè)桶狀的復(fù)合物[10]，其普遍存在于真核生物細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中，是細(xì)胞用來調(diào)控蛋白質(zhì)濃度和去除錯(cuò)誤折疊蛋白的主要機(jī)制。較為常見的為26 S蛋白酶體，包含一個(gè)19 S的調(diào)節(jié)亞基和一個(gè)20 S的調(diào)節(jié)亞基。前者的亞基可以識別展開的泛素鏈，而后者能夠降解肽鏈或未折疊底物[11]。

1.4去泛素化酶去泛素化是反向的泛素化過程,這一過程依賴于去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)，DUBs可以拆解泛素鏈與蛋白底物，具體作用如下：①處理泛素前體；②回收泛素化過程中的泛素；③編輯泛素鏈；④泛素結(jié)合的逆轉(zhuǎn)[7]。因此,去泛素化過程在蛋白酶體調(diào)控過程中起到了關(guān)鍵性的作用。雖然目前去泛素化的生理作用尚不清楚，但DUBs在參與細(xì)胞的生理功能方面，如細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞的周期、蛋白降解、基因表達(dá)、染色體分離和脫氧核糖核酸的修復(fù)方面起到了十分重要的作用[12-13]。

近年來隨著對UPP研究的深入，逐步發(fā)現(xiàn)UPP在變構(gòu)蛋白的降解、原癌基因產(chǎn)物的降解[14]、轉(zhuǎn)錄因子的降解及細(xì)胞胞質(zhì)分裂中均起著重要的作用。

2　UPP與精子發(fā)生

精子的產(chǎn)生是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程。從精原細(xì)胞的分化到精子的成熟，其間包括有絲分裂、減數(shù)分裂以及精子形成都在生精小管中進(jìn)行[15]。UPP參與精子發(fā)生的不同階段，即精原細(xì)胞的有絲分裂、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂及精子形成。表明UPP在整個(gè)精子的形成過程中發(fā)揮著重要作用[16]。

2.1線粒體泛素化與精子發(fā)生在精子形成過程中，泛素化是必不可少的途徑，尤其是哺乳動(dòng)物線粒體的泛素化，決定著男性精子的命運(yùn)。精子中約有200～3 000個(gè)線粒體，而精子的正常功能的運(yùn)轉(zhuǎn)離不開線粒體，線粒體幾乎供應(yīng)著生物體細(xì)胞中所有的能量。盡管具體機(jī)制尚不清楚，但泛素化過程的異常導(dǎo)致線粒體的退化從而最終影響精子的健康是毋庸置疑的。

在精子的發(fā)生過程中，線粒體供應(yīng)絕大多數(shù)細(xì)胞生理過程中所需的能量，如減數(shù)分裂、精子細(xì)胞分化、精子存活以及精子獲能。在精子形成過程中，線粒體逐漸變小、變長并在尾部聚集，盤旋環(huán)繞中間軸而形成線粒體鞘，為尾部旋轉(zhuǎn)提供能量。在線粒體的形成變化過程，UPP的缺陷會影響線粒體功能，如泛素結(jié)合酶ubc4和ubc5的消耗將最終影響線粒體的供能[17]，而在精子的發(fā)生過程中E3的缺乏將影響線粒體的供能[18]。因此，線粒體的泛素化對哺乳動(dòng)物來說是精子形成過程中的一個(gè)必不可少的步驟。在生殖細(xì)胞中線粒體和泛素酶通過一些特殊的線粒體蛋白相關(guān)聯(lián)，即UPP參與精子發(fā)生中線粒體的降解。在有關(guān)小鼠受精卵的研究中發(fā)現(xiàn)，精子在與卵細(xì)胞結(jié)合時(shí)，精子中已被泛素化的線粒體被卵細(xì)胞的UPP所降解[19]。表明精子中的線粒體被泛素標(biāo)記后同種之間才能進(jìn)行受精。而相反，在野牛雜交研究中發(fā)現(xiàn)，在異種之間的精子中被泛素標(biāo)記的線粒體則不能識別卵細(xì)胞中的蛋白酶體，即不能受孕。以上研究均表明線粒體泛素化在生精以及受精過程中有著重要作用。

然而在精子發(fā)生過程中線粒體泛素化的具體機(jī)制仍不清楚，如損失泛素化的底物是否會造成精子發(fā)生過程中線粒體的退化，從而導(dǎo)致不健康的精子，以上等問題都亟待解決。

2.2UPP酶與精子發(fā)生UPP離不開E1、E2、E3和蛋白酶體[20]。其中最為常見的是E3[21]，但每一個(gè)成分都是UPP過程所不可缺少的。

在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，E1在睪丸中有特異性表達(dá)。其在精原細(xì)胞中的表達(dá)水平要明顯高于在精母細(xì)胞和支持細(xì)胞中的表達(dá)水平。這表明E1可能影響了小鼠的精子發(fā)生。E2是一個(gè)龐大的家族，據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，大量的E2都參與了精子的發(fā)生過程[22]。如ubc4-1 mRNA幾乎在所有的生精階段中表達(dá)，而ubc4-2 mRNA主要表現(xiàn)在圓形和長形精子細(xì)胞，ubc9可以在精子發(fā)生過程中的減數(shù)分裂中起調(diào)節(jié)作用[23]。E3中的一個(gè)代表RNF，在睪丸中特異性表達(dá)，其中RNF19A參與了精子尾部的形成，并且與Psmc(26 S蛋白酶體的一部分)共同參與了精子頭部形成過程中的泛素化。也有報(bào)道表明RNF151在睪丸中高度表達(dá)并且有調(diào)控精子發(fā)生的作用。以上均說明E3在某些特定的底物泛素化過程中對雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的重要性[24]。

目前，有關(guān)蛋白酶體方面的研究范圍已十分廣泛，通常，蛋白酶體活力的下降也將導(dǎo)致精子發(fā)生的缺陷。一些蛋白酶體激活劑的缺乏也會導(dǎo)致產(chǎn)生畸形的精子。而精子細(xì)胞中的一些特殊蛋白結(jié)構(gòu)也參與泛素化，從而有助于促進(jìn)精子的成熟。

2.3泛素與精子發(fā)生精子的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而有序的細(xì)胞分裂與分化的過程，二倍體精原細(xì)胞發(fā)展成為一個(gè)單倍體雄性配體進(jìn)而成為精子， 在人類中整個(gè)過程需耗費(fèi)74 d[25]。泛素是男性精液的重要組分，有調(diào)查顯示在男性不育患者體內(nèi)泛素的含量明顯增加，而伴隨著精液中泛素含量的增加，精子的形態(tài)、數(shù)量和活動(dòng)能力均有所下降。表明泛素可以作為衡量精子質(zhì)量的一項(xiàng)指標(biāo)。

2.4附睪中精子的泛素化精子發(fā)生的過程十分繁復(fù)，過程中難免會產(chǎn)生異常的精子。這些異常的精子伴隨正常的精子將一起在附睪中進(jìn)行處理。而這些畸形的精子如何被淘汰這一過程也是十分重要的。人們在小鼠的附睪腔中進(jìn)行泛素化免疫反應(yīng)檢測發(fā)現(xiàn)，一些蛋白的泛素化發(fā)生在附睪?；蔚木訒环核鼗缓笤诟讲G中被蛋白酶體所降解、消除。這表明UPP是精子在附睪中成熟及高質(zhì)量的保證。可是，至今仍有許多問題仍不明朗，如究竟是什么E3結(jié)合在附睪中的精子表面。

3　UPP與睪丸癌

睪丸癌占男性腫瘤的1%～1.5%，其組織學(xué)類型多為精原細(xì)胞瘤。眾所周知，癌癥的惡化與細(xì)胞周期的異常及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在精子發(fā)生過程中，如同前面所介紹的，包括有絲分裂和減數(shù)分裂均離不開UPP，如果有絲分裂和減數(shù)分裂發(fā)生異常，將使細(xì)胞周期發(fā)生改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞過度分化，最終產(chǎn)生睪丸癌。

在精子發(fā)生過程中，細(xì)胞凋亡對高質(zhì)量的精子的產(chǎn)生有著重要的影響，而p53是細(xì)胞凋亡中的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。p53是人體的一個(gè)抑癌基因，是一種相對分子質(zhì)量為53 000的蛋白質(zhì)，p53的失活對睪丸癌的形成有著重要影響。MDM2是E3連接酶的一種，與p53泛素化并最終通過蛋白酶體降解它。而E3的失衡將會導(dǎo)致p53的過度降解，從而影響細(xì)胞凋亡，最后導(dǎo)致癌癥。因此，UPP在今后用于診斷及治療睪丸癌方面都將會成為學(xué)者所關(guān)注的熱點(diǎn)。

4　結(jié)　　語

全世界的已婚不孕不育夫婦中，50%與男性因素有關(guān)。男性不育是一個(gè)復(fù)雜的且受多因素影響的過程。近年來隨著細(xì)胞生物學(xué)和遺傳生物學(xué)領(lǐng)域研究的不斷深入，在男性不育方面也取得了新的進(jìn)展，但仍有很多機(jī)制尚不明確。E3將泛素結(jié)合到靶蛋白的細(xì)胞表面或細(xì)胞器上，再由蛋白酶體進(jìn)行降解并間接地處理多余的細(xì)胞質(zhì)。在這一過程中，如果UPP的某個(gè)成分產(chǎn)生了異常，則不能產(chǎn)生功能性的精子。這些異常的精子再在附睪中成熟，則會使精子的質(zhì)量降低從而導(dǎo)致不育。相反，如果掌握了UPP在精子發(fā)生中的機(jī)制，則可以避免這一問題，從而控制精子產(chǎn)生的質(zhì)量。此外，腫瘤的發(fā)生也受著泛素化的影響，蛋白酶體的應(yīng)用將為腫瘤的治療提供突破性的進(jìn)展，這也為研究睪丸癌提供了方向。對泛素在這些途徑中作用的研究, 將有助于對機(jī)體相關(guān)的生理機(jī)制和疾病的認(rèn)識, 也將有助于新的治療方法和新的靶向藥物的發(fā)現(xiàn)。

總之，UPP與精子在睪丸內(nèi)的分化成熟以及其他生殖領(lǐng)域，包括卵子發(fā)生、受精、胚胎發(fā)育等方面發(fā)揮著重要作用。此外，泛素在附睪精子的線粒體的質(zhì)量控制與調(diào)節(jié)方面也很重要，UPP的研究也應(yīng)用于不孕不育、避孕、動(dòng)物基因改良、克隆研究等領(lǐng)域。而隨著研究的進(jìn)展，相信UPP將為人類的生殖健康和疾病研究等帶來福音。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Chowdhury M,Enenkel C. Intracellular dynamics of the ubiquitin-proteasome-system[J]. F1000Res,2015,4:367.

[2]Bose R,Manku G,Culty M,et al. Ubiquitin-proteasome system in spermatogenesis[J]. Adv Exp Med Biol,2014,759:181-213.

[3]Buckley DL,Crews CM. Small-molecule control of intracellular protein levels through modulation of the ubiquitin proteasome system[J]. Angew Chem Int Ed Engl,2014,53(9):2312-2330.

[4]Song WH,Ballard JW,Yi YJ,et al. Regulation of mitochondrial genome inheritance by autophagy and ubiquitin-proteasome system: implications for health, fitness, and fertility[J]. Biomed Res Int,2014,2014:981867.

[5]Scott D,Oldham NJ,Strachan J,et al. Ubiquitin-binding domains: mechanisms of ubiquitin recognition and use as tools to investigate ubiquitin-modified proteomes[J]. Proteomics,2015,15(5/6):844-861.

[6]Walczak H,Iwai K,Dikic I. Generation and physiological roles of linear ubiquitin chains[J]. BMC Biol,2012,10:23.

[7]Hanpude P,Bhattacharya S,Dey AK,et al. Deubiquitinating enzymes in cellular signaling and disease regulation[J]. IUBMB Life,2015,67(7):544-555.

[8]Hospenthal MK, Mevissen TE, Komander D. Deubiquitinase-based analysis of ubiquitin chain architecture using Ubiquitin Chain Restriction (UbiCRest)[J].Nat Protoc,2015,10(2):349-361.

[9]Kulathu Y, Komander D.Atypical ubiquitylation-the unexplored world of polyubiquitin beyond Lys48 and Lys63 linkages[J]. Nat Rev Mol Cell Biol,2012,13(8):508-523.

[10]Kish-Trier E,Hill CP. Structural biology of the proteasome[J]. Annu Rev Biophys,2013,42:29-49.

[11]Sako K,Yanagawa Y,Kanai T,et al. Proteomic analysis of the 26S proteasome reveals its direct interaction with transit peptides of plastid protein precursors for their degradation[J]. J Proteome Res,2014,13(7):3223-3230.

[12]Ramakrishna S,Kim KS,Baek KH. Posttranslational modifications of defined embryonic reprogramming transcription factors[J].Cell Reprogramm,2014,16(2):108-120.

[13]Ramakrishna S,Suresh B,Baek KH. Biological functions of hyaluronan and cytokine-inducible deubiquitinating enzymes[J]. Biochim Biophys Acta,2015,1855(1):83-91.

[14]Thirunavukarasou A,Singh P,Govindarajalu G,et al. E3 ubiquitin ligase Cullin4B mediated polyubiquitination of p53 for its degradation[J]. Mol Cell Biochem,2014,390(1/2):93-100.

[15]Xiao X,Mruk DD,Wong CK,et al. Germ cell transport across the seminiferous epithelium during spermatogenesis[J]. Physiology(Bethesda),2014,29(4):286-298.

[16]Hou CC,Yang WX. New insights to the ubiquitin-proteasome pathway(UPP) mechanism during spermatogenesis[J]. Mol Biol Rep,2013,40(4):3213-3230.

[17]Manku G,Wing SS,Culty M. Expression of the ubiquitin proteasome system in neonatal rat gonocytes and spermatogonia: role in gonocyte differentiation[J]. Biol Reprod,2012,87(2):44.

[18]Nagashima S,Tokuyama T,Yonashiro R,et al. Roles of mitochondrial ubiquitin ligase MITOL/MARCH5 in mitochondrial dynamics and diseases[J]. J Biochem,2014,155(5):273-279.

[19]Li L,Gao G,Shankar J,et al. p38 MAP kinase-dependent phosphorylation of the Gp78 E3 ubiquitin ligase controls ER-mitochondria association and mitochondria motility[J]. Mol Biol Cell,2015,26(21):3828-3840.

[20]Nakajima T,Kitagawa K,Ohhata T,et al. Regulation of GATA-binding protein 2 levels via ubiquitin-dependent degradation by Fbw7:involvement of cyclin B-cyclin-dependent kinase 1-mediated phosphorylation of THR176 in GATA-binding protein 2[J]. J Biol Chem,2015,290(16):10368-10381.

[21]Vittal V,Stewart MD,Brzovic PS,et al. Regulating the Regulators:Recent Revelations in the Control of E3 Ubiquitin Ligases[J]. J Biol Chem,2015,290(35):21244-21251.

[22]Koenig PA,Nicholls PK,Schmidt FI,et al. The E2 ubiquitin-conjugating enzyme UBE2J1 is required for spermiogenesis in mice[J]. J Biol Chem,2014,289(50):34490-34502.

[23]Yuan YF,Zhai R,Liu XM,et al. SUMO-1 plays crucial roles for spindle organization,chromosome congression,and chromosome segregation during mouse oocyte meiotic maturation[J]. Mol Reprod Dev,2014,81(8):712-724.

[24]Bazalitska SV,Romanenko AM,Sakalo VS,et al. Immunohistochemical expression of ubiquitin protein in peritumoral tissue of patients with testicular germ cell tumors[J]. Lik Sprava,2015,(1/2):48-55.

[25]Shen CC,Kang YH,Cui DD,et al. Human testis-expressed sequence 101 is limitedly distributed in germinal epithelium of testis and disappears in seminoma[J]. Biol Res,2014,47:52.

(本文編輯：劉斯靜)

[收稿日期]2016-01-22；[修回日期]2016-02-17

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260260)；內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015MS0372)；內(nèi)蒙古自治區(qū)“草原英才”項(xiàng)目

[作者簡介]趙昍朋(1990-)，女，遼寧沈陽人，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)碩士研究生，從事男性生殖研究。 *通訊作者。E-mail:xiaorui79@hotmail.com

[中圖分類號]R698.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)07-0859-04